楠藤綠原酸超聲輔助法提取優(yōu)化研究

周家紅 劉銳 張欣 辛瑞瑞 杜繼恒

【摘? ?要】 楠藤作為民間和民族常用藥，有著良好的藥用開(kāi)發(fā)前景。采用正交試驗(yàn)法三因素三水平，即超聲時(shí)間，超聲溫度，乙醇濃度三個(gè)影響因素，每個(gè)因素三個(gè)水平，最大的影響因素為提取時(shí)間，其次為乙醇濃度，最小影響因素則為提取溫度。最佳工藝組合為A3B3C1，該提取工藝操作簡(jiǎn)便，為提取楠藤葉中綠原酸提供理論依據(jù)，從而證實(shí)其具有抗炎性作用。

【關(guān)鍵詞】 楠藤;綠原酸;正交試驗(yàn);抗炎

楠藤（Musaenda erosa Champ ），為茜草科玉葉金花屬攀援灌木植物，其性涼，味微甘。又名厚頁(yè)白紙扇、大茶根、大洋藤、膠鳥(niǎo)藤、大白紙扇、火燒藤等，常攀援于疏林喬木樹(shù)冠上，在我國(guó)常分布于廣東、香港、廣西、云南、四川、貴州、福建、海南和臺(tái)灣等地區(qū)。具有清熱消炎功效，可治熱疥瘡，海南民間常用于治療各種炎癥[1]。其作為民間和民族常用藥，有著良好的藥用開(kāi)發(fā)前景。為了更好地利用楠藤中的綠原酸，減少原材料的浪費(fèi)， 研究楠藤中綠原酸的提取工藝具有重要意義.本試驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)，采用超聲提取法提取楠藤中的綠原酸， 以不同的超聲時(shí)間、不同的超聲溫度、不同的乙醇濃度為提取溶劑，探討其提取過(guò)程中的顯著影響因素，并進(jìn)一步確定楠藤中綠原酸的最佳提取工藝參數(shù)，為后期相關(guān)研究和工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1? 儀器與材料

超聲波清洗器（上海寧商超聲設(shè)備有限公司? 型號(hào)：KQ-250B）、分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司 型號(hào)：FA2004N）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津? 型號(hào)：UV-2450），試藥為經(jīng)當(dāng)?shù)亟?jīng)驗(yàn)豐富的藥農(nóng)實(shí)地采集。

2? 試驗(yàn)方法

2.1? 對(duì)照品溶液的制備[2～5]

精密稱(chēng)取1mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于10mL容量瓶中，加50%乙醇至刻度線(xiàn)，配制成0.1mg/mL的對(duì)照品溶液，即為對(duì)照品溶液。

2.2? 綠原酸的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取楠藤葉粉末1g，按1：10的料液比向錐形瓶中加入不同濃度的乙醇，輕微搖晃，使粉末充分溶于溶液中，按照設(shè)定的超聲浸提時(shí)間和超聲浸提溫度進(jìn)行超聲提取。將提取液進(jìn)行過(guò)濾，取0.1mL濾液移至10mL容量瓶中，加50%的乙醇至刻度線(xiàn)，即為供試待測(cè)樣品溶液。吸取各供試品溶液，，置于比色池中，在330 nm處測(cè)定不同供試品溶液的吸光值。

計(jì)算公式：提取率（%）=C（mg/ml）x稀釋倍數(shù)x提取液體積/樣品質(zhì)量

C—提取液濃度

V—提取液體積

2.3? 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.3.1 提取溫度對(duì)提取綠原酸的影響? 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g楠藤葉粉末5份，按按1：10（g/mL）的料液比向錐形瓶中加入50%的乙醇，輕微搖晃，使粉末充分溶于溶液中，按“2.2”中的方法進(jìn)行提取，條件為：超聲時(shí)間為30min，溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。計(jì)算綠原酸的提取率，考察提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響。

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)提取綠原酸的影響? 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g楠藤葉粉末5份，按按1：10（g/mL）的料液比向錐形瓶中加入50%的乙醇，輕微搖晃，使粉末充分溶于溶液中，按“2.2”中的方法進(jìn)行提取，條件為：超聲溫度為70℃，時(shí)間分別為20min、30min、40min、50min、60min。計(jì)算綠原酸的提取率，考察提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響。

2.3.3 乙醇濃度對(duì)提取綠原酸的影響? 準(zhǔn)確稱(chēng)取1g楠藤葉粉末5份，按按1：10（g/mL）的料液比向錐形瓶中加入濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，輕微搖晃，使粉末充分溶于溶液中，按“2.2”中的方法進(jìn)行提取，條件為：超聲溫度為70℃，超聲時(shí)間為30min。計(jì)算綠原酸的提取率，考察乙醇濃度對(duì)綠原酸提取率的影響。

