JSRV-env慢病毒過表達載體構(gòu)建及其對NIH3T3細胞增殖的影響

楊 惠 劉淑英

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院/基礎獸醫(yī)學重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室，呼和浩特 010018)

綿羊肺腺瘤(Ovine pulmonary adenocarcinoma，OPA)是由綿羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV)引起的綿羊可傳播性肺臟腫瘤[1]，目前在全球范圍內(nèi)廣泛流行并嚴重制約了綿羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。OPA 作為一種混合型腺癌，與人肺腺癌之間的組織學相似性使 OPA 成為進一步了解人肺腺癌的有效模型[3]。JSRV 的致瘤作用主要取決于活躍的癌基因——囊膜基因(env)[4]。

為了解JSRV致病機理，大量試驗通過構(gòu)建動物模型，如羔羊JSRV-env感染模型、小鼠JSRV-env腫瘤模型等，探討JSRV-env引起病理組織結(jié)構(gòu)改變、信號通路激活等問題[2]。但從分子病理學角度出發(fā)，為進一步研究JSRV-env致病分子機制，大量試驗構(gòu)建JSRV-env體外轉(zhuǎn)染細胞系，通過JSRV-env過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外細胞，探討JSRV-env引起細胞轉(zhuǎn)化的分子致病基礎[3]。由于在自然感染狀態(tài)下JSRV僅引起綿羊細支氣管上皮細胞及Ⅱ型肺泡上皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，因此需要在體外細胞試驗中構(gòu)建大量JSRV-env體外轉(zhuǎn)染細胞系，尋找不同細胞類型中JSRV-env誘導的分子變化共性，區(qū)分JSRV-env在不同類型細胞中介導的分子變化差異，最終確定JSRV-env致病的關(guān)鍵靶向因子[4-6]。體外細胞試驗證實，JSRV-env能夠誘導多種類型的細胞發(fā)生增殖[5-8]。Alla等[5]研究綿羊支氣管上皮細胞時發(fā)現(xiàn)JSRV-env作用于受體Hayl2，進一步激活RON信號通路引發(fā)細胞增殖能力上調(diào)。Varela等[6]研究JSRV-env作用于人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)，同樣發(fā)現(xiàn)JSRV-env依賴Hayl2受體介導細胞增殖。也有與之不同的研究報道，Johnson等[7]研究發(fā)現(xiàn)，JSRVenv在犬腎細胞(Madin-darby canine kidney)中不依賴 Hayl2 受體激活 PI3K-Akt-mTOR 以及 H/N-Ras-MEK-MAPK 信號通路介導細胞轉(zhuǎn)化及細胞增殖；Thomas 等[8]研究雞胚成纖維細胞 (DF-1) 也發(fā)現(xiàn) JSRV-env不依賴 Hayl2 受體誘導細胞增殖。由此得出結(jié)論 JSRV-env誘導細胞增殖，不同細胞類型所依賴的的受體及信號通路不同[2,5-8]。以上 JSRV-env研究結(jié)果為探討致癌基因在細胞轉(zhuǎn)化及癌癥中的相關(guān)作用提供了研究基礎。

由于NIH3T3細胞不具備Hayl2受體，JSRVenv無法依賴Hayl2受體誘導細胞增殖[2]。然而Maeda等[9]研究表明，NIH3T3細胞中轉(zhuǎn)染JSRV-env真核表達質(zhì)粒能夠激活Akt/mTOR和MAPK信號通路調(diào)控細胞周期。本課題組孫曉林等[10]的研究表明，真核表達質(zhì)粒pcDNA/myc-His/JSRV-env轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，JSRV-env過表達能夠激活Akt/mTOR和MAPK信號通路介導細胞自噬。綜上可知，JSRV-env能夠激活Akt/mTOR和MAPK信號通路調(diào)控細胞周期及細胞自噬，然而目前尚沒有通過構(gòu)建JSRV-env慢病毒大量過表達JSRV-env，直接探討JSRV-env對NIH3T3細胞增殖影響的相關(guān)研究。因此，本試驗擬以NIH3T3細胞作為研究對象，感染JSRV-env慢病毒過表達JSRV-env，通過噻唑藍(MTT)評價細胞增殖能力，以期為進一步研究JSRV致癌基因env的生物學作用及探討JSRV-env致癌機制提供基礎研究資料。

