白藜蘆醇通過PI3K/Akt/GSK-3β通路對(duì)6-OHDA致帕金森病小鼠神經(jīng)退行性病變改善的作用研究

楊小鷗，楊國偉，劉志孝，孫 靜

帕金森病(Parkinson′s disease)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，老年人群發(fā)病率位居第二位，僅次于阿爾茨海默病[1]，其病理特征主要是中腦黑質(zhì)區(qū)域致密部多巴胺能神經(jīng)元變性或缺失，導(dǎo)致紋狀體多巴胺能神經(jīng)元減少及Lewy氏小體形成[2-3]。臨床主要表現(xiàn)為靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉僵硬等一系列運(yùn)動(dòng)功能障礙[4]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[5]，主要依賴于其對(duì)底物的磷酸化作用，參與細(xì)胞增殖、凋亡等過程，在帕金森病發(fā)展過程中起重要作用[6-7]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年來發(fā)現(xiàn)的，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的一條重要信號(hào)通路，其活化后使GSK-3β失活，從而避免細(xì)胞凋亡的發(fā)生[8-9]。白藜蘆醇是廣泛存在于各種水果、蔬菜中的一種多酚類化合物[10]，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗凋亡作用[11]，且有研究證實(shí)其通過多種途徑對(duì)帕金森病等神經(jīng)退行性疾病具有一定的保護(hù)作用[12]，但白藜蘆醇通過PI3K/Akt/GSK-3β通路改善帕金森病的神經(jīng)退行性病變報(bào)道較少。本研究探討白藜蘆醇通過PI3K/Akt/GSK-3β通路改善6-羥基多巴胺(6-OHDA)所致帕金森病小鼠神經(jīng)退行性病變，從而為白藜蘆醇的臨床使用提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，10～11周齡，體重20～25 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司，動(dòng)物批號(hào)：SCXK(魯)20170001，飼養(yǎng)于沈陽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心潔凈動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室恒溫恒濕SPF級(jí)條件下，高壓滅菌飲用水和飼料，自由攝取。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 白藜蘆醇購自湖南正清生物有限公司；TUNEL試劑盒購自北京碧云天生物科技有限公司；磷酸化蛋白激酶(p-Akt)鼠源單抗、磷酸化糖原合成酶激酶3(p-GSK-3β)兔源單抗、PI3K兔源單抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)鼠源單抗、抗兔二抗、抗鼠二抗均購自美國Cell Signaling公司；Caspase-3及內(nèi)參引物由上海生工生物工程有限公司合成；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑購自上海生工生物公司。

1.3 動(dòng)物分組 將30只SPF級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組、6-OHDA致病組和白藜蘆醇治療組(Res治療組)，每組10只。Res治療組小鼠在造模前3 h按照20 mg/kg劑量給予灌胃，此后每日均按此標(biāo)準(zhǔn)灌胃1次，持續(xù)至造模后2周；6-OHDA致病組和正常組均給予等量生理鹽水灌胃。

1.4 6-OHDA致帕金森病小鼠模型建立 將6-OHDA在避光條件下溶解于含0.02%抗壞血酸生理鹽水(NS)溶液中，調(diào)整濃度為2 μg/μL。隨機(jī)選取20只實(shí)驗(yàn)小鼠，以0.15%的戊巴比妥按照0.2 mL/kg腹腔注射麻醉。小鼠麻醉后固定于立體定位儀裝置上，頭皮剪開，暴露頭骨。選擇黑質(zhì)致密部，將裝有6-OHDA溶液的微量注射器插入，推動(dòng)速度為1 μL/min，每只小鼠腦內(nèi)注射兩個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)注射2 μL，停止注射4 min后拔針，以免試劑外泄。注射完畢后將小鼠從立體定位儀上取下，并縫合頭皮。正常組小鼠腦內(nèi)注射同等劑量生理鹽水。

1.5 組織取材 造模后2周將小鼠處死，分離腦組織黑質(zhì)，一部分固定于多聚甲醛中，24 h后石蠟包埋，制備5μm厚度組織切片；另一部分置于-80 ℃冰箱保存。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 行為學(xué)觀察 造模2周后，給予各組小鼠0.5 mg/mL嗎啡腹腔注射，以誘導(dǎo)小鼠旋轉(zhuǎn)，觀察行為變化，并記錄小鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。

