人參低聚肽對(duì)老年db/db小鼠血糖及免疫調(diào)節(jié)的作用

樊 蕊,郝云濤,劉欣然,李 勇

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系,北京 100191)

糖尿病(Diabetes)是以高血糖為特征,由體內(nèi)胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足而引起以糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂為主的內(nèi)分泌疾病。長(zhǎng)期糖脂代謝紊亂可引起多系統(tǒng)損害,導(dǎo)致眼、腎、心臟、血管等組織器官的慢性進(jìn)行性病變、功能減退及衰竭。如今,人口老齡化是全球正在面臨的挑戰(zhàn),增齡可能是糖尿病發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因素,同時(shí)糖尿病老年患者更是面臨多種并發(fā)癥,因此,預(yù)防老年人的糖尿病發(fā)生以及改善糖尿病老年患者的生存質(zhì)量具有重要的意義。

早在1988年,有學(xué)者從人參中分離出一個(gè)具有胰島素作用的14肽,表明其具有抗脂肪分解,降低血糖和肝糖原的作用[1]。隨后,多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明人參肽具有調(diào)節(jié)血糖血脂的作用,但這些研究涉及的動(dòng)物模型均為人工造模[2-4],而對(duì)于自發(fā)糖尿病動(dòng)物的降糖作用,特別是自發(fā)糖尿病老年小鼠的血糖水平和疾病狀態(tài)鮮有報(bào)道。并且相比于多肽,低聚肽具有吸收快、安全性高、生物活性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[5]。因此,是否可將人參低聚肽用于糖尿病的營(yíng)養(yǎng)防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

研究報(bào)道,細(xì)胞衰老與糖尿病的關(guān)系復(fù)雜而微妙,糖尿病造成的高糖、炎癥微環(huán)境及脂毒性等促使細(xì)胞衰老并進(jìn)一步累積,反之,細(xì)胞衰老由于永久性周期停滯直接引起胰島β細(xì)胞功能障礙、脂質(zhì)代謝障礙等細(xì)胞功能障礙、通過間接分泌衰老相關(guān)分泌表型介導(dǎo)慢性低水平炎癥狀態(tài)等,引起糖尿病及其并發(fā)癥[6]?？梢?探討老年糖尿病的疾病狀態(tài)對(duì)提高老年糖尿病患者的生存質(zhì)量具有重要的作用。

雖然以往研究報(bào)道人參肽可以降低過氧化損傷模型大鼠血清脂質(zhì)氧化產(chǎn)物和蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物含量,提高其血清抗氧化酶活力[7],并且可以減輕大鼠慢性炎癥[8],但人參低聚肽是否可以通過調(diào)節(jié)糖尿病老年小鼠的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激狀態(tài),達(dá)到改善血糖的效果并未有所證實(shí)。因此,本文對(duì)db/db小鼠進(jìn)行終生喂養(yǎng),對(duì)老年db/db小鼠進(jìn)行血糖和糖耐量水平的測(cè)定,評(píng)價(jià)其炎癥反應(yīng)程度和氧化應(yīng)激狀態(tài),評(píng)估人參低聚肽對(duì)老年db/db小鼠疾病狀態(tài)的改善作用,為改善老年糖尿病患者的生存質(zhì)量提供有效的膳食營(yíng)養(yǎng)解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參低聚肽 吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司,淡黃色固體粉末,利用生物酶解技術(shù)從吉林人參中得到的小分子生物活性肽的混合物。經(jīng)過高效液相色譜純化后,利用質(zhì)譜儀分析,混合物中小分子低聚肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占95.42%。進(jìn)一步利用高效液相色譜法分析,可知其游離氨基酸總量占3.94%,氨基酸組成見表1;IL-1β、IL-6、TNF-α試劑盒 北京麥格泰克科技有限公司;GSH-Px、SOD、MDA試劑盒 北京中生北控公司;db/db 型小鼠 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0010),屏障環(huán)境動(dòng)物房(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(京)2016-0041)。

