熒光硅量子點(diǎn)作為葉面光肥提高生菜對(duì)光能利用率的機(jī)理研究

潘曉琴，李常健，張浩然,3，鄭胤建，董日月，李 唯,3，宋世威，楊 暹，劉應(yīng)亮,3，雷炳富,3*

(1． 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院 生物基材料與能源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省光學(xué)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642；2． 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642； 3． 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；4. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 都市農(nóng)業(yè)研究所，四川 成都 610213)

1 引 言

光合作用是將太陽(yáng)能直接轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷(ATP)和生物質(zhì)等產(chǎn)物形式的化學(xué)能的生化過(guò)程。植物對(duì)光能的利用率高低，直接影響植株的形態(tài)構(gòu)建及其生物積累量，如何綜合運(yùn)用納米材料、微電子及園藝設(shè)施等手段提高植物對(duì)光能的利用效率，一直以來(lái)備受研究人員的關(guān)注，成為相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。提高植物光能利用率的方法大體上可分為兩類(lèi)：一類(lèi)通過(guò)植物外部環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)，如人工施加補(bǔ)光劑[1]、使用高效LED燈[2]、覆蓋轉(zhuǎn)光農(nóng)膜[3]等方法；另一類(lèi)是通過(guò)植物本身的基因改造進(jìn)行改善[4-5]。后者雖意義重大但耗時(shí)長(zhǎng)且風(fēng)險(xiǎn)高，前者研究成果轉(zhuǎn)化效率更快，帶來(lái)的即時(shí)經(jīng)濟(jì)效益更高。因此，近年來(lái)，基于覆蓋轉(zhuǎn)光農(nóng)膜或噴施葉面光肥用于提高植物對(duì)光能利用效率的研究方興未艾[3,6-7]。

近年來(lái)，納米材料及納米技術(shù)用于植物組織成像、葉面肥、金屬離子示蹤、生物傳感等方面的應(yīng)用已有不少報(bào)道[8-11]。非重金屬熒光量子點(diǎn)是一類(lèi)新型的光致發(fā)光納米材料，具有物化穩(wěn)定性好、毒性低、發(fā)光量子效率高、制備工藝簡(jiǎn)單等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)受到人們的廣泛關(guān)注，已經(jīng)在生物醫(yī)學(xué)、光電器件、傳感器、催化和植物光合作用等領(lǐng)域顯示出廣泛的應(yīng)用前景。尤其是，由于它們的毒性低、發(fā)光效率高、水溶性好等特性，在植物領(lǐng)域的應(yīng)用成為一個(gè)新的熱點(diǎn)問(wèn)題，包括植物細(xì)胞成像、植物栽培、基因表達(dá)或作為增強(qiáng)光合作用的介質(zhì)等，受到了廣泛的關(guān)注[12-13]。在眾多研究的熒光量子點(diǎn)中，熒光碳量子點(diǎn)(Carbon dots, CDs)是在植物應(yīng)用方面研究的熱門(mén)材料之一，已有的報(bào)道包括在綠豆芽上研究CDs在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)[14]、在生菜上研究CDs對(duì)光合作用的補(bǔ)光作用等[15]。與碳量子點(diǎn)相比，硅量子點(diǎn)(Silicon quantum dots,SiQDs)的原料豐富，光譜吸收范圍寬、低毒且生物相容性好，其光學(xué)性質(zhì)較CDs而言相對(duì)穩(wěn)定，多被用于制成生物探針[16-17]，但在植物種植上的應(yīng)用則少見(jiàn)報(bào)道[18-19]，且SiQDs的轉(zhuǎn)光功能對(duì)植物光合作用的影響方式也尚不清楚。

在光合作用過(guò)程中，葉綠體光合作用僅能利用可見(jiàn)光范圍的光能，具有高選擇性。紫外或近紫外光不僅難以被植物利用，甚至?xí)斐芍参锏难趸瘬p傷從而阻礙植物生長(zhǎng)。當(dāng)植物遭受紫外脅迫時(shí)，適當(dāng)增加光譜中的藍(lán)光含量可以降低植物對(duì)紫外光的敏感性，從而減緩脅迫作用[20]。大部分SiQDs能夠吸收紫外光并轉(zhuǎn)化為紅藍(lán)光，具有改變光環(huán)境從而保護(hù)和提高植物的光能利用率的潛力。值得注意的是，SiQDs中含有大量的Si元素，而Si元素在一些逆境脅迫下對(duì)植物生長(zhǎng)同樣起著改善的作用，如減輕小麥稻瘟病造成的光合能力降低[21]、緩解干旱脅迫對(duì)光合作用的抑制等[22]。因此，將SiQDs作為葉面肥施用，既能利用其光肥功能，又兼?zhèn)銼i元素本身對(duì)植物生長(zhǎng)的積極作用。

