CRISPR/Cas9系統(tǒng)在林木基因編輯中的應(yīng)用

陳贏男，陸靜

綜 述

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在林木基因編輯中的應(yīng)用

陳贏男1,2，陸靜1,2

1. 南京林業(yè)大學(xué)，林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，南京 210037 2. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210037

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以對目標基因進行精確定點編輯，是目前公認的最有發(fā)展?jié)摿Φ幕蚓庉嫾夹g(shù)，并已在主要糧食及經(jīng)濟作物的精準育種方面發(fā)揮了重要作用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)也為林木基礎(chǔ)研究和分子育種帶來了新的途徑。近年來CRISPR/Cas9系統(tǒng)在林木遺傳研究中的應(yīng)用越來越廣泛，不僅實現(xiàn)了抗旱、抗病等林木新品種的培育，而且在調(diào)控木質(zhì)素合成和縮短林木育種周期等方面也展現(xiàn)了巨大潛力。本文詳細梳理了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在林木基因功能驗證及遺傳改良中的研究進展，并對未來需要完善的相關(guān)問題和發(fā)展趨勢進行了展望，以期為林木功能基因組研究和林木基因工程育種提供有益參考。

CRISPR/Cas9；基因編輯；林木；基因功能；遺傳改良

對基因組進行精確編輯和改造一直是分子生物學(xué)家不斷探究的技術(shù)難題，繼鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)技術(shù)之后，基于細菌成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)(clustered regularly interspaced short palin-dromic repeats, CRISPRs)序列開發(fā)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近幾年最為主流的基因編輯技術(shù)。與ZFN和TALEN技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)設(shè)計流程簡單、操作方便、基因編輯效率高，一經(jīng)開發(fā)就迅速在動物、植物和微生物中得到應(yīng)用。自2013年首次用于編輯模式植物擬南芥()和煙草()以來[1]，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已在24個屬45個科的植物中成功應(yīng)用[2]，在提高作物產(chǎn)量、改良作物品質(zhì)、培育抗病及抗脅迫新品種等領(lǐng)域都具有良好的應(yīng)用前景[3~5]。

林木具有世代周期長、遺傳雜合度高、基因組倍性復(fù)雜等生物學(xué)特點，長期以來林木遺傳改良進程緩慢。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)對林木基因功能研究和遺傳改良起到很大促進作用，本文對CRISPR/ Cas9系統(tǒng)在林木中的應(yīng)用進行了詳細梳理，并展望了未來需要解決的一些問題和發(fā)展趨勢，以期為林木功能基因組研究和林木基因工程育種提供參考。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在林木模式樹種中的應(yīng)用

楊樹是重要的短輪伐期工業(yè)用材樹種，也是木本植物遺傳研究的模式樹種，因此在楊樹中應(yīng)用基因編輯技術(shù)具有重要的應(yīng)用價值和理論意義。2015年，兩個研究團隊先后報道了利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在楊樹中實現(xiàn)內(nèi)源基因的定點突變：中國西南大學(xué)羅克明團隊成功敲除毛白楊(Carr.)八氫番茄紅素脫氫酶基因(phytoene desaturase gene,，編輯效率51.7%)，導(dǎo)致楊樹白化表型[6]；美國佐治亞大學(xué)Tsai團隊在種間雜種銀灰楊(×)中成功編輯4-香豆酸輔酶A連接酶基因和(突變效率達100%)，獲得莖稈呈紅褐色的突變體材料，并發(fā)現(xiàn)接近或位于PAM位點內(nèi)的SNP能完全抑制基因打靶作用，該研究提示：基因組高雜合度是在木本植物中應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)時必須考慮的重要因素[7]?；诔苫P(guān)鍵基因和，Elorriaga等[8]分析了CRISPR/ Cas9系統(tǒng)在楊樹中產(chǎn)生基因突變的類型和特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當目標基因中只有一個靶位點時，單堿基插入突變和小的缺失突變(1~3 bp)是較為普遍的突變類型；當目標基因中存在兩個靶位點時，產(chǎn)生大片段刪除突變的概率較高，同時有產(chǎn)生倒位突變的可能，但概率較低；但是，該研究未在楊樹中檢測到脫靶效應(yīng)。此外，Bruegmann等[9]利用等9個楊樹內(nèi)源基因，分析比較了不同sgRNA產(chǎn)生基因編輯的效率，他們認為高效sgRNA具備以下序列結(jié)構(gòu)特征：(1) GC含量在40%~60%之間；(2) sgRNA 3′末端的4個堿基最好都是嘌呤堿；(3)sgRNA序列中的種子序列(seed region, 18~20 nt)不形成二級結(jié)構(gòu)配對。最近，四川大學(xué)馬濤團隊以我國西北部地區(qū)主要造林樹種新疆楊()為研究對象，成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯了基因[10]，為利用基因工程培育新疆楊新品種提供了技術(shù)支撐。

