急性腦梗死病人發(fā)病后脾臟體積變化及與血清炎性因子、T淋巴細胞的相關(guān)性分析

潘晶晶

目前急性腦梗死已成為我國致殘、致死的主要疾病之一，急性腦梗死的發(fā)生激活顱內(nèi)免疫應(yīng)答，引起大量炎性因子釋放，破壞血管內(nèi)皮細胞連接緊密性，增加血腦屏障通透性[1-4]。一些淋巴細胞、炎性因子等通過受損血腦屏障進入腦實質(zhì)，從而進一步加重腦損傷。脾臟作為外周免疫器官，在生理或病理應(yīng)激刺激下，將免疫細胞、血小板等釋放至血液循環(huán)系統(tǒng)中，因其釋放的血小板體積大、活性強，引起血小板反應(yīng)，嚴重影響缺血性腦血管疾病病人預(yù)后[5-6]。有文獻報道，血小板高反應(yīng)性(high on treatment platelet reactivity，HPR)卒中病人預(yù)后較差，且多出現(xiàn)復(fù)發(fā)[7-8]。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)腦缺血后，脾臟大量釋放免疫細胞和炎性因子進入體液循環(huán)中，自身體積出現(xiàn)縮小[9]。有文獻報道，脾臟切除將大大降低體液循環(huán)中淋巴細胞和炎性因子數(shù)量，從而阻止T淋巴細胞信號因子傳遞，進而發(fā)揮腦保護作用[10]。本研究觀察急性腦梗死發(fā)生后脾臟體積變化特點，并探討其與炎性因子、T淋巴細胞的關(guān)系，以期為急性腦梗死在免疫學上的治療提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料收集 選取2016年1月—2018年1月發(fā)病24 h內(nèi)入住我院的急性腦梗死病人作為研究對象。納入標準：經(jīng)頭顱CT/MRI檢查符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[11]中的急性腦梗死診斷標準；發(fā)病24 h內(nèi)入院就診，且美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分>5分[12]；年齡≥18歲；根據(jù)急性腦卒中TOAST分型明確為動脈粥樣硬化型腦梗死、心源型腦梗死或小動脈閉塞型腦梗死；入院前服用阿司匹林7 d以上。排除標準：伴有癲癇或急性心肌梗死病人；伴有腫瘤、自身免疫疾病或血液疾病病人；長期服用免疫抑制劑病人；伴有泌尿系統(tǒng)、肺部感染病人；伴有心、肺、腹部嚴重疾病，不能配合完成各項檢查病人。最終納入符合納入和排除標準病人63例，其中陳舊性腦梗死13例；陳舊性心肌梗死13例；入院時NIHSS評分(9.07±3.25)分；入院后NIHSS評分(7.09±3.18)分；梗死部位：大腦半球25例，后循環(huán)19例，基底節(jié)14例；梗死類型：大動脈粥樣硬化36例，心源性腦梗死10例，穿支動脈17例。選擇同期與急性腦梗死病人基本資料匹配的非急性腦梗死病人30例作為對照組，年齡≥18歲，入院前服用阿司匹林7 d以上，伴有至少兩項腦血管疾病危險因素，如：高血壓、糖尿病、吸煙和飲酒等。排除標準同急性腦梗死組。所有入選病人均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集病人基本資料(姓名、性別、年齡、身高、體重)、既往病史(高血壓、糖尿病、心臟疾病、卒中病史、高脂血癥等)、藥物使用情況、個人嗜好(吸煙、飲酒)、家族史、實驗室檢查(血常規(guī)、血糖、血脂、肝腎功能、凝血)、影像學資料(頭顱CT/MRI、頭頸血管彩色超聲/磁共振血管造影)。

1.2.2 脾臟體積測量 急性腦梗死病人入院時，發(fā)病36 h、3 d和5 d，參照文獻[13]方法使用彩超測量脾臟體積，即病人平臥休息10 min，之后取右側(cè)臥位，探頭平行肋間隙，二維聲像圖上清晰顯示脾臟體積調(diào)整至脾門切面(厚度最大切面)，測量脾臟長徑(a)和厚徑(b)，之后轉(zhuǎn)動探頭垂直于肋間隙測量寬徑(c)，脾臟體積(V)=a×b×c×π/6。彩超型號：Philips iu-22，探頭設(shè)置為“Abdomen”，頻率為2～5 MHz。同時測量對照組脾臟體積確定脾臟基線，本研究彩超測量均由同一位醫(yī)師完成。

1.2.3 血清炎性因子血清干擾素-γ檢測 采用酶聯(lián)免疫試劑盒(ELSIA)檢測血清干擾素-γ，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測，試劑盒購自賽默飛生物有限公司。

