RAPD、ISSR分子標(biāo)記聯(lián)合鑒定毛木耳菌株的研究

黃藝寧

(漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000)

毛木耳(AuriculariacorneaEhrenb)屬木耳目(Auriculariales)木耳科(Auriculariaceae)木耳屬(Auricularia)[1-3]，其質(zhì)地脆滑，清新爽口，食藥兼用，素有“樹上海蜇皮”之美稱，是熱帶和亞熱帶地區(qū)主要食用菌之一[4-5]。

長期以來，毛木耳栽培品種以43系列為主，品種比較單一，已滿足不了多元化的市場需求。此外，經(jīng)過多年的使用，栽培品種已出現(xiàn)不同程度的老化退化現(xiàn)象，產(chǎn)量、質(zhì)量均下降，導(dǎo)致毛木耳市場價(jià)格低迷，嚴(yán)重影響耳農(nóng)種植的積極性，制約毛木耳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，選育新品種是毛木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。毛木耳新品種的選育是以現(xiàn)有栽培菌株為基礎(chǔ)的，然而目前毛木耳栽培菌株混雜，不利于雜交育種工作的開展，迫切需要對(duì)引進(jìn)的毛木耳菌株進(jìn)行鑒定分類。傳統(tǒng)的食用菌鑒定方法主要是利用子實(shí)體的形態(tài)特征，需要出菇進(jìn)行鑒定，不僅鑒定周期長，而且容易受到環(huán)境的影響。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用在食用菌種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)方面。秦蓮花等[6]將ITS(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))與ISSR(簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增)技術(shù)結(jié)合，作為香菇生產(chǎn)菌株鑒別的方法。張介馳等[7]采用ISSR鑒別27個(gè)東北地區(qū)黑木耳生產(chǎn)菌株。王守現(xiàn)等[8]采用酯酶同工酶聚類分析的方法，將6個(gè)灰樹花菌株分為三大類，RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性)和ISSR共同驗(yàn)證結(jié)果與酯酶同工酶分析結(jié)果一致。楊軍等[9]采用ISSR和RAPD對(duì)供試的40株灰樹花菌株進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)利用2種分子標(biāo)記比單獨(dú)使用1種分子標(biāo)記鑒定的結(jié)果更準(zhǔn)確，菌株類別劃分更精細(xì)。在毛木耳種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)方面，張丹等[10]利用ISSR標(biāo)記將55個(gè)供試毛木耳菌株分為5大類群，張丹等[11]利用22個(gè)RAPD引物對(duì)56個(gè)不同的木耳菌株進(jìn)行分析鑒定，杜萍等[12]建立和優(yōu)化了野生毛木耳ISSR-PCR的反應(yīng)體系。但結(jié)合ISSR和RAPD對(duì)毛木耳菌株進(jìn)行鑒定和遺傳多樣性分析的研究卻鮮見報(bào)道。鑒于此，采用RAPD、ISSR 2種分子標(biāo)記對(duì)10個(gè)不同來源的毛木耳菌株進(jìn)行鑒定，研究其遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為今后毛木耳雜交育種親本的選配及種質(zhì)資源的有效利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試的10個(gè)毛木耳菌株具體信息見表1。

1.2 生化試劑

Taq酶、dNTPs、10×Buffer緩沖液、Mg2+等均購自TaKaRa公司(大連)；RAPD隨機(jī)引物、ISSR引物為Sangon產(chǎn)品。

表1 供試毛木耳菌株及其來源Tab.1 Tested strains of Auricularia cornea Ehrenb and their sources

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試菌株DNA提取 采用改良的CTAB法[13]提取DNA。

1.3.2 RAPD、ISSR多態(tài)性分析

1.3.2.1 PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系 PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系具體見表2，其中RAPD、ISSR反應(yīng)體系的DNA模板使用量均為10 ng。

表2 PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系Tab.2 PCR reaction system μL

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增條件及電泳 RAPD及ISSR反應(yīng)程序參考文獻(xiàn)[14-15]。RAPD-PCR反應(yīng)程序:起始94 ℃預(yù)變性7 min，94 ℃變性1 min，34 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)數(shù)35個(gè)，最后延伸72 ℃10 min。ISSR-PCR反應(yīng)程序:起始94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，44～52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min， 循環(huán)數(shù)35個(gè)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：取擴(kuò)增產(chǎn)物7 μL，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳(含0.5 μg/mL GoldViewTM DNA 染料)，160 V恒壓1.5 h，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并照像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)DNA條帶，構(gòu)建“0-1”矩陣表，輸入Excel軟件，利用公式計(jì)算多態(tài)性比率(P)[16]，P=k/n×100%，式中：k為多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)，n為位點(diǎn)總數(shù)。