到目前為止，楊樹是木本植物中CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展最為迅速的樹種，該系統(tǒng)在楊樹功能基因組研究和基因工程育種中都有著廣泛的應(yīng)用。例如，楊樹和基因敲除株系的分支數(shù)目比野生型均明顯增加，基因敲除株系更為顯著，且該株系在莖節(jié)處有異位葉片形成，說明這對直系同源基因雖然都參與調(diào)控楊樹側(cè)芽發(fā)生，但它們的表達模式和作用機制并不相同[11]；CRISPR/Cas9介導(dǎo)產(chǎn)生的同源基因四重突變體楊樹幾乎無法直立，解剖學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)突變體植株的木纖維細胞、韌皮纖維細胞和木射線薄壁細胞缺少次生細胞壁，證明這些基因在楊樹次生壁的形成中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[12]；敲除楊樹基因?qū)е律镔|(zhì)糖化和生物乙醇產(chǎn)量降低，該基因過表達能夠顯著提高酶解糖化率和糖醇轉(zhuǎn)化率，為培育新型生物能源樹種提供了參考[13]。本文對近年來CRISPR/Cas9系統(tǒng)在楊樹上的應(yīng)用進行了歸類總結(jié)(表1)。根據(jù)表1中的研究報道，楊樹中實施基因編輯的技術(shù)要點總結(jié)如下：設(shè)計1~3條sgRNA即可實現(xiàn)對目標基因的有效編輯；應(yīng)用于楊樹基因編輯的基因多數(shù)進行了植物密碼子優(yōu)化，根據(jù)人類密碼子優(yōu)化的基因，甚至是未經(jīng)優(yōu)化的釀膿鏈球菌()序列直接應(yīng)用于楊樹，也能夠成功進行基因編輯，但在擬南芥和煙草中的研究表明，經(jīng)過植物密碼子優(yōu)化的基因具有更高的表達水平和剪切活性[1,28]。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在經(jīng)濟林木中的應(yīng)用

2.1 果品類林木

近年來，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在果樹的生長發(fā)育、抗病性、果實品質(zhì)改良等方面有著越來越廣泛的應(yīng)用[29]。目前已建立該系統(tǒng)的果品類樹木有：橙子()、葡萄柚()、獼猴桃()、蘋果()、葡萄()、梨()和石榴()。

柑橘屬(spp.)植物是最早嘗試應(yīng)用CRISPR/ Cas9進行基因編輯的木本植物。Jia和Wang[30]針對甜橙基因，采用柑橘黃單胞菌(subsp. citri)促進的農(nóng)桿菌注射法在離體葉片中首次證實了該系統(tǒng)在甜橙中應(yīng)用的可行性，但基因編輯效率只有3.2%~3.9%，并未獲得完整的基因編輯植株。隨后，多個研究團隊致力于改進轉(zhuǎn)化方法和提高基因編輯效率，分別在晚錦橙(Osbeck)[31]、枳橙(L. Raf. ×L. Osb.)[32]和葡萄柚()[33]中獲得了能夠穩(wěn)定遺傳的基因編輯株系，基因突變效率最高達到80%以上(表2)。柑橘潰瘍病是危害柑橘屬植物最嚴重的病害之一，是引起柑橘對潰瘍病感病反應(yīng)的關(guān)鍵基因，也是柑橘抗?jié)儾⊙芯康臒衢T基因。應(yīng)用CRISPR/Cas9對基因及其啟動子序列進行編輯提高了柑橘對潰瘍病的抗性[31,33,34]。上述研究中采用的Cas9蛋白序列均來源于化膿鏈球菌()，即應(yīng)用最為廣泛的SpCas9蛋白。Jia等[35]利用來源于金黃色葡萄球菌()的SaCas9在枳橙中成功編輯基因，該基因與番茄(Mill.)基因同源，能夠影響葉片發(fā)育，在獲得的12個枳橙基因編輯株系中，基因突變效率在15.55%~79.67%之間，但均未出現(xiàn)預(yù)期表型，作者推測可能與未得到純合突變系有關(guān)。最近，該研究團隊又利用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)在葡萄柚中編輯基因，獲得3個突變株系，基因突變頻率在15%~55%之間，這也是CRISPR/Cas12a系統(tǒng)首次應(yīng)用于木本植物的研究報道[36]。與Cas9蛋白不同的是，Cas12a識別富含T的PAM序列—“TTTV”，脫靶率更低，CRISPR/Cas9與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)互為補充，豐富了植物基因組編輯系統(tǒng)選擇的多樣性[37]。

獼猴桃是多年生木本攀緣植物，被譽為水果之王。Wang等[38]以紅陽獼猴桃為材料，比較了傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和PTG/Cas9系統(tǒng)對獼猴桃基因的編輯效率，兩種系統(tǒng)均獲得了白化植株，但PTG/Cas9系統(tǒng)的編輯效率比CRISPR/Cas9系統(tǒng)高10倍。PTG (polycistronic tRNA-sgRNA cassette)是應(yīng)用內(nèi)源tRNA加工系統(tǒng)開發(fā)的植物多基因編輯載體系統(tǒng)，該系統(tǒng)將多個tRNA-sgRNA結(jié)構(gòu)串聯(lián)排列，構(gòu)建成一個多順反子tRNA-sgRNA基因，該多順反子轉(zhuǎn)錄后被加工成多個sgRNA分子[39]。PTG/Cas9系統(tǒng)的高效編輯可能是由于tRNA序列中的增強子提高了sgRNA的轉(zhuǎn)錄水平[39]。獼猴桃雌雄異株，童期較長，需要大約5年才能開花，Varkonyi-Gasic等[40]通過編輯和基因獲得了在組培階段即可開花的雌株，研究結(jié)果為縮短多年生木本植物育種周期提供了借鑒和參考。