1.2.4 T淋巴細胞檢測 采集肘靜脈血3 mL，充分搖勻，采用流式細胞儀檢測T淋巴細胞，即取100 μL抗凝血加入至上樣管中，充分混勻，之后分別加入熒光素標記的抗體20 μL(異硫氰酸熒光素標記的抗CD4單克隆抗體、藻紅蛋白標記的抗CD8單克隆抗體、葉綠素蛋白標記的抗CD19單克隆抗體、藻紅蛋白標記的CD56單克隆抗體)，同時進行陰性對照，渦旋混勻，避光室溫孕育20 min，之后分別加入2 mL經(jīng)10倍稀釋的破紅細胞低滲液，渦旋混勻，避光室溫孕育10 min，之后離心棄上清液，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次，最后懸浮于5 mL的PBS中，采用流式細胞儀檢測CD4T、CD8T、CD19B、CD6自然殺傷淋巴細胞百分比，計算相應(yīng)絕對值。

1.2.5 血小板反應(yīng)性檢測 采用PL-12血小板功能分析儀檢測血小板最大聚集率(AA-MAR)。細胞檢測同時，抽取肘靜脈血6 mL，注入660 μL、3.8%的枸櫞酸鈉專用管中搖勻，取0.3 mL至PL-12檢測管中自動檢測。獲得基礎(chǔ)數(shù)值后，加入25 μL的誘聚劑AA，連續(xù)間隔2 min得到標本中血小板計數(shù)，得到最低血小板計數(shù)時結(jié)果自動換算。最大血小板聚集率(%)=(基礎(chǔ)血小板數(shù)平均值-最低血小板數(shù))/基礎(chǔ)血小板數(shù)平均值×100%。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較(見表1)

表1 兩組臨床資料比較

2.2 對照組和急性腦梗死組不同時間脾臟體積和淋巴細胞變化 急性腦梗死病人脾臟體積先縮小后增大。與對照組比較，急性腦梗死病人發(fā)病24h內(nèi)和36 h脾臟體積縮小，且36 h脾臟體積小于24 h脾臟體積，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，發(fā)病3d和5d脾臟體積增大，且5d脾臟體積大于3 d脾臟體積，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，急性腦梗死病人發(fā)病24h內(nèi)、36h、3d和5 d時T4淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷淋巴細胞水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中發(fā)病36 h三種淋巴細胞水平高于發(fā)病24 h內(nèi)，而發(fā)病36 h后隨著時間延長，三種淋巴細胞水平不斷升高，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。T8淋巴細胞不同時間呈升高趨勢，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 對照組和急性腦梗死組不同時間脾臟體積、淋巴細胞變化(±s)

2.3 對照組和急性腦梗死組不同時間AA-MAR和血清干擾素-γ變化 急性腦梗死病人發(fā)病24 h內(nèi)、36 h、3 d和5 d AA-MAR和血清干擾素-γ于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，發(fā)病36 h AA-MAR和血清干擾素-γ水平高于發(fā)病24h內(nèi)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。發(fā)病3 d AA-MAR和血清干擾素-γ水平出現(xiàn)下降，與發(fā)病36h比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；發(fā)病5 d AA-MAR和血清干擾素-γ水平低于發(fā)病3d，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 對照組和急性腦梗死組不同時間AA-MAR和血清干擾素-γ變化(±s)

2.4 急性腦梗死病人不同時間脾臟體積與淋巴細胞水平、血小板反應(yīng)性、炎性因子的相關(guān)性分析 急性腦梗死病人發(fā)病24 h內(nèi)和發(fā)病36 h，T4淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷淋巴細胞與脾臟體積呈負相關(guān)，發(fā)病3 d和5 d未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。不同時間T8淋巴細胞和脾臟體積無相關(guān)性。發(fā)病24h內(nèi)、36h和3d時，AA-MAR、干擾素-γ與脾臟體積均呈負相關(guān)，而發(fā)病5 d均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。詳見表4。

表4 急性腦梗死病人不同時間脾臟體積與淋巴細胞水平、血小板反應(yīng)性、炎性因子的相關(guān)性分析

3 討 論

動物和臨床試驗均已證明免疫炎癥反應(yīng)加重缺血性腦損傷，但其具體作用機制未見明確報道。本研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死急性期脾臟體積先縮小后變大，淋巴細胞發(fā)生相應(yīng)變化，與已有文獻報道[13]結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)急性腦梗死急性期AA-MAR發(fā)生相應(yīng)變化，提示急性腦梗死發(fā)病后脾臟通過釋放血小板、炎性因子及淋巴細胞等加重病人病情。