利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件，采用Jaccard聚類距離中的類平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，并形成供試菌株的遺傳聚類圖。

1.5 綜合RAPD、ISSR聚類分析

綜合RAPD和ISSR擴(kuò)增條帶的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似系數(shù)計(jì)算和UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛木耳菌株的RAPD分析結(jié)果

2.1.1 多態(tài)性分析結(jié)果 利用3個(gè)RAPD引物對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1—3、表3)。擴(kuò)增條帶大小分布在0.30～2.50 kb。每個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)有差異，為8～11條，每個(gè)引物平均擴(kuò)增9.3條條帶，共獲得28個(gè)擴(kuò)增條帶，多態(tài)性比率為100%。說明這3個(gè)RAPD引物擴(kuò)增毛木耳多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定，供試菌株多態(tài)性豐富。

2.1.2 聚類分析結(jié)果 由圖4可以看出，供試菌株間相異距離為0.25～0.89，遺傳多樣性較豐富。在相異距離為0.60時(shí)，所有供試菌株被分為5個(gè)群體，包括2個(gè)復(fù)合群體和3個(gè)單一群體。菌株781、大光、白背毛木耳、黃背木耳、臺(tái)耳134為一個(gè)群體；43、43-28為另一個(gè)群體；99豐、43-1、川毛10號(hào)為3個(gè)單獨(dú)群體。其中，43、43-28相異距離為0.34，說明這2個(gè)菌株遺傳距離較近。川毛10號(hào)與2個(gè)復(fù)合群體的相異距離為0.80。99豐、43-1與其他菌株相異距離為0.89，說明這2個(gè)菌株與其他菌株的遺傳距離遠(yuǎn)，親緣關(guān)系遠(yuǎn)。在供試菌株中遺傳距離最近的為白背毛木耳、黃背木耳，相異距離為0.25。

圖1 引物S33對(duì)10個(gè)毛木耳菌株擴(kuò)增的RAPD分子標(biāo)記圖譜Fig.1 Amplification RAPD map of primer S33 for 10 tested strains

圖2 引物S1508對(duì)10個(gè)毛木耳菌株擴(kuò)增的RAPD分子標(biāo)記圖譜Fig.2 Amplification RAPD map of primer S1508 for 10 tested strains

圖3 引物S2058對(duì)10個(gè)毛木耳菌株擴(kuò)增的RAPD分子標(biāo)記圖譜Fig.3 Amplification RAPD map of primer S2058 for 10 tested strains

表3 RAPD標(biāo)記所用的PCR引物序列及擴(kuò)增結(jié)果Tab.3 PCR primer sequences and amplification results used in RAPD

2.2 毛木耳菌株的ISSR分析結(jié)果

2.2.1 多態(tài)性分析結(jié)果 利用4個(gè)ISSR引物對(duì)供試菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖5、表4)。擴(kuò)增條帶大小分布在0.25～1.90 kb。每個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)量有差異，為7～9條，平均擴(kuò)增8條條帶。共獲得32條擴(kuò)增條帶，其中，多態(tài)性條帶為30條，多態(tài)性比率為93.75%，每個(gè)引物平均擴(kuò)增7.5條多態(tài)性條帶。說明這4個(gè)ISSR引物擴(kuò)增毛木耳多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定，供試菌株多態(tài)性豐富。

2.2.2 聚類分析結(jié)果 由圖6可以看出，供試菌株間相異距離為0.10～0.85。在相異距離為0.60時(shí)，所有供試菌株被分為4個(gè)群體，包括1個(gè)復(fù)合群體和3個(gè)單一群體。99豐、川毛10號(hào)、43為3個(gè)單獨(dú)群體，其他菌株聚為一類。99豐與其他菌株的相異距離為0.85，說明99豐遺傳距離最遠(yuǎn)。在相異距離為0.15時(shí)，菌株781、黃背木耳、白背毛木耳聚為一類，說明這3個(gè)菌株的遺傳距離較近。

