ASB14通過(guò)調(diào)控泛素化介導(dǎo)的線粒體自噬改善小鼠心力衰竭

王澈，楊宏輝，李慶民，杜秋波，朱利杰，李清曼，張彩麗

（河南省人民醫(yī)院，阜外華中心血管病醫(yī)院，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州 450000）

隨著我國(guó)人口老齡化的加快，心力衰竭的患病率逐年升高。心力衰竭誘發(fā)的心肌肥厚常伴隨著心肌細(xì)胞中蛋白質(zhì)的分解及合成，保持蛋白質(zhì)分解與合成之間的平衡是維持心臟功能的重要條件［1-3］。研究［4］證實(shí)，泛素蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome system，UPS）在主動(dòng)脈瓣狹窄模型中出現(xiàn)心肌泛素化蛋白水平升高，說(shuō)明心衰過(guò)程中存在心肌泛素化過(guò)程。

線粒體自噬是一個(gè)特異性選擇的過(guò)程，受多種基因和蛋白調(diào)控［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，心力衰竭模型中線粒體自噬不足可能會(huì)加重心肌損傷，同時(shí)E3泛素連接酶Parkin的低表達(dá)可能導(dǎo)致心肌細(xì)胞中線粒體功能的失調(diào)及心律失常的加重，說(shuō)明泛素化降解介導(dǎo)的線粒體自噬在心力衰竭中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

錨蛋白重復(fù)序列和抑制細(xì)胞因子信號(hào)盒（ankyrin repeats and suppressor of cytokine signaling box，ASB）14是ASB家族中的成員之一，本研究旨在構(gòu)建壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠模型，利用ASB14基因的腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染小鼠，上調(diào)其心臟組織中ASB14表達(dá)，探討ASB14參與心力衰竭發(fā)生及發(fā)展可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠40只，體質(zhì)量30～35 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物有限公司［SCXK（遼）：2017-0001］；小鼠分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，室溫維持在20～25℃，每日光照12 h。在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字法將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組、模型（Model）組、模型+ASB14-siRNA載體（siRNA）組及模型+ASB14腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染（ASB14）組，每組10只。

1.2 主要試劑

ASB14腺相關(guān)病毒及ASB14-siRNA表達(dá)載體購(gòu)自上海吉瑪生物科技有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；TransStart Top Green qPCR SuperMix購(gòu)自北京全式金公司；ASB14及β-actin引物合成于北京奧科鼎盛生物科技有限公司；p62、ASB14、PINK1、Parkin、Mfn2、TIM23、COXIV及LC-3B抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備與處置：根據(jù)文獻(xiàn)［7］報(bào)道的方法，將ASB14腺相關(guān)病毒及ASB14-siRNA表達(dá)載體利用無(wú)菌PBS稀釋成濃度為1.0×1012μg/mL后，利用尾靜脈注射的方法注射到小鼠體內(nèi)，每只200 μL，其余組小鼠給予等量的陰性病毒稀釋液。在注射3周后，除Sham組小鼠外，其余小鼠均根據(jù)文獻(xiàn)［8-9］報(bào)道的方法構(gòu)建心力衰竭小鼠模型，具體方法如下：小鼠手術(shù)前24 h禁食不禁水，1.5 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，皮膚消毒、備皮后，將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)中，于左側(cè)第2～3肋間剪開(kāi)皮膚，切口0.5～1 cm，用鑷子鈍性分離肌肉，暴露胸主動(dòng)脈，于胸主動(dòng)脈弓部下方0.5 cm處挑起胸主動(dòng)脈，將注射器針頭平行放置于胸主動(dòng)脈上，利用手術(shù)線結(jié)扎，抽出針頭，使胸主動(dòng)脈縮窄，逐層縫合。Sham組打開(kāi)胸腔后，手術(shù)線不結(jié)扎，其余步驟均與Model組相同。術(shù)后6 h內(nèi)禁食不禁水。

1.3.2 超聲檢測(cè)心功能：于手術(shù)后第4周，利用小動(dòng)物超聲心電圖機(jī)檢測(cè)各組小鼠心臟功能，將探頭在二維模式下置于胸骨前，檢測(cè)縮短分?jǐn)?shù)（left ventricular shortening fraction，F(xiàn)S ）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF %）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular late systolic diameter，LVEDs）和左心室舒張末期后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWd）。

1.3.3 HE染色：術(shù)后4周后，脫頸處死小鼠，取出心臟，于4 %多聚甲醛中固定，脫水、透明、石蠟包埋隨后切片，厚度5 μm左右，石蠟切片在室溫下稍微干燥后，置于60 ℃恒溫烤箱中烤干使用。切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇溶液水化，蒸餾水沖洗1 min；Harris蘇木精染液（60 ℃）染色5 min，流水洗去蘇木素液；l %鹽酸乙醇分化1～3 s，流水沖洗；1 %氨水洗5～10 s，流水沖洗；伊紅染液染色2 min，鏡下觀察顏色變化，流水沖洗；梯度乙醇脫水：80 %乙醇1 min，95 %乙醇1 min，無(wú)水乙醇1 min；二甲苯透明2 min，切片晾干，中性樹(shù)膠封片。每組小鼠選取6張切片標(biāo)本，光鏡下觀察組織學(xué)改變。

