基于單細(xì)胞靶向測序探究基因堿基突變的方法

趙利楠，王娜，楊國良，蘇現(xiàn)斌，韓澤廣

技術(shù)與方法

基于單細(xì)胞靶向測序探究基因堿基突變的方法

趙利楠1，王娜1，楊國良2，蘇現(xiàn)斌1，韓澤廣1

1. 上海交通大學(xué)，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 200240 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院泌尿科，上海 200127

分析基因堿基突變是探究腫瘤細(xì)胞克隆演化的研究方法之一。目前，常取組織不同區(qū)域的群體細(xì)胞測序，基于群體水平的基因堿基突變頻率等信息繪制出腫瘤的克隆演化過程。但是，該方法易遺失低頻突變，并且組織群體細(xì)胞類型不單一，不能代表特定細(xì)胞群體的克隆演化過程。本研究以前列腺基底細(xì)胞癌(prostate basal cell carcinoma, BCC)為例，建立了一種探究腫瘤單細(xì)胞的基因堿基突變方法，實(shí)現(xiàn)了基于單細(xì)胞基因堿基突變分析腫瘤細(xì)胞的克隆演化過程。首先通過HepG2細(xì)胞優(yōu)化了單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增方法，其次用Fluidigm公司的微流控芯片捕獲BCC單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，然后通過外顯子組測序獲得和基因堿基突變信息。通過單細(xì)胞靶向擴(kuò)增和Sanger測序，成功在BCC單細(xì)胞中檢測到和基因堿基突變信息。本研究建立的方法為腫瘤細(xì)胞的克隆演化研究提供了一種可靠的技術(shù)方案。

腫瘤細(xì)胞；基因堿基突變；克隆演化；單細(xì)胞

腫瘤組織內(nèi)部除了含有血管、基質(zhì)細(xì)胞和浸潤的免疫細(xì)胞外，還包含具有不同遺傳變異的腫瘤細(xì)胞，故而腫瘤是一種高度異質(zhì)性的疾病[1,2]。此外，腫瘤在形成過程中，其內(nèi)部的腫瘤細(xì)胞因含有不同的突變組合而形成不同的亞克隆群體，且克隆群體會不斷進(jìn)化以適應(yīng)環(huán)境[3]。遺傳異質(zhì)性結(jié)合表觀遺傳異質(zhì)性等因素會引起腫瘤細(xì)胞的表型異質(zhì)性，進(jìn)而形成了不同腫瘤細(xì)胞對治療的反應(yīng)或本身的轉(zhuǎn)移能力不同，最終導(dǎo)致抗藥性或復(fù)發(fā)[4]。為此，揭示腫瘤內(nèi)部的克隆結(jié)構(gòu)演變規(guī)律，將有助于理解其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為今后癌癥患者的個性化治療提供理論基礎(chǔ)。

目前，研究腫瘤組織內(nèi)部細(xì)胞克隆結(jié)構(gòu)演化的方法之一是對不同區(qū)域取樣進(jìn)行群體水平的外顯子測序，通過檢測基因突變的發(fā)生頻率(variant allele frequency, VAF)從而探索腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展過程[5,6]。該方法存在的不足之處在于，群體細(xì)胞中不僅含有腫瘤細(xì)胞，而且同時混有其他類型細(xì)胞，這很容易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中特有的所占比重較少的突變信息被掩蓋[7]。單細(xì)胞全外顯子測序可以有效解決這一問題，但考慮到測序成本問題一般難以大規(guī)模應(yīng)用，部分研究者以單細(xì)胞靶向測序作為替代方案[8~10]。

利用單細(xì)胞靶向測序技術(shù)，本研究建立了一種優(yōu)化的有效靶向分析大規(guī)模單細(xì)胞中特定堿基突變的方法。通過結(jié)合組織酶解方法、微流控單細(xì)胞分離、多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplifica-tion, MDA)、外顯子組測序和單細(xì)胞靶向擴(kuò)增技術(shù)組建了探究腫瘤單細(xì)胞水平基因堿基突變的方法。首先以HepG2細(xì)胞為例優(yōu)化MDA技術(shù)，并將建立的方法應(yīng)用到一例人類前列腺基底細(xì)胞癌(prostate ba-sal cell carcinoma, BCC)患者的腫瘤樣本，通過對混合單細(xì)胞樣品全外顯子測序結(jié)果分析找到BCC腫瘤細(xì)胞中存在的克隆堿基突變點(diǎn)，并在單細(xì)胞水平上通過靶向擴(kuò)增及Sanger測序驗證該突變的存在，從而為繪制腫瘤細(xì)胞克隆演化過程奠定基礎(chǔ)(圖1)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

