羧甲基殼聚糖-油酸膠束的制備*

尤 靜，李姣姣，梁琳琳，張雪嬌

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

殼聚糖是一種天然陽(yáng)離子多糖，對(duì)有較多負(fù)電荷的腫瘤細(xì)胞有選擇性吸附和電中和的作用，但同時(shí)，水溶性較差和轉(zhuǎn)染效率較低是殼聚糖兩大缺點(diǎn)[1-3]。羧甲基化可以增加殼聚糖在水中的溶解度[4-5]。油酸屬于不飽和高級(jí)脂肪酸，有良好的抗癌作用[6-8]，但是油酸屬于脂溶性成分，口服吸收差，生物利用度低。將羧甲基殼聚糖和疏水性的油酸進(jìn)行接枝，所得到的羧甲基殼聚糖-油酸溶于水時(shí)，會(huì)自動(dòng)形成具有內(nèi)核疏水和外殼親水的膠束結(jié)構(gòu)，增加疏水性物質(zhì)的生物利用率，增強(qiáng)靶向性，并有望展現(xiàn)出協(xié)同抗癌作用。作者主要研究了以不同取代度羧甲基殼聚糖與油酸催化接枝反應(yīng)，通過測(cè)定聚合物的臨界膠束濃度(CMC)來考察不同取代度羧甲基殼聚糖-油酸形成膠束的能力，便于進(jìn)一步優(yōu)化羧甲基殼聚糖-油酸聚合物的合成路線。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖：脫乙酰度90%，上海金穗生物科技有限公司；油酸：分析純，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，N-羥基琥珀酰胺(NHS)：質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，芘：質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；異丙醇、氫氧化鈉、一氯乙酸、冰醋酸、甲醇、無水乙醇：分析純，天津市富宇精細(xì)化工公司。

熒光分光光度計(jì)：LS55，美國(guó)PerkinElmer公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000A，集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；傅立葉變換紅外光譜儀：T27，尤尼柯(上海)儀器有限公司；數(shù)字電導(dǎo)率儀：DDS-307，上海大唐儀器有限公司；冷凍干燥儀：FD-1，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 不同取代度羧甲基殼聚糖(CMCS)的合成

精密稱取2 g殼聚糖加入100 mL圓底燒瓶中，加入適量異丙醇，置于集熱式恒溫磁力攪拌器上，25 ℃攪拌30 min，使其溶脹，然后緩慢加入適量的氫氧化鈉溶液，攪拌一定時(shí)間以形成堿化中心。取適量氯乙酸，分4次加入以上溶液中，加熱至60 ℃反應(yīng)3 h。

將圓底燒瓶中物質(zhì)移入燒杯中加10 mL蒸餾水，用冰醋酸調(diào)至pH=7.0，抽濾，濾餅用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、無水乙醇依次洗滌，所得產(chǎn)物60 ℃烘干，得到淡黃色CMCS，研磨成粉末狀密封后待用。

1.3 電導(dǎo)滴定法測(cè)定CMCS的取代度

500 mL燒杯中精密加入0.1 mol/L 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液20 mL， 25 ℃下攪拌并加入精密稱量的CMCS 0.1 g使其溶解，再加入200 mL蒸餾水稀釋混勻，用0.5 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，并記錄相應(yīng)電導(dǎo)率值。作電導(dǎo)率-氫氧化鈉體積關(guān)系圖，計(jì)算取代度。

1.4 羧甲基殼聚糖-油酸(CMCS-OA)的合成及表征

在圓底燒瓶中加入V(蒸餾水)∶V(甲醇)=1∶4混合液150 mL，緩慢加入精密稱取的0.5 g CMCS，置于集熱式恒溫磁力攪拌器，室溫下攪拌1 h使其充分溶解得到CMCS溶液。另精密量取10 mL甲醇于燒瓶中，室溫下，邊攪拌邊加入EDC 0.065 g、NHS 0.039 g、油酸0.15 mL，充分?jǐn)嚢? h。用分液漏斗將CMCS溶液緩慢加入其中,攪拌反應(yīng)24 h后，將反應(yīng)液置于截留相對(duì)分子質(zhì)量為8 000～14 000的透析袋中用蒸餾水透析48 h，每4 h換1次水。旋蒸，冷凍干燥48 h，即得CMCS-OA。

分別取適量充分干燥的殼聚糖、CMCS、CMCS-OA和溴化鉀粉末研磨，壓片，測(cè)定紅外光譜。

1.5 CMCS的CMC測(cè)定

配制ρ(芘)=0.1 mg/mL的丙酮溶液作為探針儲(chǔ)備，避光放置待用。配制1 mg/mL CMCS-OA母液待用。取12個(gè)10 mL棕色容量瓶中各加10 μL探針儲(chǔ)備溶液，將丙酮除去，再依次加入不同體積的CMCS-OA母液得到質(zhì)量濃度分別為0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005、0.002 5、0.001、0.000 5、0.000 25和0.000 1 mg/mL的CMCS-OA溶液。熒光分光光度法在334 nm測(cè)定熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖，計(jì)算聚合物的CMC值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同取代度CMCS的合成

