飼用α-半乳糖苷酶活性檢測(cè)方法的探討

李靈平

（河南省畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南 鄭州 450008）

α-半乳糖苷酶又稱蜜二糖酶，是一種外切糖苷酶類，可以催化不同含有α-半乳糖苷類物質(zhì)的底物，α-半乳糖苷是由1 個(gè)蔗糖與1 個(gè)或多個(gè)半乳糖以α-1，6-糖苷鍵連接而成的不溶于水的低聚糖，廣泛存在于畜禽飼料中，大豆、豆粕、棉粕、菜籽粕等α-半乳糖苷含量較豐富。由于單胃動(dòng)物（畜禽）體內(nèi)缺乏水解α-半乳糖苷糖類的酶，食糜中α-半乳糖苷不能被消化吸收利用，在動(dòng)物腸道內(nèi)大量聚集，使動(dòng)物產(chǎn)生腹瀉等癥狀，是飼料中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，這種抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)降低飼料中糖類和蛋白質(zhì)的利用率。α-半乳糖苷酶在飼料中添加應(yīng)用已相當(dāng)普及，可以作為飼料添加劑提高飼料利用率，是降解飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子α-半乳糖苷的關(guān)鍵酶。α-半乳糖苷酶作為一種新型飼料添加劑，在飼料工業(yè)應(yīng)用日益廣泛。酶制劑活性的測(cè)定是酶制劑應(yīng)用效果評(píng)價(jià)的重要組成部分，也是評(píng)價(jià)酶制劑最直接、經(jīng)濟(jì)有效的方式，然而作為衡量酶制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)——酶活力的檢測(cè)，國(guó)內(nèi)至今還沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，還沒有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法，使得α-半乳糖苷酶酶活性的檢測(cè)比較混亂。

α-半乳糖苷酶廣泛存在于植物、微生物和哺乳動(dòng)物某些組織中，來(lái)源不同，其測(cè)定方法和原理有差異，微生物發(fā)酵生產(chǎn)是其重要來(lái)源途徑，α-半乳糖苷酶的微生物生產(chǎn)菌株主要有利用基因工程菌株如大腸桿菌、畢赤酵母菌誘導(dǎo)表達(dá)，還有通過(guò)自然篩選選育出的乳酸菌、芽孢桿菌、青霉、木霉、曲霉菌等。據(jù)研究報(bào)道所知，α-半乳糖苷酶活性的測(cè)定，可以按照作用底物能力劃分，α-半乳糖苷酶作用水解半乳糖苷的寡糖底物通常為棉子糖、水蘇糖、蜜二糖和毛蕊花糖等，工業(yè)上常用的有三種檢測(cè)方法測(cè)定α-半乳糖苷酶的活性，一是葡萄糖氧化酶法，通常以蜜二糖為底物，用葡萄糖氧化酶酶解蜜二糖為葡萄糖，再用warburg 壓力計(jì)測(cè)定其含量法；二是Nelson/Somogyi 比色法，通常以棉子糖為底物，棉子糖經(jīng)酶解后用Nelson/Somogyi 還原糖分析法測(cè)定還原糖含量而計(jì)算出α-半乳糖苷酶酶活力；三是以對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρ NPG）為底物ρNPG法，以ρNPG為底物，經(jīng)酶解后測(cè)定對(duì)硝基酚的含量計(jì)算出α-半乳糖苷酶酶活力。三種測(cè)定方法用于飼用α-半乳糖苷酶酶活力的測(cè)定比較分析，葡萄糖氧化酶法測(cè)定步驟較繁瑣復(fù)雜；Nelson/Somogyi 還原糖分析法由于飼料中成分復(fù)雜，含有豆粕、棉粕等半乳糖苷類成分等影響測(cè)定的干擾因素多，另外，飼用酶制劑的載體含量較多，還原糖含量較高，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確；對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）為底物的ρNPG法，飼料中與ρNPG結(jié)構(gòu)類似物少，具有抗干擾能力強(qiáng)，操作方便等特點(diǎn)，較適宜用于飼用α-半乳糖苷酶酶活力的測(cè)定，α-半乳糖苷酶的優(yōu)選底物是對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρ NPG），優(yōu)選方法為對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）為底物ρNPG法。其測(cè)定方法如下。

1 酶活力定義

α-半乳糖苷酶活性單位：在一定條件下，每分鐘分解ρNPG 底物生成1 μmol 對(duì)硝基酚所需的酶量為一個(gè)α-半乳糖苷酶酶活單位。

2 原理

α-半乳糖苷酶與對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖（ρNPG）反應(yīng)后，生成有色物質(zhì)對(duì)硝基（苯）酚，通過(guò)吸光度值的變化得出對(duì)硝基（苯）酚的生成量，即可計(jì)算出α-半乳糖苷酶酶活力。

3 儀器與設(shè)備

pH計(jì)：精確到0.01 pH值；分析天平：感應(yīng)0.0001 g；紫外-可見分光光度計(jì)：波長(zhǎng)準(zhǔn)確度±1 nm，吸光度值精確至0.001；恒溫水浴槽：控溫精度±0.5 ℃；離心機(jī)；磁力攪拌器：附加熱功能；秒表；移液器：精度1μL。

4 主要試劑

無(wú)水醋酸鈉（AR）；冰醋酸（AR）；碳酸鈉（AR）；對(duì)硝基酚（ρ-nitrophenol，ρ NP）標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）；對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρ-nitrophenyl-alpha-D-galactopyr anoside，ρNPG）（純度98%）（AR）；試驗(yàn)用水符合GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)。