HepG2肝細(xì)胞癌細(xì)胞系來自ATCC。人類前列腺基底細(xì)胞癌(prostate basal cell carcinoma, BCC)樣本來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院。

1.2 單細(xì)胞懸液的制備

組織樣本用剪刀剪碎，加入膠原酶IV于37℃孵育30~120 min，經(jīng)70 μm濾膜除去消化不完全組織和裂解紅細(xì)胞后以100離心5 min，再進(jìn)行洗滌重懸獲得單細(xì)胞懸液。制備的單細(xì)胞懸液經(jīng)計數(shù)及細(xì)胞直徑測量后用于后續(xù)的單細(xì)胞分離、捕獲、基因組擴(kuò)增、生物信息分析和靶基因擴(kuò)增及驗證等。

1.3 單細(xì)胞捕獲及全基因組擴(kuò)增

單細(xì)胞由美國Fluidigm公司的C1芯片捕獲，單次最多可捕獲96個單細(xì)胞。單個細(xì)胞的DNA不易于目的基因的擴(kuò)增，采用MDA技術(shù)對芯片捕獲到的單細(xì)胞進(jìn)行全基因組放大可以有效用于靶向擴(kuò)增。

1.4 外顯子組測序與基因堿基突變分析

C1芯片捕獲單個BCC細(xì)胞后，首先完成單細(xì)胞的全基因組放大，再分別吸取2 μL單細(xì)胞的基因組放大產(chǎn)物進(jìn)行混合，可獲得單細(xì)胞水平的群體基因產(chǎn)物樣本。將捕獲到的BCC單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物混合樣品進(jìn)行外顯子組測序(whole exome sequencing, WES) (測序深度~200×)[11]，且測序數(shù)據(jù)采用本課題組構(gòu)建的分析流程處理獲得基因突變列表[12]。測序數(shù)據(jù)已上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫，登錄號：PRJNA607168，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/ PRJNA607168。

圖1 單細(xì)胞水平靶向檢測腫瘤基因堿基突變的技術(shù)流程

A：腫瘤組織單細(xì)胞分離和單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增；B：取等體積腫瘤單細(xì)胞基因組放大產(chǎn)物獲得混合樣品；C：混合基因組產(chǎn)物進(jìn)行全外顯子測序經(jīng)生物信息分析獲得基因堿基突變列表；D：選取目的基因并根據(jù)堿基突變位點(diǎn)設(shè)計引物，以腫瘤單細(xì)胞基因組產(chǎn)物為模板進(jìn)行靶向擴(kuò)增和測序；E：基于單細(xì)胞堿基突變信息繪制腫瘤細(xì)胞的克隆演化過程。

1.5 引物序列與合成

利用Primer3網(wǎng)站設(shè)計引物，用于擴(kuò)增檢測基因第35213742位堿基和基因第17084321位堿基的突變情況。引物設(shè)計原則是：在堿基突變位點(diǎn)的上下游約100 bp設(shè)計引物。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計基因的實(shí)時熒光定量PCR (quantitative real time PCR, q-PCR)引物。本文所使用引物的相關(guān)信息如表1所示。

1.6 目的基因靶向擴(kuò)增與測序分析

通過對混合樣品的全外顯子測序數(shù)據(jù)分析獲得突變基因列表信息，選取目的基因和進(jìn)行單細(xì)胞靶向擴(kuò)增與測序分析驗證。以BCC單細(xì)胞基因組擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用設(shè)計的基因引物分別擴(kuò)增目的片段即包含基因第35213742位堿基和基因第17084321位堿基。

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果判斷擴(kuò)增效果，然后將每3個單細(xì)胞的目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物混合一起，進(jìn)行Sanger測序。通過將測序片段序列與目的基因的匹配參考片段序列比對，若發(fā)現(xiàn)目的基因的特定位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，則分別將該樣品的3個單細(xì)胞靶向擴(kuò)增產(chǎn)物送去Sanger測序，最終確定基因堿基突變具體發(fā)生在哪些單細(xì)胞中。