葡萄是果品及其加工產(chǎn)品中效益最高的大宗果品之一。為利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在葡萄中開展基因功能研究和基因改良，Wang 等[41]鑒定了葡萄基因組中所有包含NGG的PAM位點及潛在的基因編輯靶點，開發(fā)了用于葡萄基因編輯的數(shù)據(jù)庫Grape- CRISPR website (http://biodb.sdau.edu.cn/gc/index.html)。2016年，中國科學(xué)院植物研究所梁振昌團隊首次利用葡萄懸浮細胞證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在葡萄中的可行性，通過對葡萄酒石酸合成關(guān)鍵酶基因進行敲除，成功降低了葡萄細胞中酒石酸含量[42]。Nakajima等[43]利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對葡萄內(nèi)源基因進行編輯，獲得的再生植株中白化苗比例最高達到72.2%。2018年和2020年，我國科學(xué)家分別對葡萄和基因進行編輯，分別獲得了對灰葡萄孢霉()抗性增強和分枝數(shù)增加的突變體材料[44,45]。

為實現(xiàn)無外源DNA的基因編輯體系，Malnoy 等[46]將體外組裝的Cas9-sgRNA核糖核蛋白復(fù)合體(ribonucleoprotein, RNP)轉(zhuǎn)化葡萄原生質(zhì)體(由愈傷組織制備)，并通過高通量測序?qū)Π谢虻木庉嬊闆r進行檢測和分析，編輯效率只有0.1%；利用相同方法，該研究還對蘋果葉片細胞制備的原生質(zhì)體進行了轉(zhuǎn)化，針對蘋果同源基因的3條sgRNA中突變效率最高為6.9%，但未獲得再生的基因編輯植株。Nishitani等[47]以半矮化的砧木品種“JM2”為材料，針對基因設(shè)計4條sgRNA，再生植株中有31.8%呈現(xiàn)部分或完全白化。最近，通過優(yōu)化基因編輯載體，以“Gala”為受體材料，蘋果基因編輯效率提升至85%以上；該研究還首次在梨樹上應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，獲得了由于基因突變導(dǎo)致提前開花的突變植株[48]。石榴在我國栽培廣泛，具有很高的食用和藥用價值，由于石榴的離體再生比較困難，目前尚未建立完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系。Chang等[49]利用石榴發(fā)根培養(yǎng)體系，針對兩個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因設(shè)計3條特異sgRNA，在兩個基因同時被編輯的發(fā)狀根中，石榴特有的酚類物質(zhì)安石榴苷含量降低40%，開啟了CRISPR/Cas9系統(tǒng)對石榴基因編輯的應(yīng)用。

2.2 飲料類林木

咖啡()和可可()是世界上重要的熱帶經(jīng)濟樹種，也是全球消耗最多的植物性飲料。2018年，來自法國和美國的科研人員分別建立了咖啡和可可的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)[50,51]。針對咖啡基因開展的基因編輯研究中，雖然獲得了純合突變的T0代植株，但與其他樹種不同的是，基因發(fā)生純合突變的植株也未呈現(xiàn)完全白化，僅表現(xiàn)黃化、弱小等表型[50]。可可黑果病是造成可可大面積減產(chǎn)的主要病害之一，研究顯示可可免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)基因下調(diào)可以提高植株對疫霉菌的抗性[52]。Fister等[51]推測，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除基因?qū)⒋蠓岣呖煽蓪σ呙咕剐?。他們首先利用農(nóng)桿菌注射法，在離體葉片注射含基因編輯載體的農(nóng)桿菌48 h后，接種疫霉菌，病斑面積較對照組顯著減小，測序結(jié)果顯示基因突變效率達27%；隨后轉(zhuǎn)化可可體細胞胚，但目前僅獲得嵌合突變體胚[51]。

2.3 工業(yè)原料類林木

木薯()有肥厚的塊狀根，極富淀粉，是熱帶重要的食用植物之一，也是工業(yè)用粉主要原料之一。Odipio等[53]基于基因在兩種不同木薯品種(cv. 60444和TME 204)中首先建立了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，兩個品種分別獲得58和25個獨立轉(zhuǎn)基因株系，再生植株中90%以上有白化表型，這一比例在木本植物基因編輯相關(guān)報道中是比較高的，作者推測這可能與CRISPR/ Cas9與gRNA表達盒整合入木薯基因組有關(guān)，持續(xù)表達的Cas9蛋白與sgRNA使得靶位點編輯的幾率最大化。木薯褐紋病和花葉病是嚴重影響木薯產(chǎn)量的兩種主要病害，培育抗木薯褐斑條紋病毒(cas-sava brown streak virus, CBSV)和抗非洲木薯花葉病毒(african cassava mosaic virus, ACMV)的新材料一直是木薯育種的研究熱點。木薯褐紋病的發(fā)生依賴于CBSV基因組編碼的VPg蛋白與寄主編碼的轉(zhuǎn)錄起始因子的相互作用，利用CRISPR/Cas9同時突變木薯的兩個轉(zhuǎn)錄起始因子基因和，能夠提高木薯對CBSV的抗性，抑制病害癥狀的產(chǎn)生[54]。值得注意的是，在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)培育抗ACMV木薯的報道中，研究人員設(shè)計了1條能夠同時靶向病毒基因組上兩個重疊基因(和)的sgRNA，首先獲得了7個Cas9和sgRNA都表達的轉(zhuǎn)基因株系，利用農(nóng)桿菌浸潤法接種ACMV八周后，在其中3個株系中檢測到病毒基因組上的靶基因產(chǎn)生突變，但這些株系對ACMV的抗性并未改變[55]。有文章評論稱，對ACMV抗性并未改變的原因可能是病毒基因組在植物體內(nèi)復(fù)制速度快，遠遠超過了產(chǎn)生基因編輯的速率；也有可能是農(nóng)桿菌浸潤接種方式造成病毒起始濃度過高導(dǎo)致[56]。

