銅藻中有害元素的脫除工藝優(yōu)化及脫除前后砷形態(tài)的變化

,3,3,3,*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210023;2.江蘇省海洋藥用生物資源研究與開發(fā)重點實驗室,江蘇南京 210023;3.江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇南京 210023)

海藻由于細胞壁結(jié)構(gòu)特點,容易富集環(huán)境中的有害元素,且對砷元素富集最為嚴重[1-2]。自然界中的砷具有不同形態(tài),常見的砷化合物有砷膽堿(AsC)、砷甜菜堿(AsB)、亞砷酸根(As3+)、二甲基砷酸(DMA)、一甲基砷酸(MMA)、砷酸根(As5+),砷糖(AsS)等,不同的形態(tài)具有不同的毒性,毒性大小為As3+>As5+>MMA>DMA>AsS>AsC>AsB,以無機砷毒性最大,有機砷的毒性較小,AsS、AsC、AsB則無毒[3-4]。銅藻(Sargassumhorneri)來源于褐藻門馬尾藻科,近年來在我國沿海海域上爆發(fā),形成“金潮”災(zāi)害,因此對該資源變廢為寶是海藻綜合利用的重要課題,現(xiàn)階段對銅藻主要集中在醫(yī)藥[5]、食品[6]、化妝品[7]、飼料[8]等行業(yè)研究。本課題前期實驗研究發(fā)現(xiàn),銅藻中鉻、砷、鎘、鉛均超過GB 2762-2017《食品中污染物限量》[9]的限量規(guī)定,這將會限制銅藻的開發(fā)和利用,因此有必要脫除銅藻中的有害元素。

目前,國內(nèi)外對于脫除有害元素的相關(guān)研究較多,但主要集中在水體[10]、土壤[11]、海產(chǎn)動物[12]等,針對海藻中有害元素脫除的問題,國內(nèi)學(xué)者已經(jīng)對海帶、裙帶菜、紫菜等展開研究,但以脫除銅藻中有害元素的研究未見報道。周衛(wèi)松[13]采用檸檬酸脫除裙帶菜中的砷;丁仲仲[14]和周青等[15]采用檸檬酸脫除壇紫菜中的鎘。但這些研究還存在著一些不足:a.僅局限于脫除藻體中單一的有害元素,不能同時兼顧多種超標(biāo)有害元素的脫除;b.沒有考慮脫除過程中藻體的功效性成分(如巖藻黃質(zhì))的損失問題;c.忽視脫除劑在藻體中的殘留。

針對目前研究存在的不足,本研究以銅藻為對象,通過對比不同脫除劑進而選擇最佳脫除劑,單因素考察料液比、浸泡時間、溫度對銅藻中鉻、砷、鎘、鉛的脫除率的影響,利用正交實驗優(yōu)化脫除工藝來降低銅藻中鉻、砷、鎘、鉛含量,并采用HPLC-ICP-MS法分析脫除前后砷形態(tài)的變化,對比脫除前后巖藻黃質(zhì)含量的變化,以期提高銅藻被開發(fā)利用的可能性,同時將優(yōu)化后的工藝應(yīng)用于不同藻類以考察該工藝的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銅藻新鮮品 采自江蘇啟東;羊棲菜新鮮品 采自浙江洞頭;馬尾藻新鮮品 采自山東威海;多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液 國家有色金屬及電子材料分析測試中心;巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥95%，Sigma公司;65%硝酸 色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司;乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)品、亞砷酸根(As3+)、砷酸根(As5+)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷膽堿(AsC)、砷甜菜堿(AsB) 中國計量科學(xué)研究院;乙腈、甲醇 色譜純,美國天地;檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;活性炭 中國材料院材產(chǎn)化工研究所。

