Zein/konjac glucomannan復(fù)合顆粒制備的Pickering乳液穩(wěn)定性研究

岳 強(qiáng)，尹 艷，董梓炯，溫曉靜，蔡吉豪，成栢吉，鐘其建

（1.中國檢驗(yàn)認(rèn)證集團(tuán) 廣東有限公司，廣東 廣州 510623；2.惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007；3.華南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631）

固體顆粒穩(wěn)定的乳液稱之為Pickering乳液［1］.因?yàn)楣腆w顆粒一旦吸附到油水界面就很難解吸下來，Pickering乳液被認(rèn)為是穩(wěn)定性很高的乳液體系.因?yàn)槠浞€(wěn)定性很高，沒有表面活性劑，還由于其生物相容性高，Pickering乳液的研究成為近十年的研究熱點(diǎn).而用于穩(wěn)定Pickering乳液的固體顆粒的研究之前都集中在二氧化鈦［2］等無機(jī)顆粒上.近年來，專注于食品級(jí)顆粒乳化劑的研究逐漸增多，如乳清蛋白微凝膠［3］、纖維素納米晶體［4］、高粱醇溶蛋白［5］和小麥醇溶蛋白［6］等.

玉米醇溶蛋白（zein，Z）具有兩親性，能夠自組裝成納米或微米大小的膠體.反溶劑得到的Z膠體顆粒過于疏水，用于穩(wěn)定Pickering乳液三天就發(fā)生了相分離［7］.Z與其他物質(zhì)復(fù)配成復(fù)合物顆粒是一種有效改善顆粒表面潤(rùn)濕性的方法.Z與單寧酸通過氫鍵復(fù)合的顆粒能夠穩(wěn)定Pickering乳液膠［8］.Z與果膠通過相互作用復(fù)合的顆粒能夠穩(wěn)定高內(nèi)相Pickering乳液［9］.魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，K）是一種具有表面活性的天然陰離子多糖，其水溶性好，具有良好的凝膠性和增稠性，K在胃液中難以被消化［10］，生物可降解性能高，是一種對(duì)環(huán)境友好的高分子材料.該文將Z與K復(fù)合成復(fù)合物顆粒乳化劑，用以穩(wěn)定食品級(jí)的Picker?ing乳液，探究其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性.

姜黃素在食品工業(yè)中常被作為天然色素，具有廣泛的食用和醫(yī)用價(jià)值，具有抗氧化性，能夠改善心血管功能［11］.但姜黃素的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，并且在水中溶性差，姜黃素在人體生理?xiàng)l件下不穩(wěn)定、在腸道中吸收少、在體內(nèi)代謝迅速，生物利用度低，限制了疏水性活性物質(zhì)姜黃素在口服藥物中的廣泛應(yīng)用，因此構(gòu)建兼具食用安全和良好性能的輸送載體勢(shì)在必行.近年來通過固體顆粒將荷載姜黃素的液態(tài)油包裹的方法極具前景.固體顆粒將液態(tài)的分散油滴首尾相連聚集在一起的同時(shí)，能夠保護(hù)液態(tài)油脂中荷載的活性物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)不受外部環(huán)境的影響［12］.Pickering乳液在荷載疏水性功能活性物質(zhì)方面較傳統(tǒng)乳液更具優(yōu)勢(shì)［13］，乳液中油水之間顆粒界面層的存在為活性物質(zhì)提供了良好的物理屏障［14］.該文將姜黃素溶解在油相中，研究Z/K復(fù)合顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液對(duì)活性物質(zhì)姜黃素的保護(hù)作用.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白，牛膽汁，脂肪酶，胰酶和姜黃素（純度98%）均購自SIGMA公司.

甲醇，乙腈均為色譜純.

其他試劑均為分析純.

玉米油（福臨門，中糧佳悅有限公司），購于當(dāng)?shù)爻?

1.2 儀器與設(shè)備

T25高速分散機(jī) 德國IKA公司

T10高速分散機(jī) 德國IKA公司

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司

C40納米光度計(jì) 德國Implen公司

液相高效色譜儀 美國安捷倫公司

1.3 方法

1.3.1 Z/K復(fù)合顆粒的制備

采用反溶劑沉淀法［9］制備Z/K復(fù)合顆粒，首先將Z溶于70%（v/v）乙醇溶液，K溶于1%（v/v）冰乙酸溶液，在T25高速分散機(jī)攪拌（6000rpm，4min）的條件下，將Z的乙醇溶液逐滴滴入K的冰乙酸溶液中，然后45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到Z含量2%的Z/K復(fù)合顆粒溶液，低溫保存.以Z/K質(zhì)量比=10：1，4：1，2：1，4：3，1：1（w/w）制備一系列的Z/K復(fù)合顆粒.

1.3.2 Pickering乳液的制備

以玉米油為內(nèi)相，分別以Z/K質(zhì)量比=10：1，4：1，2：1，4：3，1：1（w/w）的Z/K復(fù)合顆粒分散體系為連續(xù)相，制備Pickering乳液，并標(biāo)記為Z1，Z2，Z3，Z4，Z5.油水比為 2：8（v/v），兩相混合，用 T10高速分散機(jī)14400rpm剪切2min，得到Pickering乳液Z1，Z2，Z3，Z4，Z5.