橡膠樹()和麻瘋樹()同屬大戟科熱帶經(jīng)濟作物。巴西橡膠樹是當前商品天然橡膠的主要來源，但由于其異花授粉、童期長達6~7年等特性，常規(guī)育種方法效率低，難以滿足經(jīng)濟需求。中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院華玉偉團隊分別針對可以加快和延遲橡膠樹花期的基因(和)設(shè)計sgRNA，利用PEG介導(dǎo)法將Cas9-sgRNA組裝成的RNP導(dǎo)入葉肉細胞制備的原生質(zhì)體，在國際上率先建立了橡膠樹CRISPR/Cas9系統(tǒng)，為培育無外源DNA污染的基因編輯橡膠品系提供了參考[57]。麻瘋樹種子可提煉生物柴油，是新興的生物質(zhì)能源樹種。麻瘋樹雌雄異花同株，但花數(shù)量較少且雌雄花比例非常低，因此種子產(chǎn)量普遍較低[58]。有研究報道，外源細胞分裂素處理麻瘋花能夠提高雌雄花比例從而增加種子產(chǎn)量[59]。為研究細胞分裂素對麻瘋樹生長和成花的調(diào)控作用，中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園徐增富團隊利用CRISPR/Cas9突變一個細胞分裂素合成的限速酶基因，獲得3個純合突變株系，突變植株內(nèi)源反式/順式玉米素及其核苷濃度顯著降低，突變體出現(xiàn)嚴重的生長抑制，株高僅是野生型植株的1/4[60]。

大麻科山豆麻屬植物生長迅速，耐干旱瘠薄，是熱帶地區(qū)特有的先鋒樹種，而且該樹種具有結(jié)瘤固氮能力，在土壤氮素輸入和保持生態(tài)平衡等方面發(fā)揮重要作用。為研究根系結(jié)瘤過程，van Zeijl等[61]利用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)分別敲除、、和四個基因，發(fā)現(xiàn)和基因?qū)τ诟龅男纬墒侵陵P(guān)重要的，而突變導(dǎo)致莖的形成層活性降低，突變導(dǎo)致雌花中長出雄蕊，由單性花變成兩性花。

竹子(spp.)雖屬禾本科，但含大量纖維素，被視為具有特殊經(jīng)濟和生態(tài)價值的林木品種。Lin等[62]最早利用綠竹原生質(zhì)證實CRISPR/ Cas9可以用于編輯竹子內(nèi)源基因。Ye等[63]在六倍體麻竹中建立了完善的基因編輯系統(tǒng)，該研究針對3對等位基因設(shè)計了兩條sgRNA，成功編輯了麻竹3套亞基因組上的所有等位基因，獲得了白化的突變體植株；此外，該研究還突變了一個赤霉素響應(yīng)基因，該基因功能的缺失導(dǎo)致株高顯著增加。

本文將CRISPR/Cas9系統(tǒng)在上述經(jīng)濟林木中的應(yīng)用進行了歸類總結(jié)(表2)。

續(xù)表

續(xù)表

3 結(jié)語與展望

相比于草本模式植物和糧食作物來說，CRISPR/ Cas9系統(tǒng)在木本植物基因功能研究和品種改良方面的應(yīng)用相對滯后，多數(shù)尚處于基因編輯體系建立的初步階段。在林木上應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)所面臨的主要問題及發(fā)展趨勢主要體現(xiàn)在以下幾個方面：(1)現(xiàn)有植物sgRNA在線設(shè)計軟件數(shù)據(jù)庫中僅包含毛果楊等少數(shù)木本植物基因組信息，建立針對木本植物的sgRNA設(shè)計和檢測脫靶效應(yīng)的公共網(wǎng)絡(luò)平臺，收集更多品種的基因組數(shù)據(jù)，特別是生產(chǎn)上常用林木良種的基因組信息，無疑會大大改善CRISPR/ Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用環(huán)境。(2)多數(shù)木本植物尚不具備完整的組培再生體系和(或)穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，無法利用基因工程技術(shù)進行遺傳改良。因此，發(fā)展完善更多樹種的遺傳轉(zhuǎn)化體系是擴大CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用范圍的重要基礎(chǔ)。(3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化在獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植株的同時伴隨篩選標記基因、基因等外源DNA的插入。糧食等農(nóng)作物可以在后代群體的分離中獲得無外源DNA污染的遺傳改良品系，但木本植物通常具有較長的童期，且普遍采用扦插等無性繁殖方式，難以通過上述方法實現(xiàn)無外源DNA污染的基因編輯，這就涉及基因水平轉(zhuǎn)移、基因垂直流動等生態(tài)風險問題。直接向細胞內(nèi)導(dǎo)入Cas9/sgRNA核糖核蛋白復(fù)合物可以很好的解決外源DNA污染問題，但該技術(shù)依賴于原生質(zhì)體制備和再生體系，因此開發(fā)木本植物的原生質(zhì)體制備和再生體系，提高單細胞轉(zhuǎn)化效率，將有助于加快基因編輯優(yōu)良品系的產(chǎn)生。