1 材料與方法

1.1 重組慢病毒載體構(gòu)建

根據(jù)JSRV-env序列(JQ837489.1)，使用Primer 6.0設計引物(表1)，采用高保真DNA聚合酶(生工生物工程，上海)，以pEGFP-C1-JSRV-env標準質(zhì)粒(農(nóng)業(yè)部動物臨床診療技術(shù)重點實驗室保存)為擴增模板，對JSRV-env全長基因序列進行PCR擴增?；蚱渭兓噭┖?Takara，大連)回收，ClaI(NEB，美國)酶切紅色熒光報告載體pCMV-dR8.91(生工生物工程有限公司，上海)，通過無縫克隆試劑盒(生工生物工程，上海)將JSRV-env全長基因序列與ClaI酶切后的pCMV-dR8.91載體進行連接。連接體系為：目的片段1 μL；載體3 μL；T4 DNA Ligase 1 μL；Buffer 2 μL；ddH2O 14 μL。22 ℃連接5 h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞。JSRV-envPCR鑒定陽性的轉(zhuǎn)化子，通過BamHI(NEB，美國)單酶切驗證重組質(zhì)?；蚱未笮??；蚱未笮∨c預期結(jié)果一致的陽性轉(zhuǎn)化子進一步送至上海生工進行測序。對于測序正確的轉(zhuǎn)化子，使用質(zhì)粒小抽試劑盒(Promega，美國)提取質(zhì)粒并利用分光光度儀(Bio-Rad，美國)測定質(zhì)粒濃度。

表1 RT-PCR目的基因引物信息Table 1 Primers of target gene for RT-PCR

1.2 JSRV-env重組慢病毒包裝

選擇本實驗室保存的 293T 細胞復蘇，37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞在培養(yǎng)瓶內(nèi)長至70%～80%進行傳代，待細胞狀態(tài)佳，存活率 90% 以上，細胞邊緣清晰時，利用 500 μL 的OPTI-MEM 混勻10 μg重組載體(pCMV-dR8.91-JSRV-env，試驗組)或空載體(pCMV-dR8.91，對照組)，混合 10 μg 包裝輔助質(zhì)粒pCMV-VSV-G(生工生物工程，上海)對293T進行轉(zhuǎn)染，6 h后移去培養(yǎng)基上清，更換為DMEM完全培養(yǎng)基。72 h后利用熒光電子顯微鏡觀察293T細胞內(nèi)是否有紅色熒光蛋白表達，確定重組質(zhì)粒載入細胞，收集培養(yǎng)基上清，4 ℃，500 g離心10 min，收集上層病毒懸液，利用0.22 μmol/L PVDF過濾器過濾并收集至10 mL離心管。

1.3 JSRV-env重組慢病毒濃縮及滴度測定

將20%的蔗糖溶液加至病毒懸液底部，4 ℃，25 000 g 離心2 h，棄掉上清，室溫晾干至離心管底可見沉淀。用無血清的OPTI-MEM 4 ℃溶解2 h，碎干冰速凍后儲存于-80 ℃。取24孔板接種293T細胞。待細胞融合率為40%～60%，確定感染前實際細胞數(shù)目，記為N。病毒10倍稀釋3個梯度(1×10-7g/mL、1×10-6g/mL、1×10-5g/mL)感染293T細胞72 h，利用Image pro plus 6.0統(tǒng)計每視野下熒光表達面積及對應視野下平鋪細胞面積，二者之比為293T細胞內(nèi)熒光蛋白表達比率。利用DNA抽提試劑盒(Invitrogen，美國)提取 293T 細胞基因組 DNA，利用 Real-time PCR 試劑盒(Takara，大連)擴增 JSRVenv，擴增引物見表2，ABI PRISM 7000 定量系統(tǒng)(Applied biology，美國)定量。循環(huán)條件： 50 ℃ 2 min， 95 ℃ 10 min， 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，40個循環(huán)，每組處理重復3次。Real-time PCR 檢測結(jié)果采用2-ΔΔCT方法進行計算，測得 293T 細胞每基因組載入的慢病毒拷貝數(shù)，進一步計算病毒滴度。病毒滴度(Integration units per mL，IU/mL)的計算公式如下：IU/mL=(C×N×D×1 000)/V(C=平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)；N=感染時細胞的數(shù)目；D=病毒載體的稀釋倍數(shù)；V=加入的稀釋病毒的體積數(shù))。

