CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的人乳鐵蛋白基因在山羊β-乳球蛋白基因座定點敲入

宋紹征 張 婷 潘生強 陸 睿 成 勇* 周鳴鳴*

(1.無錫太湖學院 護理學院， 江蘇 無錫 214000；2.揚州大學 獸醫(yī)學院/江蘇省轉(zhuǎn)基因動物制藥工程研究中心，江蘇 揚州 225009；3.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院 制藥工程學院，江蘇 淮安 223003)

近年來牛乳過敏癥體質(zhì)者日漸增多[1]，因此研發(fā)改造不含致敏原的食用乳品至關(guān)重要。羊乳的成分更接近于人乳，可作為牛乳過敏體質(zhì)者最理想的替代乳品[2]。研究表明山羊乳中β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，BLG)是引起人體過敏反應的主要致敏原，且酶水解、加熱和糖基化處理也很難消除其致敏性，反而會加重過敏反應[3-4]。人乳鐵蛋白(Human lactoferrin，hLF)是最初在人乳汁中發(fā)現(xiàn)的一種鐵結(jié)合蛋白，具有抑菌和殺菌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、促進鐵元素吸收等多種生物學功能，是十分理想的乳品添加劑[5]。因此，消除或降低羊乳中致敏原，同時增加功能營養(yǎng)蛋白成分，是提高羊乳品質(zhì)的一個重要研究方向。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是一種成簇規(guī)律間隔短回文重復序列，由sgRNA引導Cas9核酸內(nèi)切酶特異識別靶基因位點，切割使DNA雙鏈斷裂，再經(jīng)同源重組和非同源末端連接兩種途徑進行修復[6]，是一種新型基因打靶技術(shù)，具有簡單、高效、精準且易獲得純合子突變體等特點，被廣泛地應用于轉(zhuǎn)基因動物細胞和個體的基因組定點精確編輯和修飾[7-9]。通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的基因打靶技術(shù)，可以對山羊致敏原BLG基因敲除和營養(yǎng)成分hLF基因敲入，通過內(nèi)源調(diào)控機制在乳腺中特異表達hLF而不表達BLG，實現(xiàn)羊乳的“人源化”改造，從而改善乳品質(zhì)量：田雨晨等[10]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對牛胎兒成纖維細胞β-酪蛋白基因進行編輯；劉暢等[11]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導奶山羊胎兒成纖維細胞中的β-酪蛋白基因位點的打靶研究；周文君等[12]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導人乳鐵蛋白在山羊耳成纖維細胞BLG基因座的打靶研究。這些研究雖然成功高效獲得了基因打靶細胞，為羊乳蛋白基因編輯和“人源化”改造提供了研究價值，但僅局限于細胞水平的基因打靶研究，還未能獲得存活的基因打靶山羊個體。因此，本研究擬利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)，在山羊中敲除致敏原BLG基因，同時定點敲入功能營養(yǎng)蛋白hLF基因，并通過體細胞核移植制備BLG-/hLF+基因打靶山羊胎兒，進而建立細胞系，以期為今后CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導BLG基因座的定點精確修飾和精準基因分子遺傳育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用薩能奶山羊和徐淮白山羊常規(guī)飼養(yǎng)于揚州大學實驗農(nóng)牧場。

BLC14質(zhì)粒和菌種 (含山羊BLG3′調(diào)控序列和BLG5′調(diào)控序列、hLFcDNA、NEO基因、CMV增強子、PolyA信號)[13]，宿主菌DH5α(Escherichiacoli)， CRISPR/Cas9 二合一質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒購自南京堯順禹生物科技有限公司(AxyPrep PCR Clean-up Kit，Cat.No.AP-PCR-250)。

DMEM/F12培養(yǎng)液、FBS (Hyclone公司，美國)；G418、Trypsin (Amresco公司，美國)；M16、M2、青鏈霉素、透明質(zhì)酸酶、細胞松弛素B、核熒光染料hochest 33342、6-甲基氨基蝶呤、離子霉素(Sigma公司，美國)；DNA 膠純化回收試劑盒(QIAGEN 公司，德國)；DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶(大連寶生物工程有限公司)；其他未說明試劑均為分析純(上海生工生物工程有限公司和中國國藥集團化學試劑有限公司)。