表1 引物序列信息

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析均由 GraphPad Prism 6.0 軟件完成統(tǒng)計并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增條件優(yōu)化及驗證

2.1.1 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增條件優(yōu)化

MDA技術(shù)是一種進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增放大的方法，它能對全基因組進(jìn)行高保真的均勻擴(kuò)增，擴(kuò)增出10~100 kb大小的片段，常用于單堿基變異(single nucleotide variation, SNV)分析研究腫瘤克隆結(jié)構(gòu)[13~15]。但是MDA技術(shù)也有一些缺點(diǎn)，特別是顯著的非特異擴(kuò)增，空白對照也會產(chǎn)生核酸產(chǎn)物。

此前有報道通過紫外光照射可以有效消除試劑及外界環(huán)境中的外源核酸污染[16,17]，為確定最適且有效降低外源核酸污染的紫外光照射時間，本研究以試劑盒中g(shù)DNA (人基因組DNA)為擴(kuò)增模板即實(shí)驗組，等體積純凈水為空白對照組進(jìn)行MDA技術(shù)優(yōu)化實(shí)驗。通過紫外光照射MDA試劑0 min、15 min、30 min、60 min探索減少非特異性核酸擴(kuò)增的最佳條件。結(jié)果顯示，實(shí)驗組的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于空白對照組(圖2A)，并且當(dāng)用紫外光照射MDA相關(guān)試劑30 min時，可以有效顯著地減少非特異性核酸擴(kuò)增(圖2B)。

2.1.2 HepG2單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增

通過對HepG2單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增驗證優(yōu)化條件的準(zhǔn)確性，首先將HepG2細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，并以166~250 cells/μL的濃度加入C1芯片進(jìn)行單細(xì)胞捕獲。單次C1芯片具有96個單細(xì)胞捕獲小室，可制備96個單細(xì)胞。為避免C1芯片細(xì)胞小室捕獲到多個細(xì)胞，利用較低的起始細(xì)胞密度，并通過顯微鏡觀察確認(rèn)每個小室捕獲到單個細(xì)胞，本次共捕獲到47個HepG2單細(xì)胞。

隨后將經(jīng)紫外光照射30 min后的MDA試劑輸入C1芯片的單細(xì)胞捕獲小室進(jìn)行核酸擴(kuò)增，利用Qubit測得每個單細(xì)胞捕獲小室的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物濃度(圖3A)。擴(kuò)增結(jié)果顯示捕獲到單細(xì)胞的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物濃度(有細(xì)胞組)顯著性高于無單細(xì)胞存在的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物濃度(無細(xì)胞組) (圖3B)。本研究選取人類內(nèi)參基因設(shè)計引物，利用 q-PCR對有細(xì)胞組和無細(xì)胞組基因的核酸模板量進(jìn)行分析。擴(kuò)增曲線結(jié)果顯示，無細(xì)胞組的q-PCR反應(yīng)結(jié)束后無擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，可能是由于無細(xì)胞組的核酸濃度偏低或者模板為降解的核酸片段導(dǎo)致(圖3C)。以上實(shí)驗結(jié)果證實(shí)，本研究優(yōu)化的MDA方法可以顯著的降低外源核酸的干擾，并對單細(xì)胞基因組進(jìn)行有效的擴(kuò)增。

圖2 通過紫外照射降低外源核酸污染對MDA擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化

A：MDA擴(kuò)增結(jié)果，gDNA表示人基因組DNA為模板，NTC表示以等體積水為模板；B：紫外光(UV)照射MDA試劑不同時間段非特異性擴(kuò)增結(jié)果。***<0.001；：表明無顯著差異。

圖3 HepG2單細(xì)胞全基因組放大結(jié)果

A：HepG2單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物核酸濃度(ng/μL)，灰色背景：有細(xì)胞(47個孔)，白色背景：無細(xì)胞(49個孔)；B：有細(xì)胞組(HepG2)與無細(xì)胞組(Control)核酸濃度比較；C：基因q-PCR擴(kuò)增曲線圖結(jié)果展示。***<0.001。

