恒清Ⅰ號(hào)方對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)作用研究

孟勝喜，霍清萍，王 兵，彭文波，王宇新，梁 芳，汪天湛，張洪艷，余忠海，彭學(xué)豐，李學(xué)敏，曹健美，李文濤

血管性癡呆(vascular dementia，VD)是出血性腦病、缺血性腦病等腦血管疾病引起的認(rèn)知功能障礙綜合征，VD是僅次于阿爾茨海默病引起老年癡呆的第二大常見(jiàn)誘因[1]。目前全球癡呆病人約3 600萬(wàn)人，預(yù)計(jì)2030年將達(dá)到6 600萬(wàn)人，2050年將達(dá)到1.1億人左右[2]，這給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)，因此，尋找有效的治療VD藥物迫在眉睫[3-4]。由于中藥具有多途徑、多靶點(diǎn)、多層次作用特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，因此，在防治VD方面發(fā)揮重要作用。恒清Ⅰ號(hào)方是本課題組治療VD經(jīng)驗(yàn)方，本研究觀察恒清Ⅰ號(hào)方對(duì)VD大鼠Morris水迷宮的作用，探討恒清Ⅰ號(hào)方對(duì)VD大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用3月齡體重250～300 g清潔級(jí)健康雄性SD大鼠36只，購(gòu)自上海靈暢生物科技有限公司[合格證編號(hào)：SCXK(滬)2018-0003]，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度22～24 ℃，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 奧拉西坦膠囊(商品名為歐來(lái)寧，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20031033，批號(hào)：059190102，石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，每粒0.4 g)。中藥恒清Ⅰ號(hào)方的藥物組方：益智仁30 g，菟絲子15 g，川芎15 g，石菖蒲20 g，熟地黃15 g，杜仲15 g，地龍10 g，郁金15 g，天麻10 g，鉤藤10 g。中藥材均由上海市第六人民醫(yī)院提供，符合2015年版《中國(guó)藥典》要求。按處方比例稱取藥材，加10倍量水浸泡0.5 h，煎煮3次，每次40 min，過(guò)濾，合并3次濾液，37 ℃水浴加熱濃縮，根據(jù)臨床實(shí)際用藥情況，對(duì)藥液進(jìn)行濃縮處理，并以中質(zhì)量濃度匹配臨床實(shí)際用藥濃度。中質(zhì)量濃度濃縮至0.535 g/mL，置于4 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Morris水迷宮型號(hào)：JLBehv-MWMG-1，上海吉量軟件科技有限公司生產(chǎn)。Morris水迷宮主要用于測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(大鼠、小鼠)空間位置覺(jué)和方向覺(jué)的學(xué)習(xí)及記憶能力[5]，包含一個(gè)黑色池內(nèi)壁的泳池、圖像采集系統(tǒng)和軟件分析系統(tǒng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后將36只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、奧拉西坦組和恒清Ⅰ號(hào)方組，各9只。

1.4.2 模型制備 參照文獻(xiàn)[6]以雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)制備VD模型。所有大鼠術(shù)前12 h禁食、4 h禁水，先稱重，以2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射充分麻醉后，采用仰臥位固定大鼠，頸前區(qū)去毛，碘伏消毒，頸正中切口處縱向切開(kāi)皮膚和皮下組織，頸部肌肉進(jìn)行鈍性分離，使雙側(cè)頸總動(dòng)脈鞘游離，分離頸總動(dòng)脈、迷走神經(jīng)等，充分顯露雙側(cè)頸總動(dòng)脈。模型組、奧拉西坦組及恒清Ⅰ號(hào)方組大鼠均以4-0號(hào)縫線雙重結(jié)扎頸總動(dòng)脈，再以0號(hào)縫線對(duì)皮膚進(jìn)行縫合，最后碘伏進(jìn)行消毒。假手術(shù)組大鼠均按上述方式麻醉、消毒，在頸正中行縱形切口，雙側(cè)頸總動(dòng)脈鈍性分離后，即縫合手術(shù)切口；同時(shí)白熾燈照射大鼠，使其肛溫維持在37 ℃左右，蘇醒后，放回鼠籠繼續(xù)飼養(yǎng)。