MARS微波消解儀 美國CFM公司;NEXIOH350D電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 UHPLC Perkin Elmer;e2695高效液相色譜儀、2998PDA檢測器 美國Waters公司;STP FA2004型電子分析天平 上海上平儀器有限公司;KQ-500ED型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Milli-Q超純水機 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銅藻樣品前處理 新鮮銅藻洗去泥沙,烘干,粉碎,過40目篩即為未處理的銅藻粉末;處理后的銅藻粉末為新鮮銅藻洗去泥沙,加入洗脫劑,按照一定的料液比、溫度、時間處理后,烘干,粉碎,過40目篩,即得。

1.2.2 銅藻中有害元素的測定 按GB 5009.268-2016《食品中多元素的測定》[16]對鉻、砷、鎘、砷進行檢測。

1.2.3 最佳脫除劑的選擇 本實驗選取水[17]、EDTA-2Na[18-20]、檸檬酸[21-22]、10 g活性炭[23]作為脫除銅藻中鉻、砷、鎘、鉛的脫除劑,在料液比為1∶15 g/mL,溫度為30 ℃,時間為2 h下,考察這4種脫除劑對鉻、砷、鎘、鉛脫除率的影響,從而選擇最佳脫除劑。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 溫度對銅藻中有害元素脫除率的影響 取一定量洗去泥沙的新鮮銅藻,在時間為2 h,料液比為1∶15 g/mL條件下,考察溫度為30、40、50、60 ℃時對銅藻中鉻、砷、鎘、鉛脫除率的影響。

1.2.4.2 料液比對銅藻中有害元素脫除率的影響 取一定量洗去泥沙的新鮮銅藻,在時間為2 h,溫度為30 ℃條件下,考察料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL時對銅藻中鉻、砷、鎘、鉛脫除率的影響。

1.2.4.3 時間對銅藻中有害元素脫除率的影響 取一定量洗去泥沙的新鮮銅藻,在溫度為30 ℃,料液比為1∶15 g/mL條件下,考察時間為2、3、4、5 h時對銅藻中鉻、砷、鎘、鉛脫除率的影響。

1.2.5 正交實驗 在最佳脫除劑的選擇及單因素實驗的基礎(chǔ)上,對脫除料液比、溫度、時間進行正交實驗設(shè)計,因素及水平的設(shè)置見表1。

表1 正交試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 指標(biāo)的計算

1.2.6.1 有害元素脫除率的計算

式中:X0、Xt分別表示未處理、處理后銅藻中鉻、砷、鎘、鉛的含量,mg/kg。

1.2.6.2 巖藻黃質(zhì)含量的測定及損失率計算 取處理后及未處理的銅藻粉末于具塞錐形瓶中,加入50倍量70%乙醇,稱重,在功率500 W,溫度50 ℃,時間50 min的條件下超聲,取出,冷卻后補足減失的重量,過濾,進HPLC測定。色譜條件:色譜柱:YMC C18柱(250 mm×4.6 mm);流速1 mL/min;進樣體積:10 μL;流動相:乙腈∶水=90∶10,檢測波長:449 nm,柱溫:25 ℃。巖藻黃質(zhì)的含量計算公式如下:

式中:X表示試樣中巖藻黃質(zhì)的含量,mg/g;A表示試樣中巖藻黃質(zhì)的峰面積;C表示巖藻黃質(zhì)標(biāo)品的濃度,mg/mL;V表示試樣提取體積,mL;n表示試液稀釋倍數(shù);As表示巖藻黃質(zhì)標(biāo)品的峰面積;m表示樣品取樣量,g。

巖藻黃質(zhì)的損失率計算公式如下:

式中:X0、Xt分別表示未處理、處理后銅藻中巖藻黃質(zhì)的含量,mg/g。

1.2.7 砷形態(tài)含量測定及計算 取未處理及優(yōu)化工藝條件下處理的銅藻粉末于離心管中,加入20倍量0.15 mol/L硝酸,置于90 ℃烘箱中提取2.5 h,每個0.5 h取出震蕩2 min,取出冷卻至室溫,6500 r/min離心15 min,取上清液[24],進HPLC-ICP-MS測定。色譜條件按《中國藥典(2015版)》第四部 通則2322 汞和砷元素形態(tài)及其價態(tài)測定法進行。各砷形態(tài)含量按以下公式計算:

式中:X表示試樣中各砷形態(tài)的含量,mg/kg;A表示試樣中各砷形態(tài)峰面積;C表示各砷形態(tài)標(biāo)品的濃度,μg/mL;V表示試樣提取體積,mL;n表示試液稀釋倍數(shù);As表示各砷形態(tài)標(biāo)品峰面積;m表示樣品取樣量,g。

1.2.8 考察脫除工藝的適用性 分別稱取一定量的清洗后的羊棲菜、馬尾藻于燒杯中,料液比、時間、溫度為脫除工藝優(yōu)化后的條件,處理后取出在50 ℃烘箱中烘干,打粉過40篩,微波消解后進ICP-MS測定有害元素脫除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、GraphPad Prism 5.0、正交助手進行數(shù)據(jù)處理,所有實驗均平行三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅藻中有害元素測定

表2為銅藻中有害元素鉻、砷、鎘、鉛含量,結(jié)果表明銅藻中鉻、砷、鎘、鉛分別約超出GB 2762-2017《食品污染物限量》的10倍、160倍、20倍、2倍,可見銅藻中的鉻、砷、鎘、鉛超標(biāo)十分嚴重,這將限制銅藻的開發(fā)與利用。

表2 銅藻中有害元素含量測定(mg/kg)Table 2 Determination of harmful elements in Sargassum horneri(mg/kg)

2.2 最佳脫除劑的確定

EDTA-2Na是一種良好的螯合劑,能與金屬形成螯合物,GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[25]中規(guī)定EDTA-2Na添加量不超過250 mg/kg,課題前期發(fā)現(xiàn)EDTA-2Na對銅藻中鉻、砷、鎘、鉛具有較好的脫除效果,且在1.5% EDTA-2Na下殘留量低于標(biāo)準(zhǔn)限量;同時前期預(yù)實驗得出檸檬酸濃度較高時會大量降低銅藻中巖藻黃質(zhì)含量,當(dāng)濃度為0.5%時,銅藻中巖藻黃質(zhì)的損失率少于20%,在可以接受的范圍內(nèi);因此本實驗對比1.5% EDTA-2Na、0.5%檸檬酸、水、10 g活性炭對銅藻中有害元素脫除率的影響,如圖1所示,不同脫除劑對鉻的脫除率由大到小為:10 g活性炭>1.5% EDTA-2Na>水>0.5%檸檬酸,四種脫除劑對鉻的脫除率差別不大,均為60%左右;不同脫除劑對砷的脫除率依次為:10 g活性炭>0.5%檸檬酸>1.5% EDTA-2Na>水,除水外,其他三種脫除劑對砷的脫除率均在60%上下;對于鎘的脫除率大小依次為:1.5% EDTA-2Na>0.5%檸檬酸>10 g活性炭>水,除1.5% EDTA-2Na對鎘的脫除率在80%以上外,其他脫除劑對鎘的脫除率均在20%左右;不同脫除劑對鉛的脫除率依次為:1.5% EDTA-2Na>水>10 g活性炭>0.5%檸檬酸,1.5% EDTA-2Na對于鉛的脫除率高于55%,其余均在45%以下。綜上,確定最佳脫除劑為1.5% EDTA-2Na,這與EDTA-2Na具有六個配位原子而容易和鉻、砷、鎘、鉛形成螯合物有關(guān),與陳后山等[26]研究相似。

圖1 脫除劑對銅藻中有害元素脫除率的影響 Fig.1 Effects of removers on the removal rate of harmful elements in Sargassum horneri