國外學者通過構(gòu)建腦卒中動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦卒中后脾臟體積出現(xiàn)明顯縮小，重量減輕，且在發(fā)病2 d時達到最小，隨后開始變大，發(fā)病4 d時恢復(fù)正常[9]。本研究選取發(fā)病24 h內(nèi)、36 h、3 d和5 d 4個時間對急性腦梗死病人脾臟體積進行測量，結(jié)果顯示發(fā)病24 h內(nèi)，病人脾臟體積和對照組比較出現(xiàn)縮小，發(fā)病36 h脾臟體積最小，發(fā)病3 d時脾臟體積大于對照組，發(fā)病5 d時脾臟體積最大，與上述研究結(jié)果一致。Seifert等[9]采用大腦動脈閉塞構(gòu)建卒中模型，并采用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記脾臟細胞，發(fā)現(xiàn)脾臟體積減小，循環(huán)中被標記的脾臟細胞增多，推測可能與脾臟體積減小有關(guān)。有學者認為，脾臟體積縮小與交感神經(jīng)系統(tǒng)激活有關(guān)，因脾被膜的α1腎上腺素激活后，刺激脾被膜平滑肌收縮，從而引起脾臟體積減小[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死發(fā)生后4個時間干擾素-γ呈先升高后降低趨勢。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，通過大腦動脈閉塞構(gòu)建卒中模型后，循環(huán)中干擾素-γ先升高后恢復(fù)正常，但與本研究達到峰值時間不同，可能與大腦動脈閉塞構(gòu)建卒中時間有關(guān)[13-14]。本研究通過相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾素-γ與脾臟體積呈負相關(guān)，且隨著脾臟體積波動而變化。有研究發(fā)現(xiàn)，脾臟切除大腦動脈閉塞構(gòu)建卒中模型腦梗死病灶內(nèi)干擾素-γ水平低于未切除脾臟卒中模型，腦梗死病灶體積更大，注射重組干擾素-γ后，梗死體積明顯增大，提示干擾素-γ抵抗脾臟切除的神經(jīng)保護作用[16]。結(jié)合本研究結(jié)果認為，脾臟可能通過產(chǎn)生或釋放干擾素-γ等炎性因子參與腦卒中損傷，其具體作用機制需進一步探討。

有文獻報道，腦缺血后機體固有免疫吸引大量淋巴細胞進入顱內(nèi)，促進炎性反應(yīng)，直接損傷神經(jīng)細胞，進而加重卒中損傷[17]。本研究發(fā)現(xiàn)在急性腦梗死發(fā)生后T4淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷淋巴細胞增多，且在發(fā)病36 h與脾臟體積呈負相關(guān)，而不同時間T8細胞與脾臟體積未見相關(guān)性。脾臟作為重要的免疫器官，含有大量淋巴細胞，在循環(huán)中被抗原激活離開脾臟。有研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中發(fā)生后外周血淋巴細胞明顯增加，其與脾臟體積呈負相關(guān)，但未進行淋巴亞群分析[18]。Seifert等[9]采用CFSE標記脾臟細胞發(fā)現(xiàn)被釋放進循環(huán)，進入病灶，這些細胞最終證實為自然殺傷細胞、T淋巴細胞和單個核細胞。本研究證實淋巴細胞與脾臟體積相關(guān)，進一步驗證脾臟通過釋放淋巴細胞參與急性腦梗死損傷的推論，并明確參與損傷的細胞主要為T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷淋巴細胞。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦卒中后血小板AA-MAR增強，且其變化與脾臟體積存在相關(guān)性。有文獻報道，抗栓治療后HPR是卒中病人預(yù)后和復(fù)發(fā)的獨立危險因素[7]。臨床中多采用血小板聚集率反映血小板反應(yīng)，血小板平均體積越大，其反應(yīng)性越高。有學者發(fā)現(xiàn)，脾臟內(nèi)血小板體積大于循環(huán)中血小板，而心肌梗死后循環(huán)中血小板體積進一步增大，血小板反應(yīng)性增高，當脾臟切除后，抵抗血小板反應(yīng)性[6]。目前脾臟釋放血小板和血小板被激活的作用機制未有明確報道，有學者認為其可能與兒茶酚胺升高有關(guān)[19]。因此，關(guān)注缺血誘導的脾臟釋放體積較大的高反應(yīng)性血小板，是治療急性腦梗死的重要途徑之一。

目前臨床已證實在溶栓時間窗內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用芬戈莫德和阿替普酶可明顯減小腦梗死面積，改善病人預(yù)后，且未增加不良反應(yīng)發(fā)生[20]。有文獻報道，發(fā)病4.5 h后給予芬戈莫德，主要抑制淋巴細胞釋放，減輕腦損傷程度，促進病情恢復(fù)[21]。有學者構(gòu)建動物卒中模型后注射多能成體祖細胞，抑制脾臟釋放淋巴細胞，從而減輕免疫損傷，改善預(yù)后[22]。脾臟參與急性腦梗死免疫應(yīng)答的部分機制，血小板、淋巴細胞及炎性因子均有可能成為急性腦梗死治療的新靶點。