Cas9蛋白對sgRNA與靶位點的堿基錯配非常敏感，越靠近PAM位點的堿基錯配對Cas9的活性影響越大[64]。林木由于長期異交，基因組高度雜合，為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用提出了新的挑戰(zhàn)和機遇：一方面，基因組序列的多態(tài)性有可能影響CRISPR/ Cas9同時對多個基因進行編輯，增大了在遺傳轉(zhuǎn)化T0代即可獲得純合或雙等位基因突變株系的難度；另一方面，等位基因間存在的豐富序列變異使得針對某一個等位基因的特異編輯(allele-specific editing)成為可能。開發(fā)等位基因特異的sgRNA，獲得等位基因特異的基因編輯株系，可以為研究基因功能冗余和基因劑量效應(yīng)提供必要的研究材料。

突變體對于植物基因功能研究至關(guān)重要。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在基因組特定位置引入突變，極大提高了目的基因突變效率，節(jié)省了對大規(guī)模群體的篩選工作。中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所李家洋院士研究團隊已利用大規(guī)模的sgRNA文庫在全基因組水平上對水稻基因進行編輯，獲得了9萬多個靶向缺失突變體，為水稻功能基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)[65]。木本植物突變體材料匱乏，人工誘發(fā)突變鑒定困難，限制了功能基因組研究和遺傳育種進程。進一步提高林木遺傳轉(zhuǎn)化和再生效率，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)創(chuàng)制林木定向突變體庫將為深入研究林木基因功能和林木基因資源的開發(fā)提供寶貴的材料基礎(chǔ)。此外，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)衍生的很多新技術(shù)，如CRISPR/Cpf1系統(tǒng)、靶向基因激活與抑制、基因定向敲入、堿基編輯技術(shù)(包括胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器)等[66,67]，在木本植物上的應(yīng)用還非常有限，拓寬這些新技術(shù)在林木上的應(yīng)用范圍也將成為今后的發(fā)展方向。

[1] Li JF, Norville JE, Aach J, McCormack M, Zhang DD, Bush J, Church GM, Sheen J. Multiplex and homologous recombination–mediated genome editing inandusing guide RNA and Cas9.,2013, 31(8): 688–691.

[2] Shan SC, Soltis PS, Soltis DE, Yang B. Considerations in adapting CRISPR/Cas9 in nongenetic model plant systems., 2020, 8(1): e11314.

[3] Wang YP, Cheng X, Gao CX, Qiu JL. Wheat resistant to powdery mildew was developed by genome editing.(), 2014, 36(8): 848.王延鵬, 程曦, 高彩霞, 邱金龍. 利用基因組編輯技術(shù)創(chuàng)制抗白粉病小麥. 遺傳, 2014, 36(8): 848.

[4] Zhang DW, Zhang CF, Dong F, Huang YL, Zhang Y, Zhou H. Application of CRISPR/Cas9 system in breeding of new antiviral plant germplasm.(), 2016, 38(9): 811–820.張道微, 張超凡, 董芳, 黃艷嵐, 張亞, 周虹. CRISPR/ Cas9系統(tǒng)在培育抗病毒植物新種質(zhì)中的應(yīng)用. 遺傳, 2016, 38(9): 811–820.

[5] Chen KL, Wang YP, Zhang R, Zhang HW, Gao CX. CRISPR/Cas genome editing and precision plant breeding in agriculture., 2019, 70: 667–697.

[6] Fan D, Liu TT, Li CF, Jiao B, Li S, Hou YS, Luo KM. Efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis inin the first generation.,2015, 5: 12217.

[7] Zhou XH, Jacobs TB, Xue LJ, Harding SA, Tsai CJ. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennialreveals 4‐coumarate: CoA ligase specificity and redundancy.,2015, 208(2): 298–301.

[8] Elorriaga E, Klocko AL, Ma C, Strauss SH. Variation in mutation spectra among CRISPR/Cas9 mutagenized poplars., 2018, 9: 594.

[9] Bruegmann T, Deecke K, Fladung M. Evaluating the efficiency of gRNAs in CRISPR/Cas9 mediated genome editing in poplars., 2019, 20(15): 3623.

[10] Ma JC, Wan DS, Duan BB, Bai XT, Bai QX, Chen NN, Ma T. Genome sequence and genetic transformation of a widely distributed and cultivated poplar., 2019, 17(2): 451–460.

[11] Muhr M, Paulat M, Awwanah M, Brinkk?tter M, Teichmann T. CRISPR/Cas9-mediated knockout ofandorthologs reveals a major function in bud outgrowth control., 2018, 38(10): 1588–1597.