2.4? 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取液中的綠原酸含量為考察指標(biāo)，對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度3個(gè)因素優(yōu)選，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，用L9（33）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)，方案見(jiàn)表1。

2.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行處理，進(jìn)行方差分析，以Sig<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3? 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別汲取2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL對(duì)照品溶液，置于25mL的容量瓶中，加50%的乙醇至刻度線(xiàn)。以50%乙醇溶液做空白，于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)330 nm處測(cè)定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，經(jīng)方程回歸分析，得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為Y=23.15X+0.051，對(duì)照品溶液在8-16μg /m L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.9967，見(jiàn)圖1。

3.2? 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1 提取溫度對(duì)提取綠原酸的影響? 由圖2可知，隨著超聲溫度的增加，綠原酸的提取率持續(xù)增大。當(dāng)提取溫度為80℃時(shí)，其提取率為3.62%，達(dá)到最大值。

3.2.2 提取時(shí)間對(duì)提取綠原酸的影響? 由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，綠原酸的提取率也隨之增大。當(dāng)提取時(shí)間為50 min時(shí)，其提取率為3.66%，達(dá)到最大值。此后，再增加提取時(shí)間，綠原酸提取率下降。因此，選擇提取時(shí)間50 min比較適宜。

3.2.3 乙醇濃度對(duì)提取綠原酸的影響? 由圖4可知，隨著乙醇濃度的增大，綠原酸的提取率先增加后減小。當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，其提取率為3.62%，達(dá)到最大值。此后，繼續(xù)增大乙醇的濃度，綠原酸的提取率反而降低。乙醇濃度較低時(shí)，楠藤中的綠原酸不能充分溶出;濃度過(guò)高時(shí)，楠藤中能夠溶解于乙醇中的其他雜質(zhì)也被溶解了出來(lái)，造成綠原酸提取率下降。因此，選擇50%的乙醇濃度較為合適。

3.3? 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，以綠原酸提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

由表2直觀分析，通過(guò)R值可知楠藤中綠原酸的超聲提取最大影響因素為提取時(shí)間，其次是乙醇濃度，而提取溫度則較小影響因素。根據(jù)K值知提取溫度A3>A1>A2，提取時(shí)間B3>B1>B2，乙醇濃度C1>C2>C3，由此可知楠藤中綠原酸超聲提取的最佳工藝為A3B3C1。即超聲溫度80℃、提取時(shí)間50 min、40%乙醇的濃度。

由SPSS軟件分析得到表3可知，P值大小依次為提取時(shí)間<乙醇濃度<提取溫度，各影響因素P值均<0.05，均有相關(guān)顯著性。

對(duì)最佳工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到綠原酸的平均提取率為4.57%，相對(duì)平均偏差為0.25%，表明最佳工藝正確、穩(wěn)定。

4? 結(jié)論

在相關(guān)研究中已經(jīng)得到證實(shí)，綠原酸對(duì)多種致病菌和病毒有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用[6]，并且可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化來(lái)減少脂多糖誘導(dǎo)AKI的促炎癥細(xì)胞因子[7]，且降低脂多糖誘導(dǎo)的COX-2的蛋白水平也是綠原酸抗炎的機(jī)制之一[8]。綠原酸含量的高低，是關(guān)乎楠藤內(nèi)在質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一，與藥用價(jià)值有著直接聯(lián)系。本試驗(yàn)采用了超聲波提取法、正交設(shè)計(jì)法來(lái)研究楠藤葉中綠原酸提取最佳工藝條件。先對(duì)超聲波提取楠藤中綠原酸的工藝條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，確定了影響顯著因子及各因子最適水平，再在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交優(yōu)化，并對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析， 確定了超聲波法提取楠藤中綠原酸的最佳工藝，為A3B3C1，即提取溫度80℃，提取時(shí)間50min，乙醇濃度40%。采用該方法提取楠藤中的綠原酸具有快速、省時(shí)、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)對(duì)楠藤中的綠原酸進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，證實(shí)楠藤綠原酸含量較高。楠藤作為植物提取類(lèi)藥物，不僅藥物副作用小，而且還增加了抗炎類(lèi)藥物品目，從而減輕了目前各類(lèi)抗炎性藥物長(zhǎng)期服用耐藥性問(wèn)題，具有廣闊的抗炎性藥物開(kāi)發(fā)前景。

對(duì)楠藤進(jìn)行藥理試驗(yàn)研究，對(duì)其抗炎療效還需進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)，并進(jìn)一步明確其抗炎機(jī)理過(guò)程。

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（編輯：李丹）