基于上述考慮，本研究選取了一種高分散性、納米尺寸均一且光學(xué)性能穩(wěn)定的高亮SiQDs，提取模式植物生菜的葉綠體，從能量轉(zhuǎn)移層面上解釋了SiQDs提高葉綠體光能轉(zhuǎn)化速率的內(nèi)在機(jī)理，并將SiQDs作為葉面光肥，通過(guò)植物工廠內(nèi)的生菜種植實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了其對(duì)生菜種植的增產(chǎn)效應(yīng)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 樣品制備

參考Gong等的方法制備SiQDs[23]。稱(chēng)取11.6 g檸檬酸鈉加入到240 mL純水中，混合攪拌的同時(shí)持續(xù)通入氮?dú)?0 min。加入60 mL N-氨乙基-γ-氨丙基二甲氧基硅烷(DAMO)，繼續(xù)通入氮?dú)?0 min。將混合液倒入500 mL反應(yīng)釜中，200 ℃條件下反應(yīng)12 h。冷卻至室溫，使用截留量為1 000 u的透析袋透析24 h(平均4～5 h換一次水)，透析袋中液體即為目標(biāo)樣品液。旋蒸濃縮樣品液后取40 mL進(jìn)行冷凍干燥，計(jì)算可得其濃度為40.16 mg·mL-1。

2.2 葉綠體的提取

參考Pan等的方法提取葉綠體(CLP)[8]。先配置蔗糖磷酸緩沖液，包含0.4 mol/L蔗糖、10 mmol/L氯化鉀、30 mmol/L磷酸氫二鈉和20 mmol/L磷酸二氫鉀，配置完畢后將緩沖液置于冰箱中預(yù)冷到4 ℃。使用研磨機(jī)將生菜葉片破碎，在蔗糖磷酸緩沖液中提取葉綠體，而后用4層紗布將提取液過(guò)濾至棕色樣品瓶中，得到葉綠體粗提液，全程在黑暗環(huán)境下操作并使用冰浴盡量使葉綠體處于4 ℃的條件下。將粗提液在1 000 r·min-1、4 ℃條件下離心3 min，棄底部沉淀取上層液體，再在3 000 r·min-1、4 ℃條件下離心3 min，得底部沉淀葉綠體。將所得葉綠體再次分散于蔗糖磷酸緩沖液中，得葉綠體懸浮液。取0.1 mL葉綠體懸浮液分散于4.9 mL無(wú)水乙醇中，測(cè)其在OD650的吸光值，計(jì)算可得其濃度為398.21 mg·L-1。

2.3 樣品表征

使用透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy,TEM；型號(hào)：JEOL-2010)及Nano Measurer對(duì)樣品形貌及粒徑大小進(jìn)行表征測(cè)量。使用傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FTIR；型號(hào)：Nicolet 6700)和X射線(xiàn)電子能譜(X-ray Photoelectron Spectroscopy,XPS；型號(hào)：Thermo Scientific Escalab 250Xi)對(duì)樣品進(jìn)行官能團(tuán)鑒定。使用熒光光譜儀(型號(hào)：Hitachi F-7000)測(cè)試樣品的激發(fā)、發(fā)射熒光(Photoluminescence,PL)光譜。使用熒光光譜儀(型號(hào)：Edinburgh Instruments FLS 1000)表征樣品的熒光壽命及絕對(duì)量子效率，測(cè)試前將溶液稀釋到在最佳激發(fā)波長(zhǎng)處的吸收值小于0.1即可。使用紫外分光光度計(jì)(型號(hào)：Hitachi UV-2550)測(cè)試樣品的紫外-可見(jiàn)吸收光譜。

2.4 希爾反應(yīng)

希爾反應(yīng)用于測(cè)量光合作用過(guò)程中光系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞速率。使用2,6-二氯酚靛酚(2,6-Dichloropheno-lindopheno,DCPIP)的還原速率來(lái)表示。分別配置4 mL濃度為0,10,100, 200 mg·mL-1的SiQDs蔗糖-磷酸緩沖液分散液，再加入4 mL葉綠體懸浮液，4 ℃共處理1 h后分別加入2.0 mL 120 μmol/L DCPIP。使用光強(qiáng)為7.0 mW·cm-2的氙燈照射5 min，每隔1 min記錄一次溶液在OD600的吸光值。