2.2 BCC單細(xì)胞的全基因組擴(kuò)增和堿基突變分析

2.2.1 BCC單細(xì)胞捕獲及全基因組擴(kuò)增

將計劃進(jìn)行單細(xì)胞分析的BCC組織剪碎，用膠原酶 IV 處理并通過膜過濾、離心及細(xì)胞重懸獲得單細(xì)胞懸液(圖4A)。利用C1芯片同樣以166~ 250 cells/μL的濃度對細(xì)胞懸液進(jìn)行單細(xì)胞捕獲(圖4B)。本次捕獲到53個BCC單細(xì)胞，且在顯微鏡下觀看Fluidigm C1芯片捕獲到的單細(xì)胞大部分形態(tài)正常，加入紫外光照射處理的MDA試劑進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增，保證有效減少非特異性核酸擴(kuò)增的干擾。最后通過Qubit測得每個單細(xì)胞的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物濃度，結(jié)果顯示捕獲到BCC單細(xì)胞的基因組被成功擴(kuò)增放大(圖4C)，而擴(kuò)增產(chǎn)物濃度的差異可能由于裂解或擴(kuò)增效率不同造成。

2.2.2 BCC外顯子組測序及生物信息分析

分別吸取擴(kuò)增的BCC單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物各2 μL混合，并開展外顯子組測序(測序深度~ 200×)[11]。測序數(shù)據(jù)用本課題組構(gòu)建的成熟分析流程處理，以Burrows-WheelerAligner (BWA) 進(jìn)行序列比對，以Genome Analysis Toolkit (GATK)檢測遺傳變異，以 SnpEff 對遺傳變異進(jìn)行注釋，最后獲得突變基因列表[18~20]。通過生物信息分析發(fā)現(xiàn)和基因均發(fā)生堿基突變(表2)，且測序深度為281×，測序深度為493×。

2.2.3 靶向擴(kuò)增及Sanger測序驗證

為了在單細(xì)胞水平進(jìn)一步驗證混合樣品外顯子組測序發(fā)現(xiàn)的基因堿基突變點(diǎn)，分別以每個BCC單細(xì)胞全基因組為模板，利用PCR對和基因進(jìn)行引物擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示分別成功擴(kuò)增出43個和44個BCC單細(xì)胞的和基因目的條帶(圖5A，圖6A)。

圖4 BCC單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增

A：BCC單細(xì)胞懸液；B：C1芯片捕獲BCC單細(xì)胞；C：BCC單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物濃度(ng/μL)。

表2 基因突變信息

按順序?qū)U(kuò)增產(chǎn)物每3個樣品取等體積混合一起作為一個樣品進(jìn)行Sanger測序。測序結(jié)果顯示基因擴(kuò)增產(chǎn)物的第5個混合樣品中基因第35213742位堿基有較高的C→T突變，但第6個混合樣品的相同位點(diǎn)沒有突變發(fā)生(圖5B)。為了進(jìn)一步在單細(xì)胞水平驗證，分別將混合樣品的3個單細(xì)胞目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，測序圖譜顯示第5個混合樣品的第2個BCC單細(xì)胞(4A)發(fā)生C→T突變，而第6個混合樣品的第1個BCC單細(xì)胞(4C)基因第35213742位堿基未發(fā)生堿基突變(圖5C)。

同時，本研究也檢測到基因擴(kuò)增產(chǎn)物的第6個混合樣品中基因第17084321位堿基發(fā)生A→G突變，但第4個混合樣品的相同位點(diǎn)沒有突變發(fā)生(圖6B)。單細(xì)胞測序結(jié)果顯示，第6個混合樣品的第3個BCC單細(xì)胞(5A)發(fā)生A→G突變，而第4個混合樣品的第1個BCC單細(xì)胞(3A)未發(fā)生堿基突變(圖6C)。

為了排除本文檢測到的基因堿基突變由基因靶向擴(kuò)增和Sanger測序過程引入，進(jìn)一步觀察其他兩個單細(xì)胞的目的基因堿基突變情況，發(fā)現(xiàn)基因在Mix-5-1-細(xì)胞，基因在Mix-6-其他兩個單細(xì)胞中的特定位點(diǎn)堿基也分別發(fā)生相同突變，但它們相互對照無突變組的其他兩個單細(xì)胞沒有發(fā)生突變(附圖1，附圖2)。同時，考慮到基因靶向擴(kuò)增和Sanger測序過程引入堿基突變是隨機(jī)的，因此同時在多個單細(xì)胞中同時引入特定位點(diǎn)相同堿基突變的可能性不大。以上結(jié)果說明基于單細(xì)胞水平靶向擴(kuò)增與測序，本研究建立的方法可以有效檢測腫瘤單細(xì)胞水平的基因堿基突變。