1.2 引物設計及合成

本試驗使用到的所有PCR引物均通過Primer Premier 5.0軟件完成，由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成引物的合成(表1)。

1.3 sgRNA設計及sgBLG/Cas9表達載體構(gòu)建

針對山羊基因組中BLG基因座 (NCBI，Z33881.1，8 088 bp) 的第一外顯子區(qū)域設計sgRNA，應用在線軟件 (https:∥zlab.bio/guide-design-resources) 設計長度為22 bp 的sgRNA 引導序列，靶位點序列為GTGCCCCCACTTCTGGGGTCTA。然后通過常規(guī)分子生物學技術(shù)構(gòu)建表達載體并命名為sgBLG/Cas9。

表1 研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4 奶山羊胎兒成纖維細胞的分離及培養(yǎng)

按照參考文獻[14]和[15]的常規(guī)細胞培養(yǎng)方法，通過無菌手術(shù)剖宮產(chǎn)取35日齡奶山羊胎兒，來進行原代細胞的分離與培養(yǎng)。

1.5 CRISPR/Cas9編輯山羊BLG位點致突變活性檢測

待山羊胎兒成纖維細胞生長匯合度達到約80%時，收集細胞，用電轉(zhuǎn)染液洗滌離心后，重懸細胞調(diào)整密度至1×106個/mL，進行轉(zhuǎn)染。sgBLG/Cas9質(zhì)粒經(jīng)QIAGEN試劑盒純化后與細胞懸液混合，然后調(diào)整質(zhì)粒終濃度至15 μg/mL，進行電轉(zhuǎn)染(條件：2.0 kV/cm、250 μs、電擊2次，2 mm間隙電極杯，靜置3 min)，使用DMEM/F12+10% FBS培養(yǎng)液重懸細胞，轉(zhuǎn)移至六孔板內(nèi)培養(yǎng)(條件：37 ℃、5% CO2、飽和濕度)，隔1 d換液1次。同時設置未轉(zhuǎn)染的正常細胞作陰性對照。待細胞匯合至60%左右時，收集細胞，提取DNA，經(jīng)PCR對靶標區(qū)域進行檢測，擴增產(chǎn)物送上海華大基因科技有限公司進行測序。

1.6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的hLF基因打靶細胞系的建立

BLC14打靶載體經(jīng)SalⅠ和NotⅠ雙酶切線性化后，與sgBLG/Cas9表達載體混合，終濃度均調(diào)整至15 μg/mL，按照步驟1.5的方法和條件進行電轉(zhuǎn)染，同時設置陰性對照(正常未轉(zhuǎn)染的細胞)。2 d后，添加500 μg/mL G418 進行藥物抗性篩選，定期換液(隔3 d)和觀察。當陰性對照組的細胞全部死亡時(10～14 d)，在熒光倒置顯微鏡下挑取單克隆細胞集落，更換為正常培養(yǎng)液，置于48孔板內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，傳代于12孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)擴大培養(yǎng)。待匯合度至80%～90%時，重懸收集一部分細胞，提取基因組用作PCR檢測。應用CMV-hLF-F/R引物進行人乳鐵蛋白基因整合檢測，應用5′BLG-hLF-F/R引物進行5′端靶位點同源重組檢測，應用NEO-3′BLG-F/R引物進行另一側(cè)的3′端靶位點同源重組檢測。剩余細胞凍存以作供核細胞來制備轉(zhuǎn)基因克隆山羊。

1.7 轉(zhuǎn)基因克隆山羊的制備

按照參考文獻[14-16]的方法，對性成熟的正常雌性徐淮白山羊進行超數(shù)排卵，獲取供質(zhì)的卵母細胞，且同步對受體羊進行發(fā)情處理。隨后進行體細胞核移植、重構(gòu)胚的融合與激活、胚胎受體移植、受體山羊妊娠診斷檢測等，成功受孕后的山羊單圈常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.8 基因打靶克隆胎兒鑒定