1.6.2 TUNEL染色觀察腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺神經(jīng)元凋亡 組織石蠟切片脫蠟、水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，之后在3%H2O2中浸洗，加組織蛋白酶K去除蛋白，加TUNEL反應(yīng)溶液，室溫避光孵育1 h后用PBS洗滌，加入信號(hào)轉(zhuǎn)化劑，之后用3，3二氨基聯(lián)苯胺四氯化碳(DBA)顯色處理，最后每個(gè)樣本上加蘇木素，15 s后迅速擦拭，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞核染色情況。

1.6.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測實(shí)驗(yàn)小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)Caspase-3基因表達(dá) 取腦黑質(zhì)組織約50 mg，Trizol提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取2 μL RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，內(nèi)參GAPDH引物序列，上游：ATGCTATTGCGATAGCGATC；下游：ATCGGATTCGATCGATCGA。Caspase-3引物序列，上游：TCGATCGATCGGCAAATCGA；下游：TCGATCGACGTTGCATGCATT。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，36個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳條帶，分析目的基因和參比基因的條帶灰度值。

1.6.4 蛋白印跡法(Western Blot)檢測實(shí)驗(yàn)小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)p-GSK-3β、PI3K、p-Akt蛋白含量 將腦黑質(zhì)組織剪成小塊，加入蛋白裂解液，提取蛋白質(zhì)，離心取上清液，取50 μg總蛋白進(jìn)行鈉十二烷基的硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，隨后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉，加一抗，同時(shí)以GAPDH為內(nèi)參，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖鹽溶液洗滌，根據(jù)一抗種屬加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色，將膠片掃描后使用Bandscan5.0軟件進(jìn)行蛋白灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 帕金森病動(dòng)物模型建立 本研究采用右側(cè)紋狀體注射方法建立帕金森病動(dòng)物模型，造模后第14天皮下注射嗎啡誘發(fā)小鼠旋轉(zhuǎn)，結(jié)果顯示，正常組小鼠無任何行為學(xué)改變，6-OHDA致病組和Res治療組小鼠注射嗎啡5 min后誘發(fā)向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，6-OHDA致病組小鼠30 min內(nèi)向右旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為(203.37±8.32)圈，Res治療組為(102.53±10.03)圈，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明白藜蘆醇能改善6-OHDA所致行為異常。

2.2 TUNEL檢測帕金森病小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺神經(jīng)元凋亡 光學(xué)顯微鏡下各組細(xì)胞核染色圖像見圖1。6-OHDA致病組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺神經(jīng)元凋亡率高于正常組(P<0.05)，Res治療組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)巴胺神經(jīng)元凋亡率低于6-OHDA致病組(P<0.05)，說明白藜蘆醇能有效抑制PD小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)巴胺神經(jīng)元凋亡。詳見圖2。

圖1 光學(xué)顯微鏡下各組細(xì)胞核染色圖像

與6-OHDA致病組比較，＊P<0.05。

2.3 RT-PCR檢測實(shí)驗(yàn)小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)Caspase-3含量 6-OHDA致病組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)Caspase-3含量較正常組增加(P<0.05)，Res治療組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)Caspase-3表達(dá)較6-OHDA致病組明顯降低(P<0.05)。說明白藜蘆醇能抑制PD小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)Caspase-3含量。詳見圖3。

與6-OHDA組比較，＊P<0.05。

2.4 Western Blot檢測實(shí)驗(yàn)小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)PI3K蛋白含量 6-OHDA致病組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)PI3K蛋白含量低于正常組(P<0.05)，Res治療組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)PI3K蛋白含量較6-OHDA致病組小鼠增加(P<0.05)。詳見圖4。

與6-OHDA致病組比較，＊P<0.05。

2.5 Western Blot檢測實(shí)驗(yàn)小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)p-GSK-3β蛋白含量 6-OHDA致病組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)p-GSK-3β蛋白含量低于正常組(P<0.05)，Res治療組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)p-GSK-3β蛋白含量較6-OHDA致病組小鼠提高(P<0.05)。詳見圖5。

與6-OHDA致病組比較，＊P<0.05。

2.6 Western Blot檢測實(shí)驗(yàn)小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)p-Akt蛋白含量 6-OHDA致病組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)p-Akt蛋白含量較正常組降低(P<0.05)，Res治療組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)p-Akt蛋白含量較6-OHDA致病組升高(P<0.05)。詳見圖6。