表1 人參低聚肽氨基酸成分表Table 1 The amino acid composition of Ginseng oligopeptide

安穩(wěn)血糖儀、安穩(wěn)血糖試紙 三諾公司;352型酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems Multiskan MS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取10周齡的45只空腹血糖水平≥11.1 mmol/L的db/db雄性小鼠(體重23±2 g),按空腹血糖水平隨機(jī)分為3組:老年模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組(鹽酸二甲雙胍腸溶片225 mg/kg·bw)、人參低聚肽干預(yù)組(0. 50 g/kg·bw),每組15只。另取10周齡15只db/m雄性小鼠作為正常對(duì)照組,待以上小鼠飼養(yǎng)至57周,另取10周齡空腹血糖水平≥11.1 mmol/L db/db雄性小鼠(15只)作為青年模型對(duì)照組,各組小鼠繼續(xù)飼養(yǎng),終生干預(yù)。整個(gè)干預(yù)期各組小鼠均給予普通飼料,自由飲食、飲水。同時(shí)陽性對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組分別予以相應(yīng)劑量的二甲雙胍和人參低聚肽,每天灌胃1次。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室符合國(guó)標(biāo)清潔級(jí),溫度范圍(25±1) ℃,相對(duì)濕度50%～60%,室內(nèi)照明控制在12 h/12 h光暗周期節(jié)律。待老年模型組、正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組小鼠飼養(yǎng)至70周以后,青年對(duì)照組小鼠飼養(yǎng)至23周后,進(jìn)行空腹血糖、糖耐量指標(biāo)檢測(cè)。老年模型組、正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組小鼠飼養(yǎng)至82周,青年對(duì)照組小鼠飼養(yǎng)至35周,處死。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè)

1.2.2.1 動(dòng)物一般狀態(tài)觀察及體格指標(biāo)測(cè)定 每周觀測(cè)并記錄動(dòng)物的活動(dòng)度、毛發(fā)光澤、攝食量、飲水量、體質(zhì)重量。

1.2.2.2 隨機(jī)空腹血糖檢測(cè) 小鼠飼養(yǎng)至70周后,每隔4周監(jiān)測(cè)隨機(jī)空腹血糖,測(cè)定前禁食6 h,測(cè)定時(shí)剪尾取血,采用血糖儀測(cè)定及記錄。

1.2.2.3 糖耐量檢測(cè)方法 分別將飼養(yǎng)至82周的db/db和db/m小鼠,飼養(yǎng)至35周齡的青年db/db小鼠在測(cè)定前一天禁食12 h(自由飲水),禁食結(jié)束時(shí)灌胃給予葡萄糖溶液(50%質(zhì)量分?jǐn)?shù)),劑量為4 μg/g·bw,測(cè)定給予葡萄糖后0、0.5、1.0、2 h 的血糖值,并計(jì)算血糖曲線下面積。

血糖曲線下面積(AUC)=1/2×(0 h 血糖值+0.5 h 血糖值)×0.5+1/2×(0.5 h 血糖值+1 h 血糖值)×0.5+1/2×(1 h 血糖值+2 h 血糖值)×1

1.2.2.4 臟器質(zhì)量和指數(shù) 分別將飼養(yǎng)至82周的db/db和db/m小鼠,飼養(yǎng)至35周齡的db/db小鼠,稱重后脫頸椎處死,無菌快速分離腎周脂肪、睪周脂肪,剝離腓腸肌,稱重;分別稱取小鼠的肝臟、腎臟、脾、胰腺、肺,計(jì)算臟器指數(shù)/脂肪指數(shù)。

臟器/脂肪指數(shù)(%)=臟器/脂肪重量(g)/體重(kg)×100

1.2.2.5 血清炎癥指標(biāo)檢測(cè) 分別將飼養(yǎng)至82周的db/db和db/m小鼠,飼養(yǎng)至35周齡的db/db小鼠,摘眼球采血,取血清,按照試劑盒說明書操作,檢測(cè)白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.2.2.6 血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 分別將飼養(yǎng)至82周的db/db和db/m小鼠,飼養(yǎng)至35周齡的db/db小鼠,摘眼球采血,取血清,按照試劑盒說明書操作,檢測(cè)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 一般狀態(tài)觀察