妊娠山羊經(jīng)無菌剖宮產(chǎn)手術(shù)獲取35 日齡克隆胎兒，按照1.4的方法獲得細胞系，通過PCR進行基因打靶鑒定，應用CMV-hLF-F/R引物進行人乳鐵蛋白基因整合檢測，應用5′BLG-hLF-F/R和NEO-3′BLG-F/R引物進行同源重組檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgBLG/Cas9介導的山羊BLG基因座的打靶原理

根據(jù)山羊BLG基因第一外顯子序列設計了長度為22 個堿基的sgRNA引導序列，并依據(jù)同源重組的原理，以BLC14乳腺特異性表達載體作為打靶載體，利用sgBLG/Cas9介導的山羊BLG基因敲除的同時定點導入hLF基因。由sgRNA 引導序列在山羊BLG基因座的打靶原理見圖1。

圖1 sgBLG靶位點和打靶原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of sgBLG target site and target principle

2.2 山羊胎兒成纖維細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)

利用胰蛋白酶消化法(消化液：0.05%胰蛋白酶+0.04% EDTA)分離獲得山羊胎兒成纖維細胞，經(jīng)傳3 代培養(yǎng)后的典型形態(tài)結(jié)構(gòu)如圖2所示。正常的原代(P0)山羊胎兒成纖維細胞形態(tài)瘦小，大部分呈現(xiàn)細長條狀、長梭形或無規(guī)律性排列，屬于一種常見的貼壁細胞(圖2(a))。經(jīng)傳至第三代(P3)以后的胎兒成纖維細胞匯合至80%～90%時，細胞群通常呈現(xiàn)放射狀、渦旋狀或火焰狀；當細胞密度大于90%時，肉眼可觀察到有散落的白色集落形成于細胞群內(nèi)，而且細胞間相互擠壓呈現(xiàn)明顯的細長條狀(圖2(b))。

圖2 山羊胎兒成纖維細胞(標尺=10 μm)Fig.2 Goat fetal fibroblasts (Sale bar=10 μm)

2.3 CRISPR/Cas9編輯山羊胎兒成纖維細胞的BLG位點活性檢測

將構(gòu)建成功的sgBLG/Cas9表達載體轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞后，提取細胞基因組DNA，使用sg-BLG-F/R引物進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)測序后獲得峰圖，通過峰圖的重疊情況來驗證細胞系的突變程度(圖3)。開始出現(xiàn)重疊的套峰處如圖中箭頭所指，即此處開始出現(xiàn)突變堿基(sgBLG/Cas9識別位點為山羊BLG基因第一外顯子C)。根據(jù)這種重疊套峰所占峰面積的比例情況，可初步判斷sgBLG/Cas9表達載體在山羊胎兒成纖維細胞中切割基因組DNA雙鏈的致突變活性約為30%～35%。

圖3 sgBLG/Cas9表達載體的 PCR活性檢測峰截圖Fig.3 Sequencing peak diagram of sgBLG/cas9 expression vector by PCR

2.4 hLF基因打靶細胞系的檢測

BLC14基因打靶載體與sgBLG/Cas9表達載體共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞5×106個(細胞計數(shù))，經(jīng)G418篩選獲得72株藥物抗性細胞。應用CMV-hLF-F/R引物進行hLF基因整合檢測，獲得65株hLF轉(zhuǎn)基因細胞，PCR擴增產(chǎn)物大小均為470 bp(圖4(a))。應用5′BLG-hLF-F/R引物對hLF轉(zhuǎn)基因細胞進行5′端同源重組檢測，初步判斷有37株為基因打靶細胞，PCR擴增產(chǎn)物大小均為4 708 bp(圖4(b))。應用NEO-3′BLG-F/R引物對基因打靶細胞進行3′端同源重組檢測，進一步驗證該37 株細胞均為基因打靶細胞，PCR擴增產(chǎn)物大小均為2 402 bp(圖4(c))。山羊胎兒成纖維細胞BLG基因座定點打靶hLF基因的效率達51.4%(37/72)。

