固相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用富集檢測(cè)1-羥基芘的方法研究

郭思依　楊成

[摘要]建立一種固相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用富集檢測(cè)1-羥基芘的方法。通過(guò)優(yōu)化萃取溫度、萃取時(shí)間、攪拌速率、離子強(qiáng)度和靜態(tài)解吸時(shí)間等參數(shù)，得到石墨烯纖維對(duì)1-羥基芘萃取富集的最優(yōu)條件為30℃下以500rpm轉(zhuǎn)速萃取30min，加入氯化鈉濃度10%（W/V），并于200μL甲醇中靜態(tài)解吸2min。1-羥基芘富集的回歸方程為Y=3.074×106X+214 223，線性范圍為1～1 000pg/mL，LOD和LOQ分別為0.3pg/mL和1pg/mL，精密度為3.6%～5.8%。實(shí)際樣品中1-羥基芘檢出濃度為5.61～55.63pg/mL，加標(biāo)回收率為80.8%～105.2%，RSD值均小于10%，該方法具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度。

[關(guān)鍵詞]固相微萃取;高效液相色譜;1-羥基芘;富集

中圖分類號(hào)：O657.63;TS255.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16465/j.gste.cn431252ts.201909

多環(huán)芳烴是一類芳香族環(huán)境致癌物，廣泛存在于大氣、土壤、水源以及食品中。食品受到環(huán)境污染或者不當(dāng)?shù)呐腼兎绞剑鶗?huì)導(dǎo)致多環(huán)芳烴的產(chǎn)生。人們通過(guò)呼吸、飲食等途徑接觸多環(huán)芳烴后令其參與人體代謝過(guò)程[1-2]。1-羥基芘是芘的代謝產(chǎn)物，人體代謝物中的1-羥基芘是多環(huán)芳烴的一個(gè)靈敏有效的生物監(jiān)測(cè)指標(biāo)[3-4]。

1-羥基芘的檢測(cè)方法，主要采用高效液相色譜-熒光檢測(cè)（HPLC-FLD）、液質(zhì)/氣質(zhì)聯(lián)用法等[5-7]。由于基質(zhì)的復(fù)雜性，因此在色譜檢測(cè)之前合適的前處理過(guò)程是十分必要的。目前報(bào)道的前處理方法有固相萃取、磁固相萃取、雙水相萃取等。丁昌明等[8]采用Envi-18固相萃取小柱對(duì)尿樣酶解液進(jìn)行富集凈化，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)9種多環(huán)芳烴代謝物;黃維等[9]利用十八烷基膦酸改性的磁性介孔納米粒子為磁固相萃取介質(zhì)，對(duì)尿樣酶解液進(jìn)行萃取，經(jīng)液相色譜分析;朱裕穗等[10]建立了乙腈-（NH4）2SO4雙水相提取，液相色譜-熒光檢測(cè)尿樣中羥基多環(huán)芳烴的方法，檢出限在0.06～2.32ng/mL。固相微萃取技術(shù)集采樣富集檢測(cè)于一體，過(guò)程更為簡(jiǎn)單高效、綠色環(huán)保，但未見(jiàn)其對(duì)1-羥基芘的富集報(bào)道。

文章利用自制石墨烯固相微萃取纖維結(jié)合高效液相色譜富集檢測(cè)1-羥基芘。石墨烯表面的超大π電子體系與1-羥基芘之間存在π-π共軛和疏水相互作用，可高效富集目標(biāo)物。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)品和氯化鈉：上海阿拉丁試劑公司;甲醇為色譜純：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司;HP-2型β-葡萄糖醛酸酶：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司;鹽酸、冰醋酸、醋酸鈉為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。取10mg 1-羥基芘溶于10mL甲醇中配成1 000mg/L標(biāo)品儲(chǔ)備液存于4℃冰箱，標(biāo)準(zhǔn)工作液由儲(chǔ)備液稀釋得到，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（配2475熒光檢測(cè)器）：美國(guó)沃特世公司;250μL內(nèi)插管：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司;ST3100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：奧豪斯儀器（常州）有限公司;DF-101S集熱式數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：山東鄄城華魯電熱儀器有限公司;5810R多功能臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)艾本德公司;SY-2230恒溫水浴搖床：上海珂淮儀器有限公司。