圖5 SCUBE3基因靶向擴(kuò)增結(jié)果和Sanger測序圖譜

A：基因靶向擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果。泳道1A~12A：BCC單細(xì)胞96孔板位置編號；M：DL1000 marker。B、C：基因靶向擴(kuò)增產(chǎn)物Sanger測序圖譜。Mix-X-Y-基因：Mix代表3個BCC單細(xì)胞目的基因靶向擴(kuò)增產(chǎn)物混合樣品，X代表混合樣品的排序號，Y代表混合樣品中BCC單細(xì)胞的排序號。

3 討論

腫瘤內(nèi)部的高度異質(zhì)性是導(dǎo)致高致死率和耐藥性的一個關(guān)鍵因素[21]。因此，在單細(xì)胞水平探究腫瘤內(nèi)部的克隆演化可以有效地幫助人們了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為腫瘤的早期診斷和干預(yù)提供理論基礎(chǔ)。隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的出現(xiàn)，在單細(xì)胞水平分析腫瘤的演變過程可以提高人們對腫瘤內(nèi)部細(xì)胞克隆亞群的了解，但測序成本限制了單細(xì)胞測序技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用。針對上述問題，本研究基于單細(xì)胞靶向擴(kuò)增和測序技術(shù)建立探究腫瘤單細(xì)胞水平基因堿基突變的方法，其優(yōu)點(diǎn)在于：(1)可以減少研究樣本中低頻突變的損失；(2)可以靶向分析大規(guī)模單細(xì)胞中特定點(diǎn)突變；(3)有效降低外源核酸非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。

目前，單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增有多種方法，MDA由于使用的Phi29聚合酶具有3?→5?的外切酶活性及校正功能，是所有擴(kuò)增方法中公認(rèn)的保真性最好和最適合進(jìn)行點(diǎn)突變檢測的方法[22~25]。本研究所使用的人類BCC單細(xì)胞MDA擴(kuò)增產(chǎn)物的混合全外顯子組測序分析顯示突變的VAF數(shù)值在0.5左右波動[11]，說明MDA過程中不太可能通過非特異擴(kuò)增丟失關(guān)鍵的突變，但有可能影響細(xì)胞突變頻率低的突變。同時，本研究展示的BCC單細(xì)胞基因和基因的Sanger測序圖譜中除突變點(diǎn)外的其他位點(diǎn)可作為技術(shù)對照，證明MDA擴(kuò)增過程沒有引入非特異的假陽性突變。此外，已有研究表明紫外光照射60 min可以有效降低MDA擴(kuò)增試劑中殘留DNA的污染[26]，本研究對MDA的條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗結(jié)果提示紫外光照射MDA試劑30 min為最佳條件。分析實(shí)驗結(jié)果產(chǎn)生差異的原因可能是：(1)不同批次單細(xì)胞擴(kuò)增試劑中殘留的DNA污染量不同。Woyke 等[26]以DNA進(jìn)行條件優(yōu)化，而本研究以illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, 25660031)中自帶gDNA (人基因組DNA)進(jìn)行條件優(yōu)化；(2)實(shí)驗操作流程或者環(huán)境中的DNA污染濃度不同。本研究以肝癌細(xì)胞系HepG2為例進(jìn)一步驗證了MDA優(yōu)化條件的可靠性，結(jié)果依舊支持本文所得結(jié)論，即紫外光照射MDA試劑30 min可以有效減少外源核酸非特異性擴(kuò)增的影響(圖3B)。以上結(jié)果提示，紫外光照射MDA試劑主要是為了去除擴(kuò)增試劑中或環(huán)境中的DNA污染，與單細(xì)胞類型關(guān)系不大。

圖6 MST1L基因靶向擴(kuò)增結(jié)果和Sanger測序圖譜

A：基因靶向擴(kuò)增結(jié)果，泳道1A~12A：BCC單細(xì)胞96孔板位置編號，M：DL1000 marker；B~C：基因靶向擴(kuò)增產(chǎn)物Sanger測序圖譜，Mix-X-Y-基因：Mix代表3個BCC單細(xì)胞目的基因靶向擴(kuò)增產(chǎn)物混合樣品，X代表混合樣品的排序號，Y代表混合樣品中BCC單細(xì)胞的排序號。