圖4 10個(gè)毛木耳菌株基于RAPD的遺傳聚類結(jié)果Fig.4 Genetic clustering map of 10 test strains based on RAPD

圖5 引物ISSR1(a)、ISSR6(b)、ISSR12(c)、ISSR18(d)對(duì)10個(gè)毛木耳菌株擴(kuò)增的ISSR分子標(biāo)記圖譜Fig.5 Amplification ISSR map of primer ISSR1(a)、ISSR6(b)、ISSR12(c)、 ISSR18(d) for 10 tested strains

表4 ISSR標(biāo)記所用引物序列及擴(kuò)增結(jié)果Tab.4 PCR primer sequences and amplification results used by ISSR

2.3 綜合RAPD、ISSR的聚類分析結(jié)果

由圖7可以看出，供試菌株間相異距離在0.13～0.87，遺傳多樣性較豐富。在相異距離為0.60時(shí)，所有供試菌株被分為5個(gè)群體，包括2個(gè)復(fù)合群體和3個(gè)單一群體。菌株43、43-28為一個(gè)群體，相異距離為0.48，說明這2個(gè)菌株遺傳距離較近。大光、白背毛木耳、781、黃背木耳、臺(tái)耳134這5個(gè)菌株為另一大的群體，相異距離為0.40，遺傳距離較近。川毛10號(hào)、99豐、43-1為3個(gè)單獨(dú)群體。99豐、川毛10號(hào)、43-1與其他菌株的相異距離分別為0.87、0.77、0.70，遺傳距離較遠(yuǎn)。在綜合聚類分析時(shí)，在相異距離為0.87時(shí)，99豐與43-1聚在一起，而利用RAPD單獨(dú)分析時(shí)，在相異距離為0.80時(shí)，99豐與43-1聚為一類。

圖6 10個(gè)毛木耳菌株基于ISSR的遺傳聚類結(jié)果Fig.6 Genetic clustering results of 10 test strains based on ISSR

圖7 供試菌株基于RAPD、ISSR的遺傳聚類結(jié)果Fig.7 Genetic clustering results of test strain based on RAPD and ISSR

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)資源是品種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)[17]。種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究是評(píng)價(jià)種質(zhì)資源的主要手段，可以為種質(zhì)資源的有效、合理利用提供重要的遺傳信息。傳統(tǒng)的食用菌鑒定方法鑒定周期長且容易受到環(huán)境的影響。目前,分子標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食用菌種質(zhì)資源的鑒定評(píng)價(jià)。近幾年來，基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD、ISSR、序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)等被應(yīng)用于食用菌的品種鑒定、親緣關(guān)系和遺傳多樣性、進(jìn)化關(guān)系等方面的研究[18-23]。RAPD分子標(biāo)記技術(shù)原理是對(duì)基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，操作簡單，而且可以檢測整個(gè)基因組，檢測效率高[24]，具有通用性[25]，多態(tài)性好，但存在重復(fù)性差等問題。ISSR是基于SSR發(fā)展的分子標(biāo)記技術(shù)，不同材料的SSR數(shù)目、間隔長短不同，使得特定結(jié)合位點(diǎn)相應(yīng)變化[26]，因此，可以分析不同樣品的多態(tài)性。ISSR更加穩(wěn)定、可靠，試驗(yàn)重復(fù)性好，可以較好地克服RAPD的缺點(diǎn)[27]。由于每種分子標(biāo)記擴(kuò)增的基因組DNA位置不同，利用多種分子標(biāo)記相結(jié)合進(jìn)行遺傳分類、多樣性分析，比單獨(dú)使用一種分子標(biāo)記分析的結(jié)果更準(zhǔn)確[28]。

本研究引進(jìn)湖南、四川、貴州、湖北、江蘇、福建等地的毛木耳菌株。采用RAPD、ISSR 2種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)供試菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，供試菌株多態(tài)性較為豐富，RAPD、ISSR分子標(biāo)記的多態(tài)性比率分別為100%、93.75%。說明RAPD、ISSR可以檢測到供試菌株豐富的遺傳多態(tài)性，能夠?qū)┰嚲赀M(jìn)行有效的區(qū)分。