2.5 生菜應(yīng)用

生菜種植：品種為“意大利耐抽薹生菜”，一種散葉不結(jié)球類(lèi)型生菜，購(gòu)于廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所。種植地點(diǎn)為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)廣東省光學(xué)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心的植物工廠。營(yíng)養(yǎng)液配方為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)葉菜通用配方，環(huán)境溫度為20～23 ℃，光源為通用白色LED燈，光照18 h黑暗6 h。光照的同時(shí)輔以波長(zhǎng)為365 nm的紫外燈光照4 h。

生菜處理：幼苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí)，將幼苗轉(zhuǎn)移到水培架上定植10 d。將樣品液配制成濃度為0,5,50,100 mg·L-1的SiQDs水分散液，使用噴瓶將不同濃度的樣品液均勻地噴施于生菜葉面上，每組3個(gè)重復(fù)，每隔2 d處理一次，14 d后采收，測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。其中，在生菜處理的第11 d，取生菜的第4片葉用于葉綠素?zé)晒?IMAGINE PAM)成像實(shí)驗(yàn)，測(cè)試快速光飽和曲線(xiàn)，成像實(shí)驗(yàn)前對(duì)生菜進(jìn)行暗處理20 min。

2.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 15.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)鄧肯多重比較檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)，利用Origin 8.0對(duì)數(shù)據(jù)擬合、繪圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 SiQDs的形貌粒徑

如圖1所示，所制備的SiQDs具有良好的分散性，呈類(lèi)球形，尺寸分布均勻。取100個(gè)納米粒子測(cè)量其尺寸可知該樣品的平均粒徑為3.6 nm(見(jiàn)圖1插圖)。SiQDs的TEM圖像說(shuō)明，檸檬酸鈉作為強(qiáng)還原劑，可以在高溫高壓條件下與DAMO反應(yīng)，自組裝形成納米粒徑小、尺寸分布均勻且高分散性高的SiQDs。

圖1 SiQDs的TEM圖像(插圖為SiQDs尺寸分布圖)

3.2 FTIR光譜

圖2 SiQDs的FTIR光譜

3.3 PL光譜

將SiQDs液稀釋到一定濃度后測(cè)其熒光激發(fā)發(fā)射光譜。如圖3所示，該材料在380 nm波長(zhǎng)激發(fā)下熒光強(qiáng)度最大，最佳發(fā)射為450 nm，屬于藍(lán)色熒光。隨著激發(fā)波長(zhǎng)的延長(zhǎng)，SiQDs的熒光發(fā)射強(qiáng)度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，而最佳發(fā)射并沒(méi)有出現(xiàn)紅移或藍(lán)移的現(xiàn)象，表明該材料不存在激發(fā)依賴(lài)效應(yīng)[15]。結(jié)合圖4(a)可知，該材料在最佳發(fā)射下出現(xiàn)的兩個(gè)激發(fā)峰與其紫外-可見(jiàn)吸收光譜相對(duì)應(yīng)，與大部分碳點(diǎn)的吸收光譜類(lèi)似[25]。此外，測(cè)得該材料的絕對(duì)量子效率為64.2%，其熒光發(fā)射強(qiáng)度特性為實(shí)現(xiàn)良好的轉(zhuǎn)光提供了保障。