表2 RT-qPCR目的基因引物信息Table 2 Primer information of the target gene for RT-qPCR

1.4 JSRV-env重組慢病毒感染 NIH3T3

將本實驗室保存的NIH3T3從液氮罐中取出，37 ℃水浴復蘇，待細胞傳至三代穩(wěn)定后，細胞狀態(tài)較佳，細胞邊緣清晰，設置4個細胞試驗組分別加入JSRV-env重組慢病毒(5、10、15和20 μg)感染72 h，每組處理重復3次，確定NIH3T3的最佳病毒感染復數(shù)(MOI)。MOI計算公式如下：P=1-P(0)，m=-InP(0)(P=被感染細胞的百分率；P(0)=未被感染細胞的百分率；m=MOI值)。

1.5 噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖能力

培養(yǎng)狀態(tài)良好的NIH3T3細胞，設置3個細胞試驗組分別加入完全培養(yǎng)基(空白組)、完全培養(yǎng)基吹打混勻的空病毒載體(對照組)、完全培養(yǎng)基吹打混勻的JSRV-env重組慢病毒(JSRVenv組)，最佳MOI條件下感染72 h。每組取200 μL吹打混勻的細胞懸液進行細胞計數(shù)，每組設3個復孔，以3 000個細胞/孔接種于96孔板內(nèi)，每100 μL加入10 μL MTT檢測液，連續(xù)繪制3天細胞生長曲線，酶標儀以570 nm波長檢測OD值。

1.6 統(tǒng)計分析

每組試驗重復3次，試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(X±S) 表示。所有數(shù)據(jù)均采用 Graphpad Prism 8.0 軟件處理；兩組均數(shù)間比較用t檢驗(t-test)；兩組以上均數(shù)的比較采用方差分析(ANVOA)。P<0.05 時認為具有統(tǒng)計學意義，P<0.05為差異顯著，在統(tǒng)計圖中表示為*；P<0.01為差異極顯著，在統(tǒng)計圖中表示為 **。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組慢病毒載體構(gòu)建

由圖1(a)可知，擴增出的env目的片段大小與預期序列1 848 bp一致。酶切鑒定完全正確，其酶切產(chǎn)物大小預期7 861 bp(圖1(b))一致?；蚱渭兓噭┖蟹謩e純化env全長基因序列及ClaI 酶切載體，env同源重組入表達載體，BamHI對重組質(zhì)粒單酶切，酶切鑒定完全正確，其酶切產(chǎn)物大小預期9 709 bp(圖1(c))一致。最終命名重組質(zhì)粒為pCMV-dR8.91-JSRV-env，基因結(jié)構(gòu)如圖1(d)。將pCMV-dR8.91-JSRV-env轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞擴增，隨機挑取4個轉(zhuǎn)化子進行JSRV-env菌落PCR鑒定，擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果完全正確，其鑒定產(chǎn)物大小預期1 848 bp(圖1(e))。陽性克隆送至上海生工測序，測序結(jié)果與預期pCMV-dR8.91-JSRV-env基因序列一致，提示慢病毒載體構(gòu)建成功。

(a) 1，從PEGFP-C1-JSRV-env 標準質(zhì)粒中擴增出目的片段 env; M， DL2 000 marker； (b) 1， pCMV-dR8.91 載體 ClaI 酶切產(chǎn)物； M， DL10，000 marker； (c) 1， pCMV-dR8.91-JSRV-env載體 BamHI 酶切產(chǎn)物； M，DL10 000 marker； (d) pCMV-dR8.91-JSRV-env結(jié)構(gòu)示意圖; (e) 1-4， 隨機挑取的 4 個轉(zhuǎn)化子； M， DL10 000 marker.(a) 1, The target fragment env was amplified from the PEGFP-C1-JSRV-env standard plasmid; M, DL2 000 marker; (b) 1, ClaI digestion product of pCMV-dR8.91 vector; M, DL10 000 marker； (c) 1, BamHI digestion product of pCMV-dR8.91-JSRV-env vector； M, DL10 000 marker; (d) pCMV-dR8.91-JSRV-env structure diagram; (e) 1-4, randomly selected 4 transformants; M, DL10 000 marker.圖1 pCMV-dR8.91-JSRV-env重組載體構(gòu)建Fig.1 pCMV -dR8.91-JSRV-env recombinant vector linkage

2.2 JSRV-env重組慢病毒包裝

將上述測序結(jié)果正確的轉(zhuǎn)化子進行質(zhì)粒抽提并測定濃度。5 μg 的pCMV-dR8.91-JSRV-env和10 μg 包裝輔助質(zhì)粒pCMV-VSV-G轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞轉(zhuǎn)染72 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到在293T細胞中大量紅色熒光蛋白表達，提示JSRV-env重組慢病毒包裝成功(圖2)。