5 試劑配制

5.1 pH值5.0醋酸鈉緩沖液

A：0.05 mol/L 醋酸鈉緩沖液：稱取無(wú)水醋酸鈉4.2 g 定容至1 000 mL。

B：冰醋酸溶液：稱取冰醋酸3.0 mL定容至1 000 mL。用B調(diào)節(jié)A至pH值5.0即成。

5.2 0.2 mol/L碳酸鈉溶液

0.2 mol/L 碳酸鈉溶液：稱取21.198 g 無(wú)水碳酸鈉，定容至1 000 mL。

5.3 10 mmol/L對(duì)硝基（苯）酚標(biāo)準(zhǔn)（儲(chǔ)備）溶液

10 mmol/L對(duì)硝基（苯）酚標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.1391g對(duì)硝基（苯）酚，用0.2 mol/L 碳酸鈉溶液定容至100 mL，4℃下保存。

5.4 10 mmol/L對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）溶液

10 mmol/L 對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG）溶液：稱取0.3031g 對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷（ρNPG），用0.05 mol/L pH值5.0醋酸鈉緩沖液定容至100 mL，置棕色試劑瓶于4℃下保存。

6 分析步驟

6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

依次移取10 mmol/L 對(duì)硝基（苯）酚標(biāo)準(zhǔn)（儲(chǔ)備）溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，用0.2 mol/L 碳酸鈉溶液定容到100 mL，配成濃度即為0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L 的對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別吸取0.5 mL 對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（做3 個(gè)重復(fù)）于試管中，分別加入0.5 mL 醋酸鈉緩沖液；然后在對(duì)照的空白樣試管中加入1.0 mL 醋酸鈉緩沖液（做3 個(gè)重復(fù)）；在所有試管中加入4.0 mL 碳酸鈉溶液，振蕩，在405 nm處測(cè)定吸光度OD值。

對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以對(duì)硝基酚濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值OD405值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用Excel做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，要求R2＞0.999。

6.2 酶液的制備

6.2.1 固體樣品待測(cè)酶液制備

酶液制備：通過(guò)“四分法”精確品稱取α-半乳糖苷酶1.0 g 左右，用醋酸鈉緩沖液溶解然后定容至100 mL，37 ℃水浴，150 r/min震蕩30 min，3 000 r/min離心20 min，過(guò)濾得上清液即粗酶液備用。

根據(jù)酶活力高低，可將粗酶液適當(dāng)稀釋，使吸光度值OD405值在0.1～0.6之間，所得酶活力較為準(zhǔn)確。

樣品測(cè)定：將粗酶液和ρNPG底物溶液于37 ℃下水浴預(yù)熱10 min，然后再吸取各溶液0.5 mL 充分混合，37 ℃恒溫水浴10 min，加入4.0 mL 碳酸鈉溶液，振蕩混勻，終止酶反應(yīng)，在405 nm 測(cè)定吸光值。

空白測(cè)定：另取0.5 mL 稀釋酶液和4.0 mL 碳酸鈉溶液37 ℃預(yù)熱3 min，然后加入ρNPG 底物溶液，37℃水浴10 min，在405 nm 測(cè)定吸光值，作為空白對(duì)照。

6.2.2 液體樣品待測(cè)酶液制備

將液體樣品待測(cè)酶液3 000 r/min離心20 min，過(guò)濾得上清液即為粗酶液備用。

根據(jù)酶活力高低，可將粗酶液適當(dāng)稀釋，使吸光度值OD405值在0.1～0.6之間，所得酶活力較為準(zhǔn)確。

樣品測(cè)定：稱取α-半乳糖苷酶酶液和ρNPG底物溶液于37 ℃下水浴預(yù)熱10 min，然后再吸取各溶液0.5 mL 充分混合，37 ℃恒溫水浴10 min，加入4.0 mL 碳酸鈉溶液，振蕩混勻，終止酶反應(yīng)，在405 nm 測(cè)定吸光值。

空白測(cè)定：另取0.5 mL 酶液和4.0 mL 碳酸鈉溶液37 ℃預(yù)熱3 min，然后加入ρNPG 底物溶液，37℃水浴10 min，在405 nm 測(cè)定吸光值，作為空白對(duì)照。

7 酶活計(jì)算

7.1 固體樣品

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算α-半乳糖苷酶酶活力，其計(jì)算公式如下：

α-半乳糖苷酶酶活力（U·g-1）A＝[（Ax-A0）×K+C0]×Df/mt

式中：Ax：樣品酶液吸光度OD值；A0：空白吸光度OD值；K：對(duì)硝基（苯）酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；C0：對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；Df：稀釋倍數(shù)；m：稱取樣品質(zhì)量/g；t：反應(yīng)時(shí)間/min。

7.2 液體樣品

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算α-半乳糖苷酶酶活力，其計(jì)算公式如下：

α-半乳糖苷酶酶活力（U·mL-1）A＝[（Ax-A0）×K+C0]×Df/vt

式中：Ax：樣品酶液吸光度OD值；A0：空白吸光度OD值；K：對(duì)硝基（苯）酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；C0：對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；Df：稀釋倍數(shù)；v：吸取樣品酶液體積/mL；t：反應(yīng)時(shí)間/min。

8 討論

α-半乳糖苷酶作為一種活性微生物制劑，它對(duì)溫度、反應(yīng)pH 值十分敏感，不同菌株生產(chǎn)的纖維素酶最適作用pH 值、最佳作用溫度有所不同，測(cè)定方法有待進(jìn)一步探討。

考慮到飼用酶制劑的作用環(huán)境，飼用酶制劑的作用位點(diǎn)是動(dòng)物的消化道，其反應(yīng)的pH值和溫度與工業(yè)酶制劑最高酶活條件差異，建議反應(yīng)溫度37 ℃，反應(yīng)體系pH 值5.0條件下進(jìn)行。