本研究建立的基于微流控芯片MDA技術(shù)、全外顯子測序和Sanger測序技術(shù)相結(jié)合的方法可以有效針對腫瘤單細(xì)胞進(jìn)行基因點(diǎn)突變檢測，有助于腫瘤異質(zhì)性問題的研究。另外，本研究所建立的方法可以結(jié)合流式分選等技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞類型挑選(腫瘤細(xì)胞、腫瘤干/祖細(xì)胞等)，可以有效地避免因其他類型細(xì)胞的干擾降低對低頻突變的檢測，有利于對特定細(xì)胞群體的克隆演化過程進(jìn)行探索。此外，該方法可以通過擴(kuò)大樣本量，例如設(shè)計帶有細(xì)胞標(biāo)簽的靶向擴(kuò)增引物并結(jié)合第二代測序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)高通量的靶向分析大規(guī)模單細(xì)胞中的特定點(diǎn)突變以達(dá)到對腫瘤克隆結(jié)構(gòu)進(jìn)行重構(gòu)的目的，為腫瘤克隆演化的研究提供了切實(shí)可行的方案。

附錄：

附圖詳見文章電子版www.chinagen.cn。

[1] Terry S, Buart S, Chouaib S. Hypoxic stress-induced tumor and immune plasticity, suppression, and impact on tumor heterogeneity., 2017, 8: 1625.

[2] Junttila MR, de Sauvage FJ. Influence of tumour micro- environment heterogeneity on therapeutic response., 2013, 501(7467): 346–354.

[3] Greaves M, Maley CC. Clonal evolution in cancer., 2012, 481(7381): 306–313.

[4] Marusyk A, Almendro V, Polyak K. Intra-tumour heterogeneity: a looking glass for cancer?, 2012, 12(5): 323–334.

[5] Gerlinger M, Rowan AJ, Horswell S, Math M, Larkin J, Endesfelder D, Gronroos E, Martinez P, Matthews N, Stewart A, Tarpey P, Varela I, Phillimore B, Begum S, Mcdonald NQ, Butler A, Jones D, Raine K, Latimer C, Santos CR, Nohadani M, Eklund AC, Spencer-Dene B, Clark G, Pickering L, Stamp G, Gore M, Szallasi Z, Downward J, Futreal PA, Swanton C. Intratumor hetero-geneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing., 2012, 366(10): 883–892.

[6] Brunner SF, Roberts ND, Wylie LA, Moore L, Aitken SJ, Davies SE, Sanders MA, Ellis P, Alder C, Hooks Y, Abascal F, Stratton MR, Martincorena I, Hoare M, Campbell PJ. Somatic mutations and clonal dynamics in healthy and cirrhotic human liver., 2019, 574(7779): 538–542.

[7] Zong CH, Lu SJ, Chapman AR, Xie XS. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell., 2012, 338(6114): 1622– 1626.

[8] Gawad C, Koh W, Quake SR. Dissecting the clonal origins of childhood acute lymphoblastic leukemia by single-cell genomics., 2014, 111(50): 17947–17952.

[9] Hou Y, Song LT, Zhu P, Zhang B, Tao Y, Xu X, Li FQ, Wu K, Liang J, Shao D, Wu HJ, Ye XF, Ye C, Wu RH, Jian M, Chen Y, Xie W, Zhang RR, Chen L, Liu X, Yao XT, Zheng HC, Yu C, Li QB, Gong ZL, Mao M, Yang X, Yang L, Li JX, Wang W, Lu ZH, Gu N, Laurie G, Bolund L, Kristiansen K, Wang J, Yang HM, Li YR, Zhang XQ, Wang J. Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-negative myeloproliferative neoplasm., 2012, 148(5): 873–885.

[10] Xu X, Hou Y, Yin XY, Bao L, Tang AF, Song TL, Li FQ, Tsang S, Wu K, Wu HJ, He WM, Zeng L, Xing MJ, Wu RH, Jiang H, Liu X, Cao DD, Guo GW, Hu XD, Gui YT, Li ZS, Xie WY, Sun XJ, Shi M, Cai ZM, Wang B, Zhong MM, Li JX, Lu ZH, Gu N, Zhang XQ, Goodman L, Bolund L, Wang J, Yang HM, Kristiansen K, Dean M, Li YR, Wang J. Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation characteristics of a kidney tumor., 2012, 148(5): 886–895.