熒光倒置顯微鏡下觀察細胞，挑取其中形態(tài)較好、飽滿度高、折光性和立體感強的7株基因打靶細胞凍存以作核移植的供核細胞。

2.5 克隆胚的發(fā)育情況及基因打靶的驗證

選擇2.4中形態(tài)較好的7 株基因打靶細胞(Ts1～Ts7)，超排共獲得709 枚山羊卵母細胞，去核卵548 枚，去核率為77.3%(548/709)；融合后獲得452枚重構(gòu)卵，融合率為82.5%(452/548)；激活后培養(yǎng)挑取較好的416 枚重構(gòu)胚移植入30 只經(jīng)同步發(fā)情處理的受體山羊輸卵管中，30～35日，使用 B超對受體山羊進行妊娠診斷，13 只懷孕，妊娠率為43.3%(13/30)(表2)。

(a) hLF基因整合檢測PCR圖 hLF transgenic integration analysis of PCR；M: DL-2000 DNA marker; P: BLC14 載體; N: 未轉(zhuǎn)染正常細胞; 1～22: 轉(zhuǎn)染細胞.M: DL-2000 DNA marker; P: BLC14 vector; N: Untransfected normal cells; 1-22: Transfected cell samples.(b) 5′端基因同源重組檢測PCR圖5′ gene homologous recombination analysis of PCR；M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: 未轉(zhuǎn)染正常細胞; 1～7: 轉(zhuǎn)基因細胞.M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: Untransfected normal cells; 1-7: Transgenic cell samples.(c) 3′端基因同源重組檢測PCR圖3′ gene homologous recombination analysis of PCR；M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: 未轉(zhuǎn)染正常細胞; 1～7: 轉(zhuǎn)基因細胞.M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker; N: Untransfected normal cells; 1-7: Transgenic cell samples.圖4 PCR檢測基因打靶細胞株圖Fig.4 PCR analysis of gene targeting cell lines

手術(shù)剖宮產(chǎn)獲取3 只35日齡胎兒 (圖5分別為 Ts1-1、Ts5-1、Ts5-3克隆胎兒)。通過hLF基因整合檢測和同源重組檢測證明了該3 只胎兒均為BLG基因座打靶胎兒(圖6)，并建立了BLG-/hLF+靶向性修飾細胞系。

表2 細胞核移植生產(chǎn)克隆胎兒統(tǒng)計Table 2 Statistics of the production of cloned fetuses by nuclear transfer

(a) Ts1-1克隆胎兒 Ts1-1 cloned fetus; (b) Ts5-1克隆胎兒 Ts5-1 cloned fetus; (c) Ts5-3克隆胎兒 Ts5-3 cloned fetus圖5 35日齡BLG-/hLF+基因型克隆胎兒圖片F(xiàn)ig.5 Images of three 35-day-old cloned fetuses of BLG-/hLF+ genotype

3 討論與結(jié)論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是細菌和古生菌在長期演化過程中形成的一種能夠抵御外來病毒或遺傳物質(zhì)入侵的獲得性免疫防御系統(tǒng)，在植物、微生物、小鼠和大中型家畜細胞中已有較多的應用報道[9,16-17]，是近年來基因編輯領域的一大“利器”，也是應用最廣泛的一種高效、精準、簡單的基因編輯技術(shù)。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的動物基因打靶技術(shù)可以對哺乳動物的乳蛋白基因組進行精準編輯修飾，在BLG等致敏原基因座定向置換hLF等功能營養(yǎng)蛋白基因，既可以降低或去除乳中致敏原又可以增加營養(yǎng)成分，改善消費者飲用乳品的質(zhì)量，是動物乳產(chǎn)品“人源化”改造的新思路和新方法[16]。

(a) 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: 陰性對照; P: 陽性對照; M: DL-2000 DNA marker. 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: Negative control; P: Positive control; M: DL-2000 DNA marker.(b) 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: 陰性對照; P: 陽性對照; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker. 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: Negative control; P: Positive control; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker.(c) 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: 陰性對照; P: 陽性對照; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker. 1: Ts1-1; 2: Ts5-1; 3: Ts5-3; N: Negative control; P: Positive control; M: λ-EcoT14Ⅰdigest DNA marker.圖6 BLG-/hLF+基因型打靶胎兒檢測PCR圖Fig.6 PCR detection of gene targeting fetuses of BLG-/hLF+ genotype