1.3.4 Masson染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水后，Masson染色液染色5 min，0.5 %醋酸水溶液沖洗，5 %磷鎢酸染液染色10 min，0.5 %醋酸水溶液沖洗，0.5 %苯胺藍(lán)染色5 min，0.5 %醋酸水溶液沖洗，梯度乙醇脫水：80 %乙醇1 min，95 %乙醇1 min，無(wú)水乙醇1 min；二甲苯透明2 min，切片晾干，中性樹(shù)膠封片。每組小鼠選取6張切片標(biāo)本，光鏡下觀察心肌纖維化情況。

1.3.5 實(shí)時(shí)PCR：利用TRIzol法提取心臟組織中總RNA，取各組小鼠心臟組織加入1 mL TRIzol進(jìn)行勻漿，勻漿液置于離心管中；每管加入0.2 mL氯仿，冰浴5 min。4℃，12 000 r/min離心10 min；取上層水相，加入0.5 mL 異丙醇，冰浴10 min。4℃，12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入1 mL用DEPC處理的水配置的75%乙醇，洗滌沉淀。4℃，7 500 r/min離心5 min；棄上清，自然吹干后用0.01% DEPC溶解沉淀，待用。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。取2 μL cDNA為模板，按照實(shí)時(shí)PCR說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體外擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參，DNA引物序列如下：β-actin引物上游5’-GGGAAATCGTGCGTGACA T-3’，下游5’-TCAGG AGGAGCAATGATCTTG-3’；ASB14引物上游5’-TG CAGAAAGGAGCTGACGTT-3’，下游5’-GCAGGTGG CCTGAACTCTTA-3’。結(jié)果使用2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)變化。反應(yīng)體系50 μL，反應(yīng)條件如下：在95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)30次，72 ℃ 1 min。

1.3.6 Western blotting：將心臟組織剪碎，提取總蛋白，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，使用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，進(jìn)行SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳，使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，TBST洗膜，分別加入p62、ASB14、PINK1、Parkin、Mfn2、TIM23、COXIV、LC-3B及β-actin一抗（1 ∶1 000），TBST洗膜加入相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗稀釋濃度為1 ∶1 000，室溫孵育1 h。TBST洗膜，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件計(jì)算灰度值，采用目的條帶與內(nèi)參蛋白條帶光密度比值作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠ASB14 mRNA和蛋白的表達(dá)變化

取各組小鼠的心臟組織進(jìn)行了實(shí)時(shí) PCR及Western blotting檢測(cè)，與Sham組相比，siRNA組ASB14mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而ASB14組ASB14mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 ASB14對(duì)心力衰竭小鼠心臟功能的影響

在模型建立后第4周，對(duì)小鼠進(jìn)行了心臟超聲檢查。與Sham組相比，Model組FS、EF顯著降低，LVEDd、LVEDs和LVPWd明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與Model組相比，siRNA組FS、EF進(jìn)一步降低，且LVEDd、LVEDs和LVPWd也明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；而轉(zhuǎn)染ASB14后能顯著增加FS、EF，并且降低LVEDd、LVEDs和LVPWd，與Model組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表2。

表1 ASB14 mRNA及蛋白在小鼠心肌組織中的表達(dá)（）Tab.1 Expression of ASB14 mRNA and protein in mouse myocardial tissue（）

表1 ASB14 mRNA及蛋白在小鼠心肌組織中的表達(dá)（）Tab.1 Expression of ASB14 mRNA and protein in mouse myocardial tissue（）

1）compared with sham group，P ＜ 0.05.

圖1 Western blotting檢測(cè)各組ASB14蛋白表達(dá)Fig.1 ASB14 protein expression in each group was detected by Western blotting

2.3 ASB14對(duì)心力衰竭小鼠心臟病理?yè)p傷及纖維化的影響

HE染色結(jié)果（圖2）顯示，Sham組心肌纖維排列整齊，細(xì)胞核呈卵圓形，無(wú)皺縮、染色正常，未見(jiàn)心肌細(xì)胞肥大，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；Model組及siRNA組小鼠心肌纖維排列紊亂，細(xì)胞核皺縮深染，心肌纖維肥大增厚，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，凋亡細(xì)胞多見(jiàn)，且siRNA組較Model組心臟病理?yè)p傷嚴(yán)重；ASB14組心肌纖維排列較Model組整齊，心肌細(xì)胞肥厚減輕，炎癥細(xì)胞及凋亡細(xì)胞減少，心臟病理?yè)p傷減輕。Masson染色結(jié)果顯示，與Sham組相比，Model組小鼠心肌纖維化程度明顯加重，膠原纖維表達(dá)明顯增多；與Model組相比，siRNA組小鼠膠原纖維表達(dá)也顯著增加；而轉(zhuǎn)染ASB14后，小鼠膠原纖維表達(dá)降低，纖維化程度減輕，提示ASB14能夠減輕心力衰竭小鼠心臟病理?yè)p傷及纖維化程度。