[11] Su XB, Long Q, Bo JJ, Shi Y, Zhao LN, Lin YX, Luo Q, Ghazanfar S, Zhang C, Liu Q, Wang L, He KY, He J, Cui XF, Yang JYH, Han ZG, Yang GL, Sha JJ. Mutational and transcriptomic landscapes of a rare human prostate basal cell carcinoma., 2020, 80(6): 508–517.

[12] Huang J, Deng Q, Wang Q, Li KY, Dai JH, Li N, Zhu ZD, Zhou B, Liu XY, Liu RF, Fei QL, Chen H, Cai B, Zhou BP, Xiao HS, Qin LX, Han ZG. Exome sequencing of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma., 2012, 44(10): 1117–1121.

[13] Gunderson KL, Steemers FJ, Lee G, Mendoza LG, Chee MS. A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology., 2005, 37(5): 549–554.

[14] Wang Y, Waters J, Leung ML, Unruh A, Roh W, Shi XQ, Chen K, Scheet P, Vattathil S, Liang H, Multani A, Zhang H, Zhao R, Michor F, Meric-Bernstam F, Navin NE. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing., 2014, 512(7513): 155–160.

[15] Lasken RS. Genomic DNA amplification by the multiple displacement amplification (MDA) method., 2009, 37(Pt 2): 450–453.

[16] Gefrides LA, Powell MC, Donley MA, Kahn R. UV irradiation and autoclave treatment for elimination of contaminating DNA from laboratory consumables., 2010, 4(2): 89–94.

[17] Archer E, Allen H, Hopwood A, Rowlands D. Validation of a dual cycle ethylene oxide treatment technique to remove DNA from consumables used in forensic laboratories., 2010, 4(4): 239–243.

[18] Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data., 2014, 30(15): 2114–2120.

[19] Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform., 2009, 25(14): 1754–1760.

[20] Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth G, Abecasis G, Durbin R. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools., 2009, 25(16): 2078–2079.

[21] Feng RM, Zong YN, Cao SM, Xu RH. Current cancer situation in China: good or bad news from the 2018 Global Cancer Statistics?, 2019, 39(1): 22.

[22] L?hnemann D, K?ster J, Szczurek E, Mccarthy DJ, Hicks SC, Robinson MD, Vallejos CA, Campbell KR, Beeren-winkel N, Mahfouz A, Pinello L, Skums P, Stamatakis A, Attolini CS, Aparicio S, Baaijens J, Balvert M, Barbanson B, Cappuccio A, Corleone G, Dutilh BE, Florescu M, Guryev V, Holmer R, Jahn K, Lobo TJ, Keizer EM, Khatri I, Kielbasa SM, Korbel JO, Kozlov AM, Kuo TH, Lelieveldt B, Mandoiu II, Marioni JC, Marschall T, Molder F, Niknejad A, Raczkowski L, Reinders M, Ridder J, Saliba AE, Somarakis A, Stegle O, Theis FJ, Yang H, Zelikovsky A, Mchardy AC, Raphael B J, Shah SP, Sch?nhuth A. Eleven grand challenges in single-cell data science., 2020, 21(1): 31.

[23] Gawad C, Koh W, Quake SR. Single-cell genome sequencing: current state of the science., 2016, 17(3): 175–188.

[24] Huang L, Ma F, Chapman A, Lu SJ, Xie XS. Single-cell whole-genome amplification and sequencing: methodology and applications., 2015, 16: 79–102.

[25] Yao YX, La YF, Di R, Liu QY, Hu WP, Wang XY, Chu MX. Comparison of different single cell whole genome amplification methods and MALBAC applications in assisted reproduction., 2018, 40(8): 620–631.姚雅馨, 喇永富, 狄冉, 劉秋月, 胡文萍, 王翔宇, 儲明星. 不同單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增方法的比較及MALBAC在輔助生殖中的應(yīng)用. 遺傳, 2018, 40(8): 620–631.