牛、羊等大中型家畜基因打靶的早期研究報道主要集中于長同源臂構(gòu)建打靶載體、人工鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應蛋白核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALEN)等，存在效率低、精準度低、篩選繁雜、難以獲得完整的打靶動物個體等缺陷[18]。孫麗新等[19]在山羊β-酪蛋白基因位點定點敲入hLF基因的研究；Shen等[20]在山羊β-酪蛋白基因定點敲入htPAm基因的研究；張學明等[21]將gdnf基因定點導入牛β-casein基因座的打靶研究。但是，上述研究均沒有獲得存活的基因打靶動物個體，而且效率低下，脫靶現(xiàn)象極為嚴重。李雪玲等[11]利用TALENs基因編輯技術(shù)在奶山羊胎兒成纖維細胞β-酪蛋白基因的第二外顯子的打靶研究，將打靶效率提高達到32.35%，為今后通過體細胞核移植技術(shù)制備敲除β-酪蛋白基因奶山羊提供了可選的供體細胞。本課題組通過TALENs技術(shù)在山羊BLG基因座定點敲入hLF基因的研究中，獲得了6株BLG-/hLF+基因打靶細胞及1只打靶胎兒，為羊乳“人源化”及遺傳育種提供了研究基礎[15]。因此，一種高效的基因編輯技術(shù)亟待解決。Ni W和Polejaeva IA等[22]首次將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地應用于山羊的基因編輯，從而開啟了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在山羊基因組中編輯的新篇章。

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的乳蛋白基因編輯和羊乳“人源化”改造是目前乳腺生物反應器研究領域的熱點。西北農(nóng)林科學大學張涌團隊等[10]率先利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對牛胎兒成纖維細胞β-酪蛋白基因進行編輯，打靶效率為9.7%；周文君等[12]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導人乳鐵蛋白在山羊耳成纖維細胞BLG基因座的打靶研究，打靶效率為36.69%；劉暢等[11]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對山羊胎兒成纖維細胞β-酪蛋白基因的第二外顯子進行打靶研究，打靶效率高達74.29%。但是，上述研究仍然局限于細胞水平，還沒有在中靶動物個體水平進行研究，也沒有存活的基因打靶動物個體出生。

本研究證實了CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠介導山羊乳蛋白靶向基因敲入和敲出。共篩選出37株BLG-/hLF+基因打靶細胞，打靶效率為51.4%，遠遠高于傳統(tǒng)的基因打靶效率[14,16]，與類似研究報道打靶效率相當[11-12]，而且妊娠率(43.3%)也遠遠高于其它相關(guān)研究報道[15]。最終通過無菌剖宮產(chǎn)獲取克隆胎兒，建立BLG-/hLF+基因打靶細胞系，并進一步證明了均為BLG基因座定點打靶hLF基因胎兒和細胞系。此外，本實驗室保存的BLC14基因打靶載體含有山羊BLG調(diào)控區(qū)、hLF功能基因、CMV增強子及藥物抗性基因NEO，其在乳腺中特異性穩(wěn)定表達能力在山羊、兔和小鼠中已經(jīng)得到了良好的驗證[13-16]。以上結(jié)果表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的BLG-/hLF+中靶細胞作為山羊體細胞核移植的供核細胞制備的重構(gòu)胚具有類似干細胞的全能發(fā)育性和恢復發(fā)育成長至完整個體的潛能，而且在內(nèi)源BLG基因座定向編輯置換hLF基因并未影響早期山羊胚胎的順利發(fā)育。雖然有部分受體在中后期發(fā)育過程中出現(xiàn)妊娠終止情況，暗示基因打靶細胞可能會干擾克隆胎兒的發(fā)育程度，但已有研究也報道了隨著重構(gòu)胚胎的不斷發(fā)育，中后期出現(xiàn)胎兒發(fā)育停滯的現(xiàn)象[20,23]。

本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導在山羊BLG基因座定向置換hLF基因，成功地獲得了多株BLG-/hLF+基因打靶細胞，經(jīng)核移植和剖宮產(chǎn)獲得了該基因的中靶克隆山羊胎兒個體及靶向性修飾細胞系，為培育羊乳中低致敏原和富含hLF功能營養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)基因山羊新品系奠定了基礎，也為羊乳“人源化”改造及其它乳蛋白基因編輯提供了科學依據(jù)。