2.3 單因素實驗

2.3.1 溫度的影響 不同溫度對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質(zhì)損失率的影響,如圖2所示,結(jié)果表明鉻的脫除率在30～40 ℃變化趨勢小,脫除率較高;砷的脫除率變化趨勢緩慢,鉛的脫除率在40 ℃下效果最好,鎘的脫除率呈上升的趨勢,在50～60 ℃時變化不明顯,脫除效果均較好。由圖3e可知,在50～60 ℃時,巖藻黃質(zhì)損失率減少,可能是溫度升高破壞銅藻中的其他成分,使得單位質(zhì)量內(nèi)巖藻黃質(zhì)含量增加,使得巖藻黃質(zhì)損失率減少。因此考慮到溫度較高可能使一些成分流失,初步確定40 ℃為脫除鉻、砷、鎘、鉛的適合溫度。

圖2 溫度對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質(zhì)損失率的影響Fig.2 Effects of temperature on the removal rate of harmful elements and the fucoxanthin loss rate in Sargassum horneri注:a:鉻；b:砷;c:鎘;d:鉛;e:巖藻黃質(zhì)損失率;圖3～圖4同。

2.3.2 料液比的影響 不同料液比對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質(zhì)損失率的影響,如圖3所示,結(jié)果表明鉻的脫除率在1∶30 g/mL時脫除率最高,但巖藻黃質(zhì)在1∶30時損失率最多,而1∶25 g/mL時鉻的脫除率次之;砷和鎘的脫除率在1∶25 g/mL時效果最好;鉛的脫除率1∶15 g/mL時最高,1∶20和1∶30 g/mL雖然脫除率較低,但鉛含量均低于國標(biāo)限量。因此,初步確定1∶25 g/mL是脫除鉻、砷、鎘、鉛的適合料液比。

圖3 料液比對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質(zhì)損失率的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on removal rate of harmful elements and fucoxanthin loss rate in Sargassum horneri

2.3.3 時間的影響 不同時間對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質(zhì)損失率的影響,如圖4所示,結(jié)果表明鉻的脫除率在5 h時最高,4 h次之,但5 h時對巖藻黃質(zhì)損失率最大;砷在4 h時脫除率最高;鎘脫除率在3 h時最高,但與4 h的脫除率差別不大,鉛在各時間下均能低于標(biāo)準(zhǔn)限量;因此,初步得出4 h是脫除鉻、砷、鎘、鉛的適合時間。

圖4 時間對銅藻中有害元素脫除率及巖藻黃質(zhì)損失率的影響Fig.4 Effects of time on the removal rate of harmful elements and the fucoxanthin loss rate in Sargassum horneri

2.4 正交試驗

由表3正交實驗直觀分析表可知,影響鉻脫除率的因素由大到小依次為:料液比>時間>溫度,影響鎘脫除率的因素由大到小依次為:料液比>溫度>時間,影響砷脫除率和鉛脫除率的因素由大到小依次為:時間>料液比>溫度,溫度對于銅藻中鉻、砷、鎘、鉛的脫除率影響較小。鉻、砷、鎘、鉛的最佳脫除條件分別為A1B3C1、A2B3C3、A2B2C3、A2B2C1,對于不同有害元素其最佳脫除條件各有不同。在這四種有害元素中,砷毒性最大且砷在銅藻中超標(biāo)最為嚴重,因此本研究以脫除銅藻中的砷為主,同時考慮到溫度太高會破壞銅藻中其他成分以及會使成本上漲,綜上,本實驗選擇脫除工藝為A2B3C1,即時間為4 h,料液比為1∶30 μg/mL,溫度為30 ℃。

表3 正交表實驗結(jié)果Table 3 Result of the orthogonal experiments

續(xù)表

2.5 巖藻黃質(zhì)含量變化

巖藻黃質(zhì)是一種存在于藻類中的類胡蘿卜素,其對光敏感,在酸性條件及高溫條件下極不穩(wěn)定等[27-29],對比處理前后銅藻中的巖藻黃質(zhì)含量變化,如表4所示,在時間為4 h,料液比為1∶30 g/mL,溫度30 ℃條件處理后巖藻黃質(zhì)損失率為19.28%,在可以接受范圍內(nèi)。