1.4.3 藥物干預(yù) 造模7 d后，奧拉西坦組給予奧拉西坦溶液(奧拉西坦膠囊加入生理鹽水中配制而成)灌胃，每日2次。恒清Ⅰ號(hào)方組給予恒清Ⅰ號(hào)方灌胃，每日2次；奧拉西坦溶液或恒清Ⅰ號(hào)方給藥濃度，根據(jù)人和動(dòng)物體表面積折算系數(shù)換算[7]，計(jì)算結(jié)果為14.8 g/kg。假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日2次。

1.4.4 Morris水迷宮測(cè)試大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力 干預(yù)4周、8周后，分別進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，測(cè)試大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。

1.4.4.1 定位航行實(shí)驗(yàn)(測(cè)試大鼠空間學(xué)習(xí)能力) 隨機(jī)選擇一個(gè)象限的池壁中點(diǎn)作為入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁輕輕放入水中，Morris水迷宮軟件程序記錄大鼠從入水到成功爬上水下平臺(tái)所需的時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latency，EL)。若經(jīng)過(guò)120 s后大鼠未找到平臺(tái)，則人為引大鼠至平臺(tái)休息30 s；否則EL為120 s。測(cè)試結(jié)束后，不管大鼠是否爬上平臺(tái)，均應(yīng)保持大鼠在平臺(tái)上停留學(xué)習(xí)30 s，且相鄰象限時(shí)間間隔不少于15 min。每只大鼠均測(cè)試4次，取平均值作為最終測(cè)試結(jié)果。

1.4.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn)(測(cè)試大鼠空間記憶能力) 定位航行實(shí)驗(yàn)完成次日，移走平臺(tái)，選取與之前平臺(tái)所在象限相對(duì)的象限中點(diǎn)作為大鼠入水點(diǎn)，讓大鼠進(jìn)行120 s自由游泳，記錄120 s內(nèi)大鼠為尋找平臺(tái)而在平臺(tái)象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比，即原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間與總時(shí)間比值(percentages of time spent in the target quadrant，PTSTQ)。

2 結(jié) 果

2.1 恒清Ⅰ號(hào)方對(duì)VD大鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響 干預(yù)4周后，與假手術(shù)組比較，模型組、奧拉西坦組和恒清Ⅰ號(hào)方組大鼠EL均延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，奧拉西坦組和恒清Ⅰ號(hào)方組大鼠EL均縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，恒清Ⅰ號(hào)方組EL與奧拉西坦組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)8周后，與假手術(shù)組比較，模型組、奧拉西坦組和恒清Ⅰ號(hào)方組大鼠EL均延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，奧拉西坦組和恒清Ⅰ號(hào)方組大鼠EL均縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與奧拉西坦組比較，恒清Ⅰ號(hào)方組大鼠EL縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。奧拉西坦組干預(yù)8周與干預(yù)4周比較，EL無(wú)明顯變化(P>0.05)；恒清Ⅰ號(hào)方組干預(yù)8周EL較干預(yù)4周明顯縮短(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠EL比較(±s) 單位：s

2.2 恒清Ⅰ號(hào)方對(duì)VD大鼠空間記憶能力的影響 干預(yù)4周后，與假手術(shù)組比較，模型組、奧拉西坦組和恒清Ⅰ號(hào)方組大鼠PTSTQ均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，奧拉西坦組和恒清Ⅰ號(hào)方組PTSTQ均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；恒清Ⅰ號(hào)方組PTSTQ與奧拉西坦組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)8周后，與假手術(shù)組比較，模型組、奧拉西坦組和恒清Ⅰ號(hào)方組PTSTQ均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，奧拉西坦組和恒清Ⅰ號(hào)方組PTSTQ均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；與奧拉西坦組比較，恒清Ⅰ號(hào)方組PTSTQ增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。奧拉西坦組干預(yù)8周PTSTQ與干預(yù)4周比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；恒清Ⅰ號(hào)方組干預(yù)8周PTSTQ高于干預(yù)4周(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠PTSTQ比較(±s) 單位：%