[12] Takata N, Awano T, Nakata MT, Sano Y, Sakamoto S, Mitsuda N, Taniguchi T./orthologs are key regulators of secondary cell wall formation in wood fibers, phloem fibers and xylem ray parenchyma cells., 2019, 39(4): 514–525.

[13] Fan CF, Yu H, Qin SF, Li YL, Alam A, Xu CZ, Fan D, Zhang QW, Wang YT, Zhu WB, Peng LC, Luo KM. Brassinosteroid overproduction improves lignocellulose quantity and quality to maximize bioethanol yield under green-like biomass process in transgenic poplar., 2020, 13(1): 9.

[14] Wang LJ, Ran LY, Hou YS, Tian QY, Li CF, Liu R, Fan D, Luo KM. The transcription factorcontributes to the regulation of proanthocyanidin biosynthesis and enhances fungal resistance in poplar., 2017, 215(1): 351–367.

[15] Yang L, Zhao X, Ran LY, Li CF, Fan D, Luo KM.is involved in negative regulation of phenylpropanoid metabolism and secondary cell wall biosynthesis during wood formation in poplar., 2017, 7(1): 41209.

[16] Xu CZ, Fu XK, Liu R, Guo L, Ran LY, Li CF, Tian QY, Jiao B, Wang BJ, Luo KM.positively regulates lignin deposition during wood formation in poplar and confers drought tolerance in transgenic., 2017, 37(12): 1713–1726.

[17] Wan SZ, Li CF, Ma XD, Luo KM.contributes to the negative regulation of anthocyanin and proanthoc-yanidin biosynthesis in poplar., 2017, 36(8): 1263–1276.

[18] Fan D, Wang XQ, Tang XF, Ye X, Ren S, Wang DH, Luo KM. Histone H3K9 demethylaseepigenetically modulates anthocyanin biosynthesis in poplar., 2018, 96(6): 1121–1136.

[19] Jiao B, Zhao X, Lu WX, Guo L, Luo KM. The R2R3 MYB transcription factornegatively regulates secondary cell wall biosynthesis in., 2019, 39(7): 1187–1200.

[20] Shen Y, Li YL, Xu D, Yang C, Li CF, Luo KM. Molecular cloning and characterization of a brassinosteriod biosynthesis-related genefrom., 2018, 38(9): 1424–1436.

[21] An Y, Zhou YY, Han X, Shen C, Wang S, Liu C, Yin WL, Xia XL. The GATA transcription factorplays an important role in photosynthesis and growth in poplar., 2020, 71(6): 1969–1984.

[22] Ramos-Sánchez JM, Triozzi PM, Alique D, Geng F, Gao MJ, Jaeger KE, Wigge PA, Allona I, Perales M.integrates night-length information to determine timing of poplar photoperiodic growth., 2019, 29(14): 2402–2406.e4.

[23] Maurya JP, Singh RK, Miskolczi PC, Prasad AN, Jonsson K, Wu F, Bhalerao RP. Branching regulatormediates photoperiodic control of seasonal growth in hybrid aspen., 2020, 30(1): 122–126.e2.

[24] Li S, Lin YJ, Wang PY, Zhang BF, Li M, Chen S, Shi R, Tunlaya-Anukit S, Liu XY, Wang ZF, Dai XF, Yu J, Zhou CG, Liu BG, Wang JP, Chiang VL, Li W. The AREB1 transcription factor influences histone acetylation to regulate drought responses and tolerance in., 2019, 31(3): 663–686.

[25] Zhou YY, Zhang Y, Wang XW, Han X, An Y, Lin SW, Shen C, Wen JL, Liu C, Yin WL, Xia XL. The root‐specific NF‐Y family transcription factor,, positively regulates root growth and drought resistance by ABA‐ mediated IAA transport in., 2020, doi: 10.1111/nph.16524.

[26] Jiang YZ, Guo L, Ma XD, Zhao X, Jiao B, Li CF, Luo KM. The WRKY transcription factorsandpromote Melampsora resistance in., 2017, 37(5): 665–675.

[27] Fellenberg C, Corea O, Yan LH, Archinuk F, Piirtola EM, Gordon H, Reichelt M, Brandt W, Wulff J, Ehlting J, Peter Constabel C. Discovery of salicyl benzoate UDP‐ glycosyltransferase, a central enzyme in poplar salicinoid phenolic glycoside biosynthesis.,2020, 102(1): 99–115

[28] Johnson RA, Gurevich V, Filler S, Samach A, Levy AA. Comparative assessments of CRISPR-Cas nucleases’ cleavage efficiency in planta., 2015, 87(1–2): 143–156.

[29] Zhou JH, Li DD, Wang GM, Wang FX, Kunjal M, Joldersma D, Liu ZC. Application and future perspective of CRISPR/Cas9 genome editing in fruit crops., 2020, 62(3): 269–286.

[30] Jia HG, Wang N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA.,2014, 9(4): e93806.

[31] Peng AH, Chen SC, Lei TG, Xu LZ, He YR, Wu L, Yao LX, Zou XP. Engineering canker‐resistant plants through CRISPR/Cas9‐targeted editing of the susceptibility genepromoter in citrus., 2017, 15(12): 1509–1519.