正常對(duì)照組小鼠狀態(tài)良好,活動(dòng)正常,反應(yīng)靈敏,動(dòng)作敏捷,毛色有光澤;老年模型對(duì)照組、青年模型對(duì)照組、以及陽性對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組均出現(xiàn)明顯的多飲、多食及多尿癥狀,并且活動(dòng)量出現(xiàn)不同程度的減少,動(dòng)作遲緩,被毛不光潔甚至脫毛的現(xiàn)象,但其中人參低聚肽干預(yù)組可以明顯的觀察到小鼠的反應(yīng)和動(dòng)作速度有一定程度的改善,并且脫毛現(xiàn)象也不及其它各組嚴(yán)重。

各組老年小鼠飼養(yǎng)至82周,正常對(duì)照組未見死亡,老年模型對(duì)照組死亡4只;陽性對(duì)照組死亡2只,人參低聚肽干預(yù)組死亡1只。

2.2 人參低聚肽對(duì)老年db/db小鼠血糖調(diào)節(jié)的影響

由表2可以看到,隨著周齡增加,老年模型對(duì)照組小鼠血糖出現(xiàn)降低趨勢(shì),陽性對(duì)照組小鼠血糖出現(xiàn)增加趨勢(shì)。老年模型對(duì)照組血糖高于正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組。其中老年模型對(duì)照組小鼠在70周齡時(shí)的空腹血糖顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05),同時(shí),陽性對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組的小鼠空腹血糖低于老年模型對(duì)照組(P<0.05)。隨著飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),陽性對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組的小鼠空腹血糖顯著低于老年模型對(duì)照組,但未呈現(xiàn)顯著性差異(P>0.05),其原因可能是隨著周齡的增加,老年模型對(duì)照組的血糖出現(xiàn)了下降的趨勢(shì),同時(shí),老年模型對(duì)照組出現(xiàn)了一定數(shù)量的小鼠死亡現(xiàn)象,此想象與前期報(bào)道相似[9-10]。

表2 人參低聚肽對(duì)老年db/db血糖水平調(diào)節(jié)的影響Table 2 Effect of ginseng oligopeptide on blood glucose level in the aging db/db mice

由圖1a可知,除了老年模型對(duì)照組在餐后1 h出現(xiàn)血糖峰值,且血糖峰值保持恒定,其他各組小鼠均在餐后0.5 h達(dá)到血糖峰值,隨后血糖水平出現(xiàn)不同程度的下降,其中老年模型對(duì)照組的血糖峰值最高,其次為青年模型對(duì)照組,人參低聚肽干預(yù)組和正常對(duì)照組的血糖峰值較低。

圖1b反映了各個(gè)組小鼠口服糖耐量的AUC變化,可以清楚看到,各個(gè)組小鼠AUC大小排序?yàn)?正常對(duì)照組<人參低聚肽干預(yù)組<陽性對(duì)照組<老年模型對(duì)照組<青年模型對(duì)照組,其中老年模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組和青年模型對(duì)照組AUC顯著大于正常對(duì)照組(P<0.05)。人參低聚肽干預(yù)組AUC與正常對(duì)照組AUC相當(dāng),說明人參低聚肽可以改善老年db/db小鼠的糖耐量水平。

圖1 人參低聚肽對(duì)db/db小鼠糖耐量情況的影響Fig.1 The effect of ginseng oligopeptide on glucose tolerance in db/db mice注:與正常對(duì)照組相比,*代表差異顯著,P<0.05。