3 討 論

VD屬中醫(yī)學(xué)“愚癡”“癡呆”“善忘”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病病位在腦，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜。本虛為腎精虧虛，標(biāo)實(shí)為風(fēng)、火、痰、瘀互結(jié)內(nèi)阻。

恒清Ⅰ號(hào)方是本課題組治療VD經(jīng)驗(yàn)效方，其以益智仁為君藥，以川芎、石菖蒲、熟地黃、杜仲、地龍、郁金為臣藥，以天麻、鉤藤為佐使藥，共同發(fā)揮補(bǔ)益腎精、化痰祛濁、活血化瘀作用，從而充養(yǎng)髓海，恢復(fù)神智。前期臨床研究已證實(shí)，恒清Ⅰ號(hào)方可顯著改善VD病人認(rèn)知功能，療效明顯優(yōu)于單純西藥尼莫地平治療，且安全性良好[8]，且恒清Ⅰ號(hào)方與多奈哌齊聯(lián)用可提高VD病人長(zhǎng)谷川癡呆量表、簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表與日常生活能力量表評(píng)分，療效顯著。其藥物作用機(jī)制可能是改善VD病人血液流變學(xué)指標(biāo)，減輕炎癥反應(yīng)，降低氧化損傷，改善微循環(huán)，修復(fù)神經(jīng)元細(xì)胞，保護(hù)中樞神經(jīng)元，從而改善VD病人日常生活能力及認(rèn)知功能。

現(xiàn)代藥理研究已證實(shí)，益智仁水提物通過(guò)抑制SD大鼠乙酰膽堿酯酶活性，增加海馬蛋白含量，改善東莨菪堿所致大鼠記憶獲得障礙[9]；菟絲子多糖可降低應(yīng)激狀態(tài)下小鼠大腦皮質(zhì)中脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛含量及增加超氧化物歧化酶活性，通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化保護(hù)腦組織[10]。川芎主要有效成分川芎嗪通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)通路以減輕缺血導(dǎo)致的大腦炎癥，下調(diào)神經(jīng)元一氧化氮合酶以保護(hù)腦部神經(jīng)[11]；石菖蒲水煎液能改善阿爾茨海默病小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力[12]；熟地黃可改善D-半乳糖衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高腦組織抗氧化能力，減緩其腦細(xì)胞衰老[13]。杜仲皮通過(guò)激活c-Jun氨基末端激酶、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(Akt)、糖原合酶激酶-3(GSK-3β)和核因子κB(NF-κB)通路減弱氧化應(yīng)激，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受細(xì)胞凋亡[14]。地龍可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生，修復(fù)損傷后神經(jīng)功能，其水提取液能改善局灶性腦缺血再灌注損傷大腦皮層損傷[15]。郁金水煎劑可明顯降低全血黏度，減少血小板聚集，郁金醇提物可明顯降低血漿纖維蛋白含量，減少血栓形成[16]。天麻有效成分巴利森苷能減輕小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷[17]；鉤藤有效成分異鉤藤堿可保護(hù)腦細(xì)胞、減緩癡呆，其機(jī)制是通過(guò)清除過(guò)氧化脂質(zhì)體及代謝產(chǎn)物、抗氧化、抑制谷氨酸損傷[18]。

本研究結(jié)果表明，與模型組比較，藥物干預(yù)組(恒清Ⅰ號(hào)方組和奧拉西坦組)干預(yù)4周、干預(yù)8周大鼠EL均縮短，PTSTQ均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；奧拉西坦組干預(yù)8周與干預(yù)4周比較，EL和PTSTQ無(wú)明顯變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與干預(yù)4周比較，恒清Ⅰ號(hào)方組干預(yù)8周EL縮短，PTSTQ增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與奧拉西坦組干預(yù)8周比較，恒清Ⅰ號(hào)方干預(yù)8周EL均縮短，PTSTQ均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，恒清Ⅰ號(hào)方可明顯改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，且干預(yù)8周效應(yīng)優(yōu)于干預(yù)4周效應(yīng)，且優(yōu)于奧拉西坦干預(yù)8周效應(yīng)。