[32] Zhang F, LeBlanc C, Irish VF, Jacob Y. Rapid and efficient CRISPR/Cas9 gene editing inusing thepromoter., 2017, 36(12): 1883–1887.

[33] Jia HG, Orbovic V, Jones JB, Wang N. Modification of theeffector binding elements in Type Ipromoter using Cas9/sg RNA to produce transgenic Duncan grapefruit alleviating XccΔpthA4: dCs LOB 1.3 infection., 2016, 14(5): 1291–1301.

[34] Jia HG, Zhang YZ, Orbovi? V, Xu J, White FF, Jones JB, Wang N. Genome editing of the disease susceptibility genein citrus confers resistance to citrus canker., 2017, 15(7): 817–823.

[35] Jia HG, Xu J, Orbovi? V, Zhang YZ, Wang N. Editing citrus genome via SaCas9/sgRNA system., 2017, 8: 2135.

[36] Jia HG, Orbovi? V, Wang N. CRISPR‐LbCas12a‐mediated modification of citrus., 2019, 17(10): 1928–1937.

[37] Liu GY, Li GS, Zhang YL, Chen LT. Current advances on CRISPR/Cas genome editing technologies in plants., 2019, 40(5): 38–49.劉耀光, 李構(gòu)思, 張雅玲, 陳樂天. CRISPR/Cas植物基因組編輯技術(shù)研究進展. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2019, 40(5): 38–49.

[38] Wang ZP, Wang SB, Li DW, Zhang Q, Li L, Zhong CH, Liu YF, Huang HW. Optimized paired‐sgRNA/Cas9 cloning and expression cassette triggers high‐efficiency multiplex genome editing in kiwifruit., 2018, 16(8): 1424–1433.

[39] Xie KB, Minkenberg B, Yang YN. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system., 2015, 112(11): 3570–3575.

[40] Varkonyi‐Gasic E, Wang TC, Voogd C, Jeon S, Drummond RSM, Gleave AP, Allan AC. Mutagenesis of kiwifruit CENTRORADIALIS‐like genes transforms a climbing woody perennial with long juvenility and axillary flowering into a compact plant with rapid terminal flowering., 2019, 17(5): 869–880.

[41] Wang Y, Liu XJ, Ren C, Zhong GY, Yang L, Li SH, Liang ZC. Identification of genomic sites for CRISPR/Cas9- based genome editing in the Vitis vinifera genome., 2016, 16(1): 96.

[42] Ren C, Liu XJ, Zhang Z, Wang Y, Duan W, Li SH, Liang ZC. CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in Chardonnay (L.)., 2016, 6: 32289.

[43] Nakajima I, Ban Y, Azuma A, Onoue N, Moriguchi T, Yamamoto T, Toki S, Endo M. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in grape., 2017, 12(5): e0177966.

[44] Wang XH, Tu MX, Wang DJ, Liu JW, Li YJ, Li Z, Wang YJ, Wang XP. CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis in grape in the first generation., 2018, 16(4): 844–855.

[45] Ren C, Guo YC, Kong JH, Lecourieux F, Dai ZW, Li SH, Liang ZC. Knockout ofgene in grapevine affects shoot branching., 2020, 20(1): 47.

[46] Malnoy M, Viola R, Jung MH, Koo OJ, Kim S, Kim JS, Velasco R, Nagamangala Kanchiswamy C. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins., 2016, 7: 1904.

[47] Nishitani C, Hirai N, Komori S, Wada M, Okada K, Osakabe K, Yamamoto T, Osakabe Y. Efficient genome editing in apple using a CRISPR/Cas9 system., 2016, 6: 31481.

[48] Charrier A, Vergne E, Dousset N, Richer A, Petiteau A, Chevreau E. Efficient targeted mutagenesis in apple and first time edition of pear using the CRISPR-Cas9 system., 2019, 10: 40.

[49] Chang LJ, Wu S, Tian L. Effective genome editing and identification of a regiospecific gallic acid 4-O-glycosyl-transferase in pomegranate (L.)., 2019, 6: 123.

[50] Breitler JC, Dechamp E, Campa C, Rodrigues LAZ, Guyot R, Marraccini P, Etienne H. CRISPR/Cas9-mediated efficient targeted mutagenesis has the potential to accelerate the domestication of., 2018, 134(3): 383–394.

[51] Fister AS, Landherr L, Maximova SN, Guiltinan MJ. Transient expression of CRISPR/Cas9 machinery targetingenhances defense response in., 2018, 9: 268.

[52] Shi Z, Zhang YF, Maximova SN, Guiltinan MJ.fromfunctions as a repressor of the pathogen defense response., 2013, 13(1): 204.

[53] Odipio J, Alicai T, Ingelbrecht I, Nusinow DA, Bart R, Taylor NJ. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing of phytoene desaturase in cassava., 2017, 8: 1780.

[54] Gomez MA, Lin ZD, Moll T, Chauhan RD, Hayden L, Renninger K, Beyene G, Taylor NJ, Carrington JC, Staskawicz BJ, Bart RS. Simultaneous CRISPR/Cas9- mediated editing of cassava eIF4E isoforms nCBP-1 and nCBP-2 reduces cassava brown streak disease symptom severity and incidence., 2019, 17(2): 421–434.