供試菌株間相異距離為0.13～0.87，遺傳多樣性較豐富。在相異距離為0.60時(shí)，基于RAPD分子標(biāo)記的聚類分析，供試菌株被分為5個(gè)群體，菌株781、大光、白背毛木耳、黃背木耳、臺(tái)耳134為一個(gè)群體；43、43-28為另一個(gè)群體；99豐、43-1、川毛10號(hào)為3個(gè)單獨(dú)群體?；贗SSR分子標(biāo)記的聚類分析，所有供試菌株被分為4個(gè)群體，99豐、川毛10號(hào)、43為3個(gè)單獨(dú)群體，其他菌株聚為一類?；诓煌姆肿訕?biāo)記，供試菌株聚類有相似的地方。如基于RAPD的聚類分析，菌株白背毛木耳與黃背木耳相異距離為0.25?；贗SSR的聚類分析，菌株白背毛木耳與黃背木耳相異距離為0.15。RAPD、ISSR分子標(biāo)記相互印證說明這2個(gè)菌株遺傳距離比較近，遺傳背景較一致。試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)基于不同分子標(biāo)記的聚類分析有一定的差異。如基于RAPD的聚類分析，43-1為單獨(dú)一類，與其他菌株的遺傳距離遠(yuǎn)，相異距離為0.80，說明43-1與其他菌株親緣關(guān)系遠(yuǎn)。而基于ISSR的聚類分析，在相異距離為0.50時(shí)，43-1與大光、白背毛木耳、781、黃背木耳、臺(tái)耳134這5個(gè)菌株聚在一起，說明43-1與這5個(gè)菌株遺傳距離較近。再比如，基于RAPD的聚類分析，菌株43與43-28的相異距離為0.34，說明這2個(gè)菌株遺傳距離較近。而基于ISSR的聚類分析，菌株43與43-28的相異距離為0.68，說明這2個(gè)菌株遺傳距離比較遠(yuǎn)。表明這2種分子標(biāo)記各自的分析結(jié)果有一定的差異，所以單獨(dú)使用一種分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析有一定的局限性，這與江玉姬等[28]的結(jié)論一致。綜合RAPD、ISSR 2種分子標(biāo)記的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行聚類分析，所有供試菌株被分為5個(gè)群體，菌株43、43-28為一個(gè)群體，菌株43、43-28的相異距離為0.48，說明2個(gè)菌株的遺傳距離較近。結(jié)合這2個(gè)菌株的來源分析，43-28是從43選育而來的，兩者具有較相似的遺傳背景，遺傳距離近。這也印證了綜合RAPD、ISSR進(jìn)行遺傳分析較為準(zhǔn)確。毛木耳包括黃背毛木耳、白背毛木耳兩大栽培種類。由于43-28為漳州主栽白背毛木耳品種，43為老的白背毛木耳品種，分析這個(gè)群體為白背毛木耳種類。大光、白背毛木耳、781、黃背木耳、臺(tái)耳134這5個(gè)菌株為另一大的群體，菌株781為漳州90年代的主栽種，是黃背毛木耳品種。大光、黃背木耳分別來源于福建省三明真菌研究所、四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，均是黃背毛木耳種類，因此推測這個(gè)大類群為黃背毛木耳種類，但在這個(gè)類群中，出現(xiàn)來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的白背毛木耳，這個(gè)菌株與黃背木耳的相異距離為0.25，2個(gè)菌株遺傳距離較近，遺傳背景相似。理論上這個(gè)菌株也是屬于黃背毛木耳的范疇。但從菌株名稱來看，白背毛木耳屬于白背毛木耳種類的范疇。推測白背毛木耳菌株為名稱混淆，結(jié)果有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。99豐、川毛10號(hào)、43-1為3個(gè)單獨(dú)群體。99豐、川毛10號(hào)、43-1與其他菌株的相異距離分別為0.87、0.77、0.70，遺傳距離遠(yuǎn)，親緣關(guān)系遠(yuǎn)。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，3個(gè)單一群體、2個(gè)復(fù)合群體之間的菌株遺傳距離較遠(yuǎn)，可作為育種親本的備選菌株。本研究主要從分子水平上對(duì)供試菌株進(jìn)行鑒定，今后的試驗(yàn)可再結(jié)合菌株菌絲、子實(shí)體形態(tài)特征及其生理生化特征，實(shí)現(xiàn)毛木耳菌株更加全面、準(zhǔn)確的鑒定分析，為其育種提供性狀互補(bǔ)、遺傳距離遠(yuǎn)的優(yōu)良親本。