1.3 高效液相色譜條件

高效液相色譜檢測(cè)采用Waters e2695高效液相色譜儀（配2475熒光檢測(cè)器），進(jìn)樣量20μL，流速1mL/min，色譜柱：XBridge C18（4.6×250mm，5μm），柱溫25℃，流動(dòng)相為水-甲醇（25：75，V/V）。激發(fā)波長(zhǎng)（λex）345nm，發(fā)射波長(zhǎng)（λem）388nm，等度洗脫15min。

1.4 固相微萃取條件優(yōu)化

吸取50μL 1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)工作液至萃取小瓶中，用水稀釋至10mL，蓋上隔膜瓶蓋置于恒溫水浴鍋中。考察萃取溫度（20℃，30℃，40℃，50℃，60℃），萃取時(shí)間（10min，20min，30min，40min，50min），攪拌速率（300rpm，400rpm，500rpm，600rpm，700rpm）、鹽離子濃度（0%、5%、10%、15%、20%，W/V）和靜態(tài)解吸時(shí)間（1min，2min，3min，4min，5min）對(duì)1-羥基芘富集效率的影響。萃取完成后，將纖維頭拉回進(jìn)樣器內(nèi)，立即導(dǎo)入裝有200μL甲醇的內(nèi)插管中靜態(tài)解吸后，進(jìn)液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)流程見(jiàn)圖1。

1.5 SPME-HPLC方法學(xué)評(píng)價(jià)

為建立1-羥基芘富集標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制0.001ng/mL，0.01ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL 1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行最優(yōu)條件下的萃取富集實(shí)驗(yàn)。LOD和LOQ分別以3倍、10倍S/N來(lái)計(jì)算;纖維萃取的重復(fù)性（日內(nèi)、日間精密度）是利用單根纖維分別重復(fù)萃取5次和3次得到。

1.6 實(shí)際樣品的采集與處理

收集5名大學(xué)生晨尿，于-20℃下保存。室溫下將尿樣自然解凍后搖勻，取10mL于50mL離心管中，加入0.2M鹽酸溶液，pH值調(diào)至5.0，然后加入5mL pH值為5.0的醋酸鈉緩沖液和40μL HP-2型β-葡萄糖醛酸酶，充分混勻后在恒溫水浴搖床中于37℃下酶解4h。將酶解液經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，取1mL清液至萃取小瓶中用水稀釋至10mL進(jìn)行SPME。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相微萃取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取溫度

本實(shí)驗(yàn)考察了20℃～60℃溫度下纖維對(duì)1-羥基芘的萃取效率變化，見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著溫度的升高，1-羥基芘的萃取效率在30℃下達(dá)到最大值。當(dāng)溫度繼續(xù)升高，纖維對(duì)1-羥基芘的萃取量反而逐漸降低，表明纖維對(duì)1-羥基芘的吸附為放熱反應(yīng)，在較低溫度下達(dá)到平衡后，升高溫度導(dǎo)致分配系數(shù)降低從而使得1-羥基芘的萃取量逐漸減小。因此，萃取溫度選擇在30℃下進(jìn)行。

2.1.2 萃取時(shí)間

萃取時(shí)間可以顯著地影響萃取量，萃取時(shí)間的選擇是時(shí)間成本與分析方法靈敏度之間的折中。本實(shí)驗(yàn)考察了萃取時(shí)間為10～50min下纖維對(duì)1-羥基芘富集效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維對(duì)1-羥基芘的萃取量逐漸增大且在30min時(shí)基本達(dá)到萃取平衡，因此，選擇萃取時(shí)間為30min。

2.1.3 攪拌速率

萃取體系的攪拌程度對(duì)1-羥基芘的富集效率具有一定影響。實(shí)驗(yàn)考察了300rpm、400rpm、500rpm、600rpm和700rpm的攪拌速率下纖維對(duì)1-羥基芘的萃取效率，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，增大攪拌速率對(duì)1-羥基芘的富集具有先促進(jìn)后抑制的趨勢(shì)。在300～500rpm轉(zhuǎn)速下，萃取量隨攪拌速率的增大而緩慢增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速為至500rpm時(shí)，纖維對(duì)1-羥基芘的萃取量達(dá)到最大，增大轉(zhuǎn)速有利于目標(biāo)物向纖維涂層內(nèi)的轉(zhuǎn)移;當(dāng)攪拌速率繼續(xù)增大時(shí)（500～700rpm），1-羥基芘萃取量逐漸降低，這與萃取體系的不穩(wěn)定性相關(guān)。因此，SPME體系的最佳攪拌速率為500rpm。