[55] Mehta D, Stürchler A, Anjanappa RB, Zaidi SS, Hirsch- Hoffmann M, Gruissem W, Vanderschuren H. Linking CRISPR-Cas9 interference in cassava to the evolution of editing-resistant geminiviruses., 2019, 20(1): 80.

[56] Rybicki EP. CRISPR–Cas9 strikes out in cassava., 2019, 37(7): 727–728.

[57] Fan YT, Xin SC, Dai XM, Yang XF, Huang HS, Hua YW. Efficient genome editing of rubber tree () protoplasts using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins., 2020, 146: 112146.

[58] Wu ZP, Wu GJ. Research progress of energy plantL., 2014, 26(5): 497–502.吳平治, 吳國江. 木本油料植物麻瘋樹的研究進展. 生命科學(xué), 2014, 26(5): 497–502.

[59] Pan BZ, Xu ZF. Benzyladenine treatment significantly increases the seed yield of the biofuel plant jatropha curcas., 2011, 30(2): 166–174.

[60] Cai L, Zhang L, Fu QT, Xu ZF. Identification and expression analysis of cytokinin metabolic genes,andin the biofuel plant., 2018, 6: e4812.

[61] van Zeijl A, Wardhani TAK, Seifi Kalhor M, Rutten L, Bu F, Hartog M, Linders S, Fedorova EE, Bisseling T, Kohlen W, Geurts R. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of four putative symbiosis genes of the tropical treereveals novel phenotypes., 2018, 9: 284.

[62] Lin CS, Hsu CT, Yang LH, Lee LY, Fu JY, Cheng QW, Wu FH, Hsiao HC, Zhang YS, Zhang R, Chang WJ, Yu CT, Wang W, Liao LJ, Gelvin SB, Shih MC. Application of protoplast technology to CRISPR/Cas9 mutagenesis: from single‐cell mutation detection to mutant plant regeneration., 2018, 16(7): 1295–1310.

[63] Ye SW, Chen G, Kohnen MV, Wang WJ, Cai CY, Ding WS, Wu C, Gu LF, Zheng YS, Ma XQ, Lin CT, Zhu Q. Robust CRISPR/Cas9 mediated genome editing and its application in manipulating plant height in the first generation of hexaploid Ma bamboo (Munro)., 2020, doi: 10.1111/pbi.13320.

[64] Xie SS, Zhang Y, Zhang LS, Li GL, Zhao CZ, Ni P, Zhao SH. sgRNA design for the CRISPR/Cas9 system and evaluation of its off-target effects., 2015, 37(11): 1125–1136.謝勝松, 張懿, 張利生, 李廣磊, 趙長志, 倪攀, 趙書紅. CRISPR/Cas9系統(tǒng)中sgRNA設(shè)計與脫靶效應(yīng)評估. 遺傳, 2015, 37(11): 1125–1136.

[65] Meng XB, Yu H, Zhang Y, Zhuang FF, Song XG, Gao SS, Gao CX, Li JY. Construction of a genome-wide mutant library in rice using CRISPR/Cas9., 2017, 10(9): 1238–1241.

[66] Shan QW, Gao CX. Research progress of genome editing and derivative technologies in plants.(), 2015, 37(10): 953–973.單奇?zhèn)? 高彩霞. 植物基因組編輯及衍生技術(shù)最新研究進展. 遺傳, 2015, 37(10): 953–973.

[67] Zong Y, Gao CX. Progress on base editing systems.(), 2019, 41(9): 777–800.宗媛, 高彩霞. 堿基編輯系統(tǒng)研究進展. 遺傳, 2019, 41(9): 777–800.

Application of CRISPR/Cas9 mediated gene editing in trees

Yingnan Chen1,2, Jing Lu1,2

The CRISPR/Cas9 system, which can induce precise modifications at a target gene, has been recognized as the most promising gene editing technology, and has played an important role in precision crop breeding. It also provides a new strategy for fundamental researches and molecular breeding of forest trees. Recently, CRISPR/Cas9-mediated gene editing has been applied more extensively in tree genetic studies. It has not only succeeded in developing new drought- resistance or disease-resistant cultivars, but also shows a great potential in regulating lignin biosynthesis and shortening the breeding cycle of forest trees. In this review, we summarize the application and advance of CRISPR/Cas9 in gene function identification and genetic improvement of forest plants. We also discuss the related problems and future perspectives. This review aims to provide a useful reference for tree functional genomics and genetic engineering breeding.

CRISPR/Cas9; gene editing; trees; gene function; genetic improvement

2020-04-04;

2020-05-25

青年人才托舉工程(編號：YESS20160121)，江蘇省高校“青藍工程”優(yōu)秀青年骨干教師項目和江蘇省優(yōu)勢學(xué)科項目資助[Supported by the Youth Elite Science Sponsorship Program by CAST (No. YESS20160121), the Qing Lan Talent Support Program at Jiangsu Province, and the Priority Academic Program Development Program of Jiangsu Province]

陳贏男，博士，副教授，研究方向：林木遺傳育種。E-mail: chenyingnan@njfu.edu.cn

陳贏男。

10.16288/j.yczz.20-092

2020/6/16 15:25:55

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200615.1008.002.html

(責任編委: 高彩霞)