[26] Woyke T, Sczyrba A, Lee J, Rinke C, Tighe D, Clingen-peel S, Malmstrom R, Stepanauskas R, Cheng JF. Decon-tamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification., 2011, 6(10): e26161.

附錄：

1、: Chr.6:35,213,612~35,213,872 Chr.6:35213742 C→T

AGGGTGTGTGTATGCGAAGGgggagcctttgtcagaatgattctcttgccctatacccccaccaccagctgtacagcccacgttctaggagggcttgggtagcctgccctgctgctctactgacctgctgcttgccttcccagcatccccatcctccattaccattatgagacctgccagacctacgagcgtcccattgccttcactgcccgttccaggaagctctggatcaACTTCAAGACAAGCGAGGCC

2、: Chr.1:17,084,143~17,084,429 Chr.1:17084321 A→G

TTACCCGTACCTGCAGTGAGgggaatggggagaaggagacggtcctggaggaagatccagggctgggcctcctggccaccagcagtcctgtgcactatgctcttacctttggtctcaccccagcctgcaatctcacacttggtccctgga

ggcaccacataccattcaggcggcaggcgatcagggccacacgctggttcagggtcacagatctttaacaagaatgggggcactcagggtctgaggccacaaggctcagccccaccTCACATCCTCCCAGGTTGTC

附圖1基因靶向擴(kuò)增結(jié)果和Sanger測序圖譜

Supplemental Fig. 1 Target Amplification and Sanger sequencing ofgene

基因靶向擴(kuò)增產(chǎn)物Sanger測序圖譜，Mix-X-Y-基因：Mix代表3個BCC單細(xì)胞目的基因靶向擴(kuò)增產(chǎn)物混合樣品，X代表混合樣品的排序號，Y代表混合樣品中BCC單細(xì)胞的排序號。

附圖2基因靶向擴(kuò)增結(jié)果和Sanger測序圖譜

Supplemental Fig. 2 Target Amplification and Sanger sequencing map ofgene

基因靶向擴(kuò)增產(chǎn)物Sanger測序圖譜，Mix-X-Y-基因：Mix代表3個BCC單細(xì)胞目的基因靶向擴(kuò)增產(chǎn)物混合樣品，X代表混合樣品的排序號，Y代表混合樣品中BCC單細(xì)胞的排序號。

A method for reliable detection of genomic point mutations based on single-cell target-sequencing

Linan Zhao1, Na Wang1, Guoliang Yang2, Xianbin Su1, Zeguang Han1

The analysis of genomic point mutations is one of the research strategies to explore the clonal evolution of tumor cells. At present, clonal evolution of tumor cells is mainly determined by bulk sampling and sequencing of different sections of the tumor. Since this approach analyzes a mixture of different cell types, it may not accurately represent the clonal evolution of specific tumor cell populations andlikelymiss low frequency mutations, especiallywhen the sequencing depths are not sufficient. To address this issue, we have developed a strategy to analyze genomic point mutations from prostate basal cell carcinoma (BCC) tissues at single-cell resolution. Firstly, we optimized the single-cell whole genome amplification procedure with HepG2 cells. Then the single cells from BCC tissue were captured by a microfluidic chip of Fluidigm and processed for whole-genome amplification. Bothandgenomic mutations were obtained by whole exome sequencing. Finally, we examined the genomic mutations through single-cell targeted amplification and Sanger sequencing. The established method successfully reconfirmed the mutations ofandin BCC at single cell level. The strategy established in this study could provide a useful tool for determining the clonal evolution of tumor cells based on genomic mutations at single-cell resolution.

tumor cell; mutation; clonal evolution; single-cell

2020-04-26;

2020-06-02

上海交通大學(xué)科技創(chuàng)新專項資金項目(編號：2019TPA09)和國家自然科學(xué)基金青年項目(編號：81802806)資助[Supported by Shanghai Jiao Tong University Scientific and Technological Innovation Funds (No. 2019TPA09), and the National Natural Science Foundation of China (No. 81802806)]

趙利楠，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：肝癌單細(xì)胞測序。E-mail: zlnsju2017@sjtu.edu.cn

韓澤廣，教授，研究方向：腫瘤(肝癌)發(fā)病機(jī)制研究和單細(xì)胞測序。E-mail: hanzg@sjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-046

2020/6/19 15:47:01

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200619.1449.001.html

(責(zé)任編委: 王曉群)