表4 脫除工藝對巖藻黃質(zhì)含量的影響Table 4 Effect of removal process on the content of fucoxanthine

2.6 脫除前后砷形態(tài)含量變化

脫除工藝處理前后銅藻中不同砷形態(tài)的含量如表5所示,各砷形態(tài)提取總量約占微波消解所得總砷的75%,提取率未到100%,這可能與該前處理方法對銅藻中砷形態(tài)提取不完全有關(guān),后續(xù)課題組將對此展開研究;還可能與銅藻中存在一些未知砷有關(guān):如砷糖等,由于缺少相關(guān)的標(biāo)品不能對其進行定性定量分析。

表5 脫除工藝前后銅藻中不同砷形態(tài)的含量(mg/kg)Table 5 Contents of different arsenic species in Sargassum horneri before and after removal process(mg/kg)

銅藻中毒性大的無機砷含量(即As3+和As5+的總量之和)最多,占各砷形態(tài)提取總量的60.26%,其次為毒性最低的AsB,占各砷形態(tài)提取總量的38.96%,DMA和MMA在銅藻中含量較低。在優(yōu)化后的脫除工藝處理下,毒性較大的As3+未被檢出,As5+的含量從原有的33.83 mg/kg降至2.90 mg/kg,降低了91.43%,DMA的含量降低了34.48%,MMA含量低了37.50%。綜上說明該工藝能脫除大部分毒性較大的無機砷。

2.7 脫除工藝對不同藻類中有害元素脫除率的影響

將脫除劑為1.5% EDTA-2Na,時間為4 h,料液比為1∶30 g/mL,溫度為30 ℃的工藝應(yīng)用于不同的藻類,對不同藻類中有害元素脫除率的影響如表6所示,該工藝處理后羊棲菜中鉻的脫除率為57.27%,砷的脫除率為66.00%,鎘的脫除率為87.14%,鉛的脫除率為88.88%;馬尾藻中鉻的脫除率為55.56%,砷的脫除率為56.89%,鎘的脫除率為87.14%,鉛的脫除率為96.44%。說明該脫除工藝還具有一定的適用性。

表6 脫除工藝對不同藻類中有害元素脫除率的影響Table 6 Effect of removal process on removal rate of harmful elements in different algae

3 結(jié)論

本文通過對脫除劑的選擇、單因素實驗及正交實驗優(yōu)化,確定1.5% EDTA-2Na作為脫除劑,在時間為4 h,料液比為1∶30 g/mL,溫度為30 ℃時,對鉻、砷、鎘、鉛的脫除率分別為71.34%、66.32%、87.40%、87.64%,脫除后鉻、砷、鎘、鉛的含量分別為1.71、26.78、0.27、0.21 mg/kg,其中鉛的含量低于標(biāo)準(zhǔn)限量,該法對銅藻中活性成分巖藻黃質(zhì)的損失率在可接受范圍,采用HPLC-ICP-MS對處理前后銅藻中的砷形態(tài)進行分析,結(jié)果表明此脫除工藝處理后銅藻中毒性較大的As3+、As5+含量分別降低100%、91.43%。將該工藝應(yīng)用于羊棲菜和馬尾藻,均得到較好的脫除效果。此方法簡單,易操作,具有一定的廣泛性,可用于工業(yè)生產(chǎn),適合作為將銅藻或其他藻類開發(fā)成相關(guān)產(chǎn)品的前期處理。

原料銅藻及其他藻類中鉻、砷、鎘、鉛超標(biāo)嚴重,但其有效部位中鉻、砷、鎘、鉛的含量是否超過標(biāo)準(zhǔn)目前相關(guān)研究較少,后續(xù)課題組將圍繞脫除工藝應(yīng)用于原料海藻后是否能夠降低有效部位中鉻、砷、鎘、鉛含量的研究,為銅藻的后續(xù)開發(fā)提供技術(shù)支持。