2.3 人參低聚肽對(duì)db/db小鼠臟器質(zhì)量和指數(shù)的影響

由表3可以看到,老年模型對(duì)照組小鼠的肝臟、腎臟、脾質(zhì)量和指數(shù)均低于人參低聚肽干預(yù)組和陽性對(duì)照組,其中老年模型對(duì)照組脾質(zhì)量顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05),而老年模型對(duì)照組和青年模型對(duì)照組的脾臟指數(shù)均顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)。老年模型對(duì)照組的胰腺質(zhì)量和指數(shù)均高于人參低聚肽干預(yù)組和陽性對(duì)照組,其中胰腺指數(shù)顯著高于青年模型對(duì)照組(P<0.05)。老年模型對(duì)照和青年模型對(duì)照組的腎周脂肪質(zhì)量顯著高于人參低聚肽干預(yù)組和陽性對(duì)照組(P<0.05),而老年模型對(duì)照組的睪周脂肪質(zhì)量和指數(shù)顯著高于正常對(duì)照組、人參低聚肽干預(yù)組和陽性對(duì)照組(P<0.05)。

表3 人參低聚肽對(duì)db/db小鼠臟器質(zhì)量和指數(shù)的影響Table 3 Effects of ginseng oligopeptide on organ mass and index in db/db mice

2.4 人參低聚肽對(duì)db/db小鼠炎癥反應(yīng)程度的影響

由表4可以看出,老年模型對(duì)照組IL-1β、IL-6含量均大于其余各組,而人參低聚肽干預(yù)組的IL-6低于正常對(duì)照組,同時(shí)顯著低于老年模型對(duì)照組(P<0.05),TNF-α含量較高的組是青年模型對(duì)照組和老年模型對(duì)照組,而正常對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組的TNF-α含量相當(dāng),均小于老年模型對(duì)照組、青年模型對(duì)照組。 此表明人參低聚肽干預(yù)可以降低炎癥反應(yīng)。

表4 人參低聚肽對(duì)db/db小鼠炎癥反應(yīng)程度的影響Table 4 Effects of ginseng oligopeptide on the inflammatory reaction in db/db mice

2.5 人參低聚肽對(duì)db/db小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響

由表5可以看到,老年模型對(duì)照和青年模型對(duì)照組的MDA含量高于其他各組,但各組之間并未存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而老年模型對(duì)照組的SOD含量和GSH-Px含量顯著低于正常對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組、陽性對(duì)照和青年模型對(duì)照組(P<0.05)。

表5 人參低聚肽對(duì)db/db小鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響Table 5 Effects of ginseng oligopeptide on the oxidative stress status in db/db mice

3 總結(jié)與討論

相比于正常對(duì)照組小鼠,db/db小鼠均出現(xiàn)明顯的多飲、多食及多尿癥狀,并且出現(xiàn)不同程度的活動(dòng)減少,動(dòng)作遲緩,被毛不光潔甚至脫毛的現(xiàn)象。通過測(cè)定各個(gè)組小鼠的空腹血糖,可以發(fā)現(xiàn),老年模型對(duì)照組血糖高于正常對(duì)照組、人參低聚肽干預(yù)組和陽性對(duì)照組,其中70周齡老年模型對(duì)照組小鼠空腹血糖顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05),同時(shí),陽性對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組的db/db小鼠空腹血糖顯著低于老年模型對(duì)照組(P<0.05)。老年模型對(duì)照組和青年模型對(duì)照組的AUC高于陽性對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組,并且老年模型對(duì)照組糖耐量表現(xiàn)出起點(diǎn)較低,血糖峰值出現(xiàn)較晚,血糖起伏大,但其血糖峰值持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的特點(diǎn)。通過測(cè)定本實(shí)驗(yàn)使用的干預(yù)物人參低聚肽,其精氨酸含量豐富。研究顯示,精氨酸能有效改善胰島素抵抗,加速胰島素分泌[11]。因此,推測(cè)人參低聚肽降低血糖的機(jī)制可能與人參低聚肽中富含精氨酸相關(guān)。