圖2 pCMV-dR8.91-JSRV env質(zhì)粒在293T細胞中表達Fig.2 pCMV-dR8.91-JSRV env plasmid expressed in 293T cells

2.3 純化的重組慢病毒滴度測定

利用超速離心沉淀法對重組慢病毒濃縮純化，純化后的病毒進行梯度稀釋并感染 293T 細胞 72 h 后，觀察熒光表達情況。由圖3(a)可見，熒光細胞數(shù)隨稀釋倍數(shù)增加而相應減少，1及10 μg 的pCMV-dR8.91-JSRV-env感染 293T 細胞72 h，其熒光蛋白的表達占比均>80%(圖3(b))； Real-time PCR 驗證1 μg的pCMV-dR8.91-JSRV-env重組病毒感染293T細胞72 h后，JSRV-env過表達極顯著(P<0.01)(圖3(c))；將 293T 細胞每基因組整合的 JSRV-env病毒拷貝數(shù)、感染時的細胞總數(shù)、病毒載體稀釋倍數(shù)以及稀釋病毒的體積數(shù)分別代入病毒滴度計算公式，最終計算得到JSRV-env慢病毒平均滴度為2.99×108IU/mL(表3)。以上結(jié)果表明，JSRV-env慢病毒構(gòu)建成功，并且純化后得到的JSRV-env慢病毒平均滴度為2.99×108IU/mL。

2.4 JSRV-env重組慢病毒感染 NIH3T3 細胞

針對細胞狀態(tài)良好的NIH3T3細胞分別加入JSRV-env重組慢病毒(5、10、15和20 μg)感染72 h，每組處理重復3次，熒光場下觀察10 μg JSRV-env重組慢病毒的轉(zhuǎn)染效率最高(圖4)，根據(jù)MOI計算公式，計算得出NIH3T3的最佳病毒感染復數(shù)為30 MOI。以上結(jié)果表明，JSRV-env慢病毒感染NIH3T3細胞，感染效率最高的病毒感染復數(shù)為30 MOI。

2.5 噻唑藍(MTT)檢測細胞增殖能力

為研究JSRV-env重組慢病毒能否引起NIH3T3細胞增殖發(fā)生變化，采用MTT法檢測空白(未感染細胞)組，以及30 MOI感染條件下JSRV-env過表達(感染JSRV-env重組慢病毒)組和對照(感染慢病毒空載體)組的細胞增殖能力。比較各組細胞第12、24、48和72 h的光吸收值，結(jié)果表明感染重組慢病毒的NIH3T3細胞中各時間點光吸收值均高于空白組和對照組，其中在48和 72 h 光吸收值差異顯著(P<0.05)(圖5)。以上結(jié)果表明，過表達JSRV-env可以上調(diào)NIH3T3細胞的增殖能力。

3 討論與結(jié)論

3.1 JSRV-env過表達載體

本研究針對JSRV致癌基因env構(gòu)建過表達慢病毒并進行體外NIH3T3細胞感染，為進一步了解env致瘤機制提供新的研究方法。在前人的研究中，由于JSRV-env真核質(zhì)粒載體構(gòu)建流程簡單、試驗周期短，而成為過表達JSRV-env的主要工具[5-8]。但質(zhì)粒轉(zhuǎn)染存在許多缺陷：首先，JSRV-env質(zhì)粒在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定，不同細胞在不同轉(zhuǎn)染方法和不用轉(zhuǎn)染介質(zhì)中，轉(zhuǎn)染效率差別大，且大部分細胞轉(zhuǎn)染效率不高；其次，JSRV-env質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入細胞核效率低，特別是陽離子脂質(zhì)體對細胞損傷較大[11]。與質(zhì)粒相比，病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，可實現(xiàn)體外細胞的高效且穩(wěn)定轉(zhuǎn)導[12]。目前常用的兩種JSRV-env真核質(zhì)粒共2種：一種為帶HA標簽的pcDNA3.1真核質(zhì)粒[13]；另一種為帶HIS標簽的pcDNA4.0質(zhì)粒[9]。其中，pcDNA3.1質(zhì)粒需要插入SPA提高JSRV-env表達效率[13]，與JSRV-env質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞相比，JSRV-env慢病毒載體感染細胞一方面可以過表達env；另一方面慢病毒的長末端重復序列(Long terminal repeats，LTRs)含有病毒啟動子和增強子元件能夠增強病毒的表達，極大地還原了病毒對細胞的作用條件，是目前 JSRV-env過表達較為理想的載體[14]。