與6-OHDA致病組比較，＊P<0.05。

3 討 論

帕金森病是老年人群發(fā)病率較高的一種中樞神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病原因復(fù)雜，與遺傳、感染、免疫功能失調(diào)等因素均有關(guān)[1-2]。白藜蘆醇是廣泛存在于各種水果、蔬菜中的一種多酚類化合物[10-11]，相關(guān)研究證實(shí)，白藜蘆醇通過緩解線粒體功能障礙、激活ERK通路、激活沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT1)蛋白等多種途徑對(duì)帕金森病起到神經(jīng)保護(hù)作用[12-13]。

有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡引起的腦黑質(zhì)紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元缺失是引發(fā)帕金森病的一個(gè)重要原因[14]。早期研究發(fā)現(xiàn)，帕金森病病人腦內(nèi)凋亡的神經(jīng)元數(shù)量較正常人增加[15]，有學(xué)者使用TUNEL染色法在因帕金森病死亡病人腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)凋亡神經(jīng)元存在[6]。本研究使用6-OHDA誘導(dǎo)小鼠建立帕金森病模型，造模成功后，實(shí)驗(yàn)小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙，同時(shí)TUNEL染色顯示6-OHDA致病組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元凋亡率高于正常組。

Caspase在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是所有凋亡途徑的關(guān)鍵效應(yīng)器，RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-OHDA致病組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)凋亡蛋白Caspase-3含量增加，說明帕金森病小鼠腦內(nèi)Caspase-3被激活，從而引發(fā)多巴胺能神經(jīng)元凋亡。白藜蘆醇治療后，帕金森病小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙得到顯著改善，腦黑質(zhì)內(nèi)Caspase-3含量被顯著抑制，且多巴胺神經(jīng)元凋亡比例較6-OHDA致病組小鼠下降。說明白藜蘆醇能抑制帕金森病小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)Caspase-3含量，降低多巴胺神經(jīng)元凋亡，從而改善神經(jīng)退行性病變。

GSK-3β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，與神經(jīng)凋亡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)，如帕金森病[5]、阿爾茨海默病等[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β在細(xì)胞活動(dòng)中與多個(gè)信號(hào)通路密切相關(guān)，其活化受到多種機(jī)制調(diào)控，其中N端第9位絲氨酸殘基(Ser9)被磷酸化時(shí)，GSK-3β活性被抑制[16]。帕金森病發(fā)病過程中，GSK-3β活化上調(diào)多巴胺能神經(jīng)內(nèi)Caspase-3含量，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β抑制劑可抑制Caspase-3表達(dá)，從而抑制多巴胺神經(jīng)元凋亡[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，6-OHDA致病組腦黑質(zhì)內(nèi)p-GSK-3β含量降低；Res治療組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)p-GSK-3β含量較6-OHDA致病組提高，說明白藜蘆醇對(duì)帕金森病小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺神經(jīng)元凋亡及Caspase-3含量的抑制作用可能通過提高p-GSK-3β含量實(shí)現(xiàn)。

PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是近年來發(fā)現(xiàn)的、參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的一個(gè)重要信號(hào)通路[5]。PI3K通過磷酸化Akt蛋白Ser473位點(diǎn)使Akt活化，而活化后的Akt通過p-GSK-3β的Ser9位點(diǎn)抑制GSK-3β活性，避免細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6-7]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在帕金森病發(fā)展過程中，使用PI3K抑制劑wortmannin阻斷PI3K/Akt通路，解除p-GSK-3β，加重多巴胺神經(jīng)元凋亡[14-15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-OHDA致病組小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)PI3K和Akt磷酸化水平較正常小鼠均降低，經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后，PI3K和Akt磷酸化水平均升高，說明白藜蘆醇能激活帕金森病小鼠腦黑質(zhì)內(nèi)PI3K/Akt通路，從而減弱GSK-3β活性，減少多巴胺神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，本研究證實(shí)白藜蘆醇能有效改善由6-OHDA誘導(dǎo)的帕金森病小鼠模型運(yùn)動(dòng)功能障礙，并降低腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺神經(jīng)元凋亡，這種抑制作用可能通過激活PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路，抑制GSK-3β活性而實(shí)現(xiàn)。