老年模型對(duì)照和青年模型對(duì)照組的小鼠的肝臟、腎臟、脾質(zhì)量和指數(shù)均低于正常對(duì)照組和人參低聚肽干預(yù)組,其中老年模型對(duì)照組脾質(zhì)量顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05),這與文獻(xiàn)報(bào)道的db/db小鼠的脾臟小于db/m小鼠一致[12],這也符合肥胖糖尿病鼠免疫力低下的原則,這表明人參低聚肽干預(yù)可以在一定程度上提高老年db/db小鼠的免疫力。這與前期文獻(xiàn)報(bào)道相似[13]。研究表明7月齡db/db純合仔小鼠見胰腺、胰島部分體積較大,胰島中均見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);12月齡db/db小鼠胰腺部分胰島內(nèi)及其周圍組織有灶性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),部分胰島內(nèi)見較多小導(dǎo)管樣病變,胰腺小導(dǎo)管病變有增生擴(kuò)張及潴留,使得胰島細(xì)胞之間間隙增寬[12]。Homo-Delarche等[14]報(bào)道糖尿病動(dòng)物模型會(huì)出現(xiàn)胰島增生肥大的病理改變。本實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)老年模型對(duì)照組的胰腺質(zhì)量和指數(shù)均高于人參低聚肽干預(yù)組。

老年模型和青年模型對(duì)照組的腎周脂肪質(zhì)量顯著高于人參低聚肽干預(yù)組(P<0.05),而老年模型對(duì)照組的睪周脂肪質(zhì)量和指數(shù)顯著高于正常對(duì)照組、人參低聚肽干預(yù)組和陽性對(duì)照組(P<0.05)。與皮下脂肪相比,內(nèi)臟脂肪周圍存在密集的血管,具有較高代謝活性,很可能與促炎癥因子相關(guān)[15],更易產(chǎn)生大量TNF-α、IL-6等[16]。與脂肪指數(shù)顯示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似,老年模型對(duì)照組IL-1β、IL-6含量均大于其余各組小鼠的含量,研究表明肥胖患者伴隨脂肪物質(zhì)的過度沉積,容易引起炎癥標(biāo)記物的改變。過度的炎癥反應(yīng),會(huì)引起相關(guān)的代謝平衡紊亂,如淋巴淤滯、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等,產(chǎn)生惡性循環(huán)并造成器官的代謝功能障礙。另一方面,脂肪細(xì)胞的過度肥大可促使細(xì)胞破裂,加劇炎癥反應(yīng)[17]。脂肪細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的需求增加,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,引發(fā)胰島素抵抗;其次,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還可激活NF-λB激酶抑制劑(IKK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與2型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[18]。此外,高血糖也能促進(jìn)脂肪細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧,導(dǎo)致脂源性炎癥因子的釋放增加。本文中氧化應(yīng)激狀態(tài)的結(jié)果可以反映上述的機(jī)制,老年模型對(duì)照組和青年模型對(duì)照組的MDA含量高于人參低聚肽干預(yù)組和正常對(duì)照組,同時(shí),正常對(duì)照組、人參低聚肽干預(yù)組和青年模型對(duì)照組的SOD和GSH-Px含量均顯著高于老年模型對(duì)照組(P<0.05)?？梢娙藚⒌途垭目梢杂行Ы档蚫b/db小鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。此結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道相似[7-8]。

綜合圖1人參低聚肽調(diào)節(jié)血糖變化的結(jié)果與炎癥因子和氧化應(yīng)激的結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑制炎癥因子的表達(dá)和分泌,抑制氧化應(yīng)激,可以減輕機(jī)體的炎癥狀態(tài),從而改善胰島素抵抗和糖代謝異常。因此,人參低聚肽通過降低老年db/db小鼠炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激來降低血糖水平。

本研究雖然未能直接檢測(cè)小鼠的胰島素敏感性,但是人參低聚肽干預(yù)的db/db的糖耐量異常改善、內(nèi)臟脂肪含量減少,表明胰島素敏感性得到了一定的改善,同時(shí)血清主要炎癥因子TNF-α、IL-6的水平降低,氧化應(yīng)激狀態(tài)改善,這表明抑制炎癥因子的分泌、降低氧化應(yīng)激可能是人參低聚肽增加胰島素敏感性和改善糖代謝異常的可能作用機(jī)制之一,而后期將對(duì)人參低聚肽如何抑制炎癥因子進(jìn)行深入探討,揭示其改善糖尿病疾病狀態(tài)的可能機(jī)制。