將姜黃素以1.13mg/mL的濃度溶于玉米油，以Z/K質(zhì)量比=2：1（w/w）的Z/K復(fù)合顆粒溶液為連續(xù)相，如上所述制備荷載姜黃素的Pickering乳液，標(biāo)記為zk-cur.

1.3.3 Pickering乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

將Z1，Z2，Z3，Z4，Z5在室溫下保存一段時(shí)間，并在其儲(chǔ)藏0天、儲(chǔ)藏1天和儲(chǔ)藏110天的時(shí)候拍照，通過乳液外觀的變化來檢測(cè)其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性.

1.3.4 體外模擬胃腸消化

1.3.4.1 體外模擬胃消化

取zk-cur（包含1 mL荷載姜黃素的玉米油）5 mL溶解到10 mL模擬胃液（包含20 mg NaCl，pH調(diào)節(jié)為2.0）中，加入10 mL胃蛋白酶溶液（包含96mg胃蛋白酶，用模擬胃液溶解），在37℃水浴恒溫?fù)u床中持續(xù)震蕩1 h，用NaOH將pH值調(diào)節(jié)為7.0以終止胃消化.

1.3.4.2 體外模擬腸消化與游離脂肪酸的計(jì)算

經(jīng)過體外模擬胃消化后，在體外模擬胃消化液中加入60 mL模擬腸液（包含0.4206 g氯化鈉和0.0666 g氯化鈣，pH 7.00），40 mL膽鹽溶液（包含2.0000 g膽鹽），20 mL胰液（包含0.4800 g胰酶）和20 mL脂肪酶溶液（含0.7200 g脂肪酶）消化2小時(shí)，記錄游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）的釋放情況［6］.

根據(jù)式（1）計(jì)算模擬消化過程中的游離脂肪酸（FFA，F(xiàn)ree Fatty Acid）的釋放量.

式（1）中，Mtriglycerides為脂肪的平均分子質(zhì)量（g/mol）

VNaOH為模擬小腸消化時(shí)間為t時(shí)消耗NaOH溶液的體積（mL）

CNaOH為滴定用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的濃度（mol/L）

1.3.4.3 生物利用度的測(cè)定與計(jì)算

消化液離心30分鐘（40000 rpm，4 ℃）［15］.收集膠束中間層，用高效液相色譜法［14］評(píng)價(jià)姜黃素的生物利用度.荷載姜黃素的玉米油（1.13 mg/mL）和Tween 20乳液（2%Tween 20溶液：含姜黃素的玉米油=8：2）為對(duì)照.

液相條件：流動(dòng)相為乙腈：超純水=55：45（v/v），流速為1 mL/min.

根據(jù)式（2）計(jì)算模擬消化后姜黃素的生物利用度.

式（2）中，Ccur指離心后上清液中姜黃素濃度；

Vcur指上清液體積；

mcur指納米顆粒中姜黃素的質(zhì)量

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)三次，通過軟件Excel 2010進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 Pickering乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性某種程度上決定了產(chǎn)品最終能否被使用，破乳、漏油、乳析等不穩(wěn)定狀態(tài)對(duì)于乳液產(chǎn)品來說是不好的.圖1展示的是新制、存儲(chǔ)1天、存儲(chǔ)110天的Z/K復(fù)合顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液狀態(tài).Z1和Z2（即Z/K=10：1，4：1）在儲(chǔ)存一天之后就發(fā)生了乳析，并在110天的儲(chǔ)存過程中，乳析程度又逐漸加大的趨勢(shì)，而其他乳液（Z3、Z4、Z5）則狀態(tài)穩(wěn)定，甚至到第110天均沒有出現(xiàn)破乳、漏油和乳析的狀況.說明Z/K復(fù)合顆粒在K的含量不夠的情況下，是不足以長(zhǎng)期有效地穩(wěn)定Pickering乳液的.該研究中的Z/K復(fù)合顆粒溶液的pH值均在3.0左右，Z的等電點(diǎn)大于pH 3.0，Z在顆粒溶液中帶正電.在廣泛的pH范圍內(nèi)，K表現(xiàn)為弱的負(fù)電荷.在剪切力的輔助下，K吸附在Z表面，并通過靜電相互作用形成復(fù)合物膠體.