圖3 SiQDs的激發(fā)和發(fā)射光譜

3.4 XPS能譜

3.5 SiQDs對(duì)葉綠體的影響

植物光合作用發(fā)生在葉綠體細(xì)胞器上。葉綠體上的光合色素可以吸收紅藍(lán)光，而后通過(guò)光合作用將吸收的光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能并儲(chǔ)存在植物組織中[32]。如圖5(a)所示，葉綠體光合作用的有效吸收范圍為400～720 nm的可見(jiàn)光。本研究制備的SiQDs可以吸收紫外光然后發(fā)射藍(lán)光，且材料所發(fā)的藍(lán)光正好處于生菜葉綠體光合作用的有效吸收范圍內(nèi)(圖5(b))，說(shuō)明SiQDs可以將生菜葉綠體光合作用無(wú)法有效利用的紫外光吸收轉(zhuǎn)換為光合作用能有效利用的藍(lán)光。向SiQDs水分散液中添加不同含量葉綠體懸浮液后，觀察其熒光光譜，可以發(fā)現(xiàn)，隨著葉綠體溶液添加量的增多，SiQDs的熒光發(fā)射強(qiáng)度下降，并分別在450 nm及513 nm附近出現(xiàn)2個(gè)發(fā)射峰(圖5(c))，且兩個(gè)發(fā)射峰間的凹陷處正好對(duì)應(yīng)了圖5(b)的空白處，說(shuō)明SiQDs發(fā)射的藍(lán)光被葉綠體有效吸收。680nm與730 nm處的兩個(gè)熒光峰的降低是由體系濃度增大導(dǎo)致的葉綠體聚集產(chǎn)生的熒光猝滅(圖5(d))。圖5(e)展示的是SiQDs及含有3 mL體積的SiQDs/葉綠體混合液的熒光壽命。擬合計(jì)算后可知，加入葉綠體前后SiQDs的熒光壽命分別為13.48 ns和13.46 ns，SiQDs/葉綠體的熒光壽命沒(méi)有明顯縮短(表1)。當(dāng)熒光體濃度較大或與其他吸光物質(zhì)共存時(shí)，熒光體或其他吸光物質(zhì)對(duì)激發(fā)光或發(fā)射光的吸收導(dǎo)致熒光減弱但壽命卻沒(méi)有發(fā)生變化的現(xiàn)象，稱(chēng)為內(nèi)濾效應(yīng)。以上結(jié)果表明，葉綠體通過(guò)內(nèi)濾效應(yīng)吸收了SiQDs發(fā)射的藍(lán)光。

圖5 (a)葉綠體的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖；(b)歸一化的葉綠體可見(jiàn)光吸收光譜及SiQDs在365 nm激發(fā)下的熒光光譜；(c)添加不同體積葉綠體懸浮液后SiQDs在400 nm激發(fā)下的熒光光譜(總體積4 mL，SiQDs濃度500 mg·mL-1)；(d)不同濃度葉綠體在400 nm激發(fā)下的熒光光譜；(e)SiQDs及SiQDs/葉綠體在450 nm處監(jiān)測(cè)的熒光壽命曲線(xiàn)；(f)不同濃度SiQDs對(duì)葉綠體還原DCPIP的影響(用ΔAbs.來(lái)表示DCPIP還原速率)。

表1 SiQDs與SiQDs/CLP熒光壽命的多指數(shù)擬合數(shù)據(jù)

為了驗(yàn)證葉綠素是否將吸收的藍(lán)光用于光合作用，我們?cè)O(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)，通過(guò)觀察不同濃度SiQDs對(duì)葉綠體還原DCPIP的影響規(guī)律加以討論。如圖5(f)所示，隨著SiQDs濃度的提高，DCPIP的被還原量增多，代表著光合電子傳遞鏈上的電子傳遞速率加快[33]。因此可以認(rèn)為，葉綠體吸收的藍(lán)光促進(jìn)了生菜的光合作用。

3.6 SiQDs對(duì)生菜生長(zhǎng)的影響

如圖6所示，噴施不同濃度的SiQDs水分散液后，生菜的干重及鮮重較噴施清水的對(duì)照組而言均有顯著性提高，其中以濃度為50 mg·L-1的效果最佳。在鮮重方面，濃度為5 mg·L-1的處理組與濃度為50,100 mg·L-1的處理組沒(méi)有顯著性差異，50 mg·L-1的處理組與100 mg·L-1的處理組有顯著性差異(圖6(a))。而在干重方面，盡管較對(duì)照組有了顯著性的提高，但100 mg·L-1的處理組與5,50 mg·L-1處理組相比卻有顯著性下降(圖6(b))。表明低濃度SiQDs水分散液噴施處理生菜可以提高生菜的干鮮重，而高濃度處理會(huì)抑制這種促進(jìn)效果。