以取代度為指標(biāo)，參考文獻(xiàn)[9-10]的基礎(chǔ)上正交實(shí)驗(yàn)法(四因素三水平)考察了NaOH質(zhì)量(A)、異丙醇體積(B)、氯乙酸質(zhì)量(C)、殼聚糖的堿化時(shí)間(D)對(duì)CMCS合成的影響，正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 因素水平表

表2 合成CMCS正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果L9(34)

表3 方差分析

1) * 表示差異在0.05水平上顯著。

由表2和表3可知，4個(gè)因素中堿化時(shí)間對(duì)產(chǎn)物取代度影響最大，最佳制備條件為A3B2C1D2。結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按制備CMCS方法，投入殼聚糖2 g，異丙醇30 mL，NaOH 8 g，氯乙酸2.4 g，殼聚糖堿化時(shí)間分別為1、2、3 h，反應(yīng)時(shí)間3 h，反應(yīng)溫度60 ℃。得到取代度為0.815 9、0.968 7、1.114 5的CMCS。

2.2 CMCS取代度的測(cè)定

CMCS分子中同時(shí)含有—COOH及脫乙?；挠坞x—NH2，將其溶于定量過量的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中，游離的—NH2與定量的鹽酸發(fā)生反應(yīng)，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定時(shí)，首先中和過量鹽酸，電導(dǎo)率由于H+被中和而迅速減小，反應(yīng)完全時(shí)，出現(xiàn)第1個(gè)拐點(diǎn)V1。繼續(xù)加堿，OH-與—COOH發(fā)生反應(yīng)，生成—COO-，反應(yīng)完全時(shí)，出現(xiàn)第2個(gè)拐點(diǎn)V2，第1個(gè)至第2個(gè)拐點(diǎn)間消耗的氫氧化鈉的量即為分子中所含—COOH的量。繼續(xù)加堿，由于NaOH增多，使電導(dǎo)率迅速上升。得到電導(dǎo)率與消耗氫氧化鈉體積的關(guān)系圖，見圖1。

V(NaOH)/mL

根據(jù)式(1)、式(2)計(jì)算取代度[11-13]。

A=c×(V2-V1)×10-3m

(1)

取代度=0.203A1-0.058A

(2)

式中：c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V1、V2為NaOH溶液的體積，mL；m為CMCS的質(zhì)量，g。

2.3 CMCS-OA的制備和表征

在EDC和NHS的催化下將油酸接枝到3種不同取代度的CMCS上，得到3批乳白色CMCS-OA聚合物樣品，合成路線見圖2。

圖2 CMCS-OA的合成路線

殼聚糖、CMCS、CMCS-OA的紅外光譜圖見圖3。

σ/cm-1

2.4 CMCS-OA的CMC的測(cè)定

芘是一種強(qiáng)憎水性的熒光探針物質(zhì)[14-15]，以334 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，掃描的發(fā)射光譜具有5個(gè)明顯的發(fā)生峰I1～I(xiàn)5，分別為約372、379、383、390和397 nm。與372 nm處的峰強(qiáng)(I1)相比，383 nm處的峰強(qiáng)(I3)對(duì)環(huán)境變化最敏感。因此，根據(jù)I1/I3變化來研究不同濃度的納米膠束對(duì)芘探針熒光的影響。當(dāng)聚合物質(zhì)量濃度小于CMC時(shí)，體系中沒有膠束存在，I1/I3值保持穩(wěn)定，但當(dāng)膠束形成時(shí)，芘分布于膠束內(nèi)核，I1/I3值迅速下降，所以提示在拐點(diǎn)處聚合物開始形成膠束。

分別用取代度為0.815 9、0.968 7、1.114 5的CMCS與油酸反應(yīng)得到的CMCS-OA(分別標(biāo)記為CMCS-OA1、CMCS-OA2、CMCS-OA3)測(cè)定CMC，見圖4，2條直線交點(diǎn)處的濃度即為CMC值。

logρa(bǔ) CMCS-OA1

由圖4可知， CMCS-OA2和CMCS-OA3的CMC值均為0.039 0 mg/mL，CMCS-OA1的CMC值為0.013 8 mg/mL。3批聚合物樣品均有較小的CMC值，說明CMCS-OA具有良好的形成膠束的能力。

3 結(jié) 論

首先合成了CMCS，正交法初步考察了不同反應(yīng)條件對(duì)CMCS取代度的影響，并以不同取代度的CMCS合成了CMCS-OA，通過測(cè)定其CMC值，驗(yàn)證了CMCS-OA有著良好的形成膠束能力，不僅為進(jìn)一步優(yōu)化CMCS-OA的合成奠定基礎(chǔ)，并且指導(dǎo)了以CMCS-OA為載體包載疏水性物質(zhì)的可能性。