(a)倒置顯微鏡白光場和熒光場下，不同病毒量的 pCMV-dR8.91-JSRV-env重組慢病毒感染 293T 細胞 72 h 后的熒光蛋白表達情況；(b)不同病毒感染量的 JSRV-env 慢病毒感染 293T 細胞 72 h 相對熒光蛋白表達率分析結(jié)果；(c) pCMV-dR8.91-JSRV-env 感染 293T 細胞 72 h，Real-time PCR 檢測 293T 細胞中 JSRV-env 相對表達量分析.(a) Fluorescent protein expression of 293T cells infected with pCMV-dR8.91-JSRV-env with different viral amounts under white light field and fluorescent field of an inverted microscope for 72 h. (b) Relative fluorescence analysis results of protein expression rate; (c) pCMV-dR8.91-JSRV-env infected 293T cells for 72 h, Real-time PCR analysis of the relative expression of JSRV-env in 293T cells.**表示極顯著性差異(P<0.01)** indicate extremly significant differences (P<0.01)圖3 JSRV-env重組慢病毒滴度測定Fig.3 Titer determination of JSRV-env recombinant lentivirus

表3 JSRV-env重組慢病毒滴度Table 3 Virus titers of JSRV-env

圖4 不同載量 JSRV-env 重組慢病毒感染 NIH3T3 細胞Fig.4 NIH3T3 cells infected with JSRV-env at different loads

*表示顯著性差異(P<0.05)* indicates significant difference (P<0.05)圖5 MTT法檢測JSRV-env慢病毒感染 NIH3T3 細胞增殖Fig.5 Detection of proliferation of NIH3T3 cells infected with JSRV-env lentivirus by MTT assay

3.2 JSRV-env 體外誘導細胞增殖機理

在本研究中JSRV-env重組慢病毒以最佳感染條件轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞72 h，噻唑藍(MTT)檢測顯示，JSRVenv過表達可顯著促進NIH3T3細胞增殖。Maeda等[9]利用pcDNA 3.1-JSRV-env真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠腎上皮細胞RK3E的研究與本研究結(jié)查基本一致。在JSRV-env過表達的大鼠腎上皮細胞RK3E細胞中，JSRV-env激活MEK-1(PD98059)和H/N-Ras(FTI-277)位點，Ras-Raf-MEK-MAPK途徑被激活，從而介導細胞增殖[2]。此外也有報道指出添加MEK-1抑制劑PD98059于JSRV-env過表達的大鼠腎上皮細胞RK3E細胞中，可以抑制細胞轉(zhuǎn)化但不影響細胞增殖，添加 H/N-Ras 抑制劑FTI-277可以影響細胞增殖但差異并不顯著[15]。相反Ras-Raf-MEK-MAPK途徑在犬腎MDCK細胞轉(zhuǎn)化中不表現(xiàn)介導細胞增殖的生物學功能[2,7]。因此，闡明物種差異、細胞類型和試驗條件對了解JSRV-env影響細胞增殖的機制具有重要意義[2,7,10]。基于以上研究結(jié)論，推測本試驗中過表達JSRV-env的NIH3T3細中，JSRV-env不依賴Hayl2受體激活Ras-Raf-MEK-MAPK信號通路，通過介導細胞周期縮短最終造成NIH3T3細胞大量增殖[2,9-10]，深入機理尚需進一步研究。本研究可為今后深入探討JSRV-env誘導NIH3T3細胞信號通路激活、下游致病分子基礎等，提供高效、穩(wěn)定的JSRV-env體外轉(zhuǎn)染模型。

3.3 結(jié)論與展望

本研究通過構(gòu)建pCMV-dR8.91-JSRV-env慢病毒過表達載體，轉(zhuǎn)染HEK 293T細胞成功獲得JSRVenv重組慢病毒，并將JSRV-env重組慢病毒感染NIH3T3細胞，表明JSRV-env重組病毒顯著促進對NIH3T3細胞增殖，為進一步揭示JSRV-env生物學作用及探討JSRV致癌機制提供基礎。未來可以將JSRV-env慢病毒載入不同類型細胞，通過構(gòu)建多種JSRV-env體外過表達細胞模型，進一步探討JSRV-env作用靶點及相關(guān)信號通路，更加完善JSRV-env致癌機制。