圖6 不同濃度SiQDs處理后生菜的生物量。(a)總鮮重；(b)總干重。

3.7 SiQDs對(duì)生菜光合作用的影響

為了弄清楚SiQDs對(duì)生菜生長(zhǎng)的促進(jìn)作用是否與光合作用有關(guān)，采用快速光飽和曲線(xiàn)進(jìn)行了表征和計(jì)算。如圖7所示，隨著噴施濃度的提高，電子轉(zhuǎn)移速率也得到了提高。這個(gè)趨勢(shì)與圖5(f)一致，且5 mg·L-1的處理組與50 mg·L-1的處理組也沒(méi)有顯著性差異。兩者相互印證，初步說(shuō)明SiQDs對(duì)生菜生長(zhǎng)的促進(jìn)作用是與SiQDs轉(zhuǎn)光作用提高光合電子傳遞速率有關(guān)的。對(duì)曲線(xiàn)擬合結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析得到了表2的數(shù)據(jù)。由表2可知，較對(duì)照組而言，SiQDs處理均提高了生菜的最大光合速率，且隨著處理濃度的提高而增大，說(shuō)明適當(dāng)濃度SiQDs作為葉面光肥施用，可以提高生菜的最大光合速率。

圖7 不同濃度SiQDs處理后生菜的快速光飽和曲線(xiàn)

表2 不同濃度SiQDs處理后生菜的光合特性擬合結(jié)果

4 討 論

熒光硅量子點(diǎn)的光學(xué)特性與材料的尺寸、表面官能團(tuán)及分散性等有關(guān)。首先是尺寸對(duì)發(fā)光的影響。TEM結(jié)果、PL光譜的對(duì)稱(chēng)性和激發(fā)不依賴(lài)現(xiàn)象都表明，熒光硅量子點(diǎn)的納米尺寸均一，光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是開(kāi)展植物應(yīng)用的有利條件之一。同時(shí)，材料的納米粒徑小于5 nm，也有利于從葉面氣孔吸收進(jìn)入植物體內(nèi)，從而更好地與葉綠體協(xié)同作用提高光能利用率[8,14,25,34]。其次是表面的官能團(tuán)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。本方法制備的SiQDs表面含有豐富的—NH官能團(tuán)，熒光強(qiáng)度高[35]，絕對(duì)量子效率高達(dá)64.2%，表明該材料的發(fā)光效率高，能有效地將植物光合作用不能有效利用的紫外光轉(zhuǎn)換為能被吸收后用于光合作用的藍(lán)光。最后是材料的分散性。在本試驗(yàn)中，F(xiàn)TIR、XPS和紫外-可見(jiàn)吸收光譜測(cè)試3種方法結(jié)果相互驗(yàn)證，表明該方法制備的SiQDs表面富含多種親水性含氧官能團(tuán)，對(duì)分散于水溶液中的材料起到保護(hù)殼的作用，是SiQDs具有優(yōu)異的水分散性的主要原因[26]。

圖8 SiQDs促進(jìn)CLP光合作用示意圖

SiQDs具有轉(zhuǎn)光功能。CDs作為補(bǔ)光天線(xiàn)可以通過(guò)能量共振轉(zhuǎn)移的方式，將能量傳遞給葉綠體從而提高葉綠體光合效率[36]。但這種傳遞方式會(huì)受限于供體與受體間的距離，發(fā)生條件比較苛刻[37]。在本實(shí)驗(yàn)中，如圖8所示，SiQDs與葉綠體間的能量傳遞方式為內(nèi)濾效應(yīng)，屬于輻射能量傳遞，不受距離限制[38]。將SiQDs作為葉面光肥應(yīng)用于生菜種植時(shí)，既體現(xiàn)了Si元素本身對(duì)光合作用起到的促進(jìn)作用[39]，又利用了硅點(diǎn)的轉(zhuǎn)光功能，從而促進(jìn)了生菜的光能利用效率。即便SiQDs沒(méi)有進(jìn)入葉片細(xì)胞內(nèi)與葉綠體結(jié)合，也能將能量傳遞給葉綠體。

5 結(jié) 論

本文采用水熱反應(yīng)制備了性能優(yōu)異的SiQDs。其優(yōu)異的分散性則要得益于表面豐富的含氧官能團(tuán)。當(dāng)該量子點(diǎn)與葉綠體共存時(shí)，會(huì)發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)，提高葉綠體的電子傳遞速率。通過(guò)生菜種植實(shí)驗(yàn)證實(shí)了適宜濃度的SiQDs(50 mg·L-1)作為葉面光肥能顯著提高生菜的干鮮重含量及最大光合速率。因此，本研究認(rèn)為，SiQDs利用熒光硅量子點(diǎn)的轉(zhuǎn)光功能及硅元素的獨(dú)特作用，作為葉面光肥應(yīng)用于生菜種植是可行且有效的，更具體的生物機(jī)理研究尚需要后續(xù)開(kāi)展更為完善的植物應(yīng)用試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。