2.2 體外模擬胃腸消化

為了探討Z/K復(fù)合顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液在體外模擬胃腸消化過程中的作用，荷載了姜黃素的Z/K復(fù)合顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液（zk-cur）、玉米油（oilcur）和Tween 20 穩(wěn)定的乳液（tween20-cur）加入至模擬胃液和腸液中分別和胃蛋白酶、脂肪酶、胰酶反應(yīng).圖2記錄的是三種體系在模擬腸消化過程中的FFA的釋放情況.開始消化后20 min內(nèi)，F(xiàn)FA釋放率以oil-cur、tween20-cur、zk-cur的順序遞增.隨著消化時(shí)間的持續(xù)，三種體系的FFA釋放率均逐漸增加，腸消化2小時(shí)后 FFA 釋放率以 91.56±4.62%（oil-cur）＞ 55.05±7.09%（zk-cur）＞ 46.87±5.56%（tween20-cur）的順序遞減.在剛開始消化的時(shí)候，玉米油的油水界面面積最小，隨著消化過程的持續(xù)，玉米油在模擬消化液體系中表面活性成分如膽鹽等影響，分散成小油滴，胰酶和脂肪酶能夠直接吸附到其幾乎裸露的油水界面與油脂反應(yīng)，因此后來居上，油脂降解程度最高；在Z/K復(fù)合顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液中，Z/K顆粒界面層的存在阻礙了胰酶和脂肪酶與油脂接觸的作用，因此FFA的釋放率比玉米油低；在消化過程中Tween 20穩(wěn)定的乳液中的Tween 20與膽鹽等表面活性劑存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，共同組成了一個(gè)復(fù)雜的乳液體系，隨著消化產(chǎn)物等也不斷加入到競(jìng)爭(zhēng)的行列，共同競(jìng)爭(zhēng)油水界面層，胰酶和脂肪酶與油脂接觸變少，最終表現(xiàn)出較小的FFA釋放率.

在腸消化的過程中，脂解產(chǎn)物如FFA、單?；视秃投；视团c膽鹽和磷脂形成混合膠束.混合膠束的非極性區(qū)域使姜黃素溶解［16］，小的混合膠束可將姜黃素轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮細(xì)胞吸收，使姜黃素具有生物利用度.由于離子強(qiáng)度和pH環(huán)境的影響，姜黃素在模擬腸液中的降解速度較快［17］.油水界面性質(zhì)是影響姜黃素生物利用度的重要因素［18］.經(jīng)過模擬胃消化1小時(shí)和模擬腸消化2小時(shí)后，姜黃素的生物利用度以5.87±0.94%（oil-cur）＜ 8.84±0.32%（tween20-cur）＜ 9.81±0.24%（zk-cur）的順序逐漸增加.玉米油的數(shù)據(jù)比2.13±0.24%［6］高，這可能是由于FFA釋放量較高（91.56%比近45%［6］高）.在相同的輸送體系中，F(xiàn)FA的釋放量越大，姜黃素的生物利用度越高［5］.姜黃素作為疏水性生物活性物質(zhì)，乳液體系中的姜黃素生物利用度明顯高于玉米油.由于Z/K復(fù)合顆粒在油水界面的不可逆吸附［19］，Pickering乳液體系比表面活性劑體系（Tween 20穩(wěn)定的乳液）具有更好的對(duì)姜黃素的保護(hù)作用.

圖1 Zein/konjac glucomannan穩(wěn)定的Pickering乳液

圖2 模擬腸消化過程中Z/K制備的Pickering乳液、玉米油、Tween 20制備的乳液的FFA釋放率

3 結(jié)論

圖3 模擬腸消化過程中Z/K制備的Pickering乳液、玉米油、Tween 20制備的乳液的姜黃素的生物利用度

該研究證明了Z/K復(fù)合顆粒能夠穩(wěn)定Pickering乳液，并分析Z/K復(fù)合顆粒是由Z與K通過靜電相互作用結(jié)合而成.在研究中，當(dāng)Z/K質(zhì)量比=2：1，4：3，1：1（w/w）時(shí)，Z/K復(fù)合顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液可以穩(wěn)定存在110天.荷載了姜黃素Z/K質(zhì)量比=2：1（w/w）的Z/K復(fù)合顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液、荷載姜黃素的玉米油和Tween20穩(wěn)定的乳液一起進(jìn)入模擬胃腸消化.經(jīng)過1小時(shí)的體外模擬胃消化和2小時(shí)的體外模擬腸消化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)油脂水解程度與姜黃素的利用度和所在體系有很密切的關(guān)系，F(xiàn)FA釋放率以91.56±4.62%（玉米油）＞55.05±7.09%（Z/K復(fù)合顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液）＞46.87±5.56%（Tween20穩(wěn)定的乳液）的順序遞減，姜黃素的生物利用度以5.87±0.94%（玉米油）＜8.84±0.32%（Z/K質(zhì)量比=2：1，4：3，1：1（w/w）時(shí)，Z/K復(fù)合顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液）＜9.81±0.24%（Z/K復(fù)合顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液）的順序逐漸增加.也就是說zk-cur具有比玉米油和Tween20穩(wěn)定的乳液更高的生物利用度.這可能是因?yàn)閆/K復(fù)合顆粒在油滴周圍形成相對(duì)固定的界面層，對(duì)油滴以及荷載在油滴上的活性物質(zhì)姜黃素都具有保護(hù)作用.該研究將疏水的生物活性物質(zhì)姜黃素包埋在Pickering乳液中，為活性物質(zhì)在口服藥物的應(yīng)用中提供理論依據(jù)，并促進(jìn)了Pickering乳液在食品、醫(yī)藥、化妝品、保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展.