2.1.4 離子強(qiáng)度

在樣品溶液中加入氯化鈉（0～20%，W/V），考察離子強(qiáng)度對(duì)萃取效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，鹽離子的加入可以在一定程度上促進(jìn)纖維對(duì)1-羥基芘的萃取吸附，當(dāng)鹽離子濃度增大至10%時(shí)達(dá)到最佳，原因在于鹽離子可與水分子發(fā)生水合作用，使得目標(biāo)物在水中的溶解度降低，有利于向涂層內(nèi)轉(zhuǎn)移而達(dá)到較高的萃取量;然而，繼續(xù)增大鹽離子濃度后，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1-羥基芘的萃取量反而有所降低，原因在于較多的Na+和Cl+會(huì)與目標(biāo)分析物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，從而導(dǎo)致萃取量降低。因此，選擇10%的鹽離子濃度為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

2.1.5 解吸時(shí)間

在SPME過(guò)程結(jié)束后，將纖維頭拉回微量進(jìn)樣器內(nèi)，迅速插入裝有200μL甲醇的內(nèi)插管中進(jìn)行溶劑解吸?？疾旖馕鼤r(shí)間（0.5～2.5min）對(duì)1-羥基芘富集效率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。實(shí)驗(yàn)表明，1-羥基芘的檢出量隨解吸時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增大，當(dāng)解吸時(shí)間達(dá)到2.0min之后，1-羥基芘峰面積不再增大，纖維所富集的1-羥基芘量能夠解吸完全。因此，在甲醇中的解吸時(shí)間選擇2.0min。

2.2 1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及方法學(xué)評(píng)價(jià)

在最優(yōu)SPME實(shí)驗(yàn)條件下，利用纖維對(duì)1～10 000

pg/mL梯度范圍內(nèi)的1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行萃取富集，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，線性范圍為1～1 000pg/mL;回歸方程為Y=3.074×106X+214 223，決定系數(shù)R2為0.998 7;以3倍、10倍S/N分別計(jì)算LOD為0.3 pg/mL、LOQ為1 pg/mL。為考察纖維萃取的重復(fù)性，對(duì)1天內(nèi)獨(dú)立配制的1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行5次測(cè)定，得到日內(nèi)RSD為3.6%，對(duì)連續(xù)3天獨(dú)立配制的1-羥基芘標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，得到日間RSD為5.8%，結(jié)果見(jiàn)圖7、表1。結(jié)果表明，本方法具有較好的重復(fù)性。

2.3 本SPME方法與文獻(xiàn)方法的比較

本方法是利用自制石墨烯SPME纖維，對(duì)酶解液進(jìn)行SPME富集后經(jīng)LC-FLD檢測(cè)。與文獻(xiàn)報(bào)道的其他1-羥基芘富集檢測(cè)方法相比，本方法具有更低的檢出限和較寬的線性范圍，具體見(jiàn)表2，能夠滿足痕量物質(zhì)的檢測(cè)要求。

2.4 實(shí)際樣品中1-羥基芘的檢測(cè)及回收率

取5名大學(xué)生晨尿，經(jīng)酶解處理使結(jié)合態(tài)1-羥基芘水解成游離態(tài)后，進(jìn)行SPME-HPLC富集檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3、圖8。由表3可知，5名大學(xué)生尿樣中均有1-羥基芘檢出;進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為10pg/mL和100pg/mL，得到回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，回收率為80.8%～105.2%，RSD值均小于10%。實(shí)驗(yàn)表明，本方法具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度。

3 結(jié) 論

本章采用自制的石墨烯SPME纖維，通過(guò)石墨烯和1-羥基芘之間π-π作用和疏水相互作用等，建立了對(duì)1-羥基芘萃取富集的新方法。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，得到石墨烯纖維對(duì)1-羥基芘萃取富集的最優(yōu)條件為30℃下以500rpm轉(zhuǎn)速萃取30min，加入氯化鈉濃度為10%（W/V），并于200μL甲醇中靜態(tài)解吸2min后，通過(guò)液相色譜儀（熒光檢測(cè)器）進(jìn)行定量測(cè)定。在此最優(yōu)條件下繪制了1-羥基芘富集的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=3.074×106 X+214 223，決定系數(shù)R2為0.998 7，線性范圍為1～1000 pg/mL，LOD和LOQ分別為0.3 pg/mL和1 pg/mL。日內(nèi)、日間的RSD分別為3.6%和5.8%，表明石墨烯纖維的重復(fù)性較好。將本方法應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)中，1-羥基芘檢出濃度為5.61～55.63 pg/mL，加標(biāo)回收率在80.8%～105.2%，RSD值均小于10%，方法具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度。

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