2.4 ASB14對(duì)心力衰竭小鼠PINK1、Parkin及Mfn2表達(dá)的影響

Western blotting檢測(cè)各組小鼠心肌組織中泛素化相關(guān)蛋白的表達(dá)，與Sham組相比，Model組小鼠心肌組織中泛素化相關(guān)蛋白PINK1、Parkin表達(dá)明顯增加，Mfn2表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；轉(zhuǎn)染ASB14-siRNA后小鼠心肌組織中泛素化相關(guān)蛋白PINK1、Parkin表達(dá)顯著降低，Mfn2表達(dá)明顯增加，與Model組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；此外，轉(zhuǎn)染ASB14后小鼠心肌組織中泛素化相關(guān)蛋白PINK1、Parkin表達(dá)進(jìn)一步增加，Mfn2表達(dá)也顯著降低，與Model組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表3，圖3。

表2 ASB14對(duì)心力衰竭小鼠心功能及心室擴(kuò)張的影響（）Tab.2 Effects of ASB14 on cardiac function and ventricular dilation in mice with heart failure（）

表2 ASB14對(duì)心力衰竭小鼠心功能及心室擴(kuò)張的影響（）Tab.2 Effects of ASB14 on cardiac function and ventricular dilation in mice with heart failure（）

1）compared with sham group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

圖2 ASB14對(duì)心力衰竭小鼠心臟病理?yè)p傷及纖維化的影響 HE×200Fig.3 Effect of ASB14 on cardiac pathological damage and fibrosis in mice with heart failure HE×200

2.5 ASB14對(duì)心力衰竭小鼠TIM23、COXIV、LC-3B及p62表達(dá)的影響

Western blotting檢測(cè)各組小鼠心肌組織中線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。與Sham組相比，Model組小鼠心肌組織中線粒體自噬相關(guān)蛋白TIM23、COXIV及p62蛋白明顯降低，而LC3II/LC3I的比例顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；轉(zhuǎn)染ASB14-siRNA后小鼠心肌組織中線粒體自噬相關(guān)蛋白TIM23、COXIV及p62蛋白明顯增加，而LC3II/LC3I的比例顯著降低，與Model組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；此外，轉(zhuǎn)染ASB14后小鼠心肌組織中線粒體自噬相關(guān)蛋白TIM23、COXIV及p62蛋白表達(dá)進(jìn)一步減少，而LC3II/LC3I的比例顯著增加，與Model組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)表4，圖4。

圖3 Western blotting檢測(cè)各組PINK1、Parkin及Mfn2蛋白表達(dá)Fig.3 Effect of ASB14 on the expression of PINK1，Parkin，and Mfn2 in mice with heart failure

表3 ASB14對(duì)心力衰竭小鼠PINK1、Parkin及Mfn2表達(dá)的影響（）Tab.3 Effect of ASB14 on the expression of PINK1，Parkin，and Mfn2 in mice with heart failure（）

表3 ASB14對(duì)心力衰竭小鼠PINK1、Parkin及Mfn2表達(dá)的影響（）Tab.3 Effect of ASB14 on the expression of PINK1，Parkin，and Mfn2 in mice with heart failure（）

1）compared with sham group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

3 討論

心力衰竭是多種心血管疾病的終末階段，其發(fā)病可能與心臟超負(fù)荷、心肌損傷以及心肌炎癥等因素有關(guān)［10］。ASB14是ASB家族中的成員之一，ASB14是心力衰竭的潛在標(biāo)志物，其可能通過(guò)蛋白質(zhì)泛素化參與心力衰竭的進(jìn)展［11-12］。因此，本研究利用ASB14腺相關(guān)病毒或ASB14-siRNA轉(zhuǎn)染小鼠以促進(jìn)或抑制心肌細(xì)胞中ASB14的表達(dá)，并通過(guò)主動(dòng)脈縮窄手術(shù)建立壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠模型，探討ASB14對(duì)心力衰竭小鼠的影響極其作用機(jī)制。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠轉(zhuǎn)染ASB14腺相關(guān)病毒或ASB14-siRNA載體后，心肌內(nèi)ASB14 mRNA及蛋白的表達(dá)明顯升高或降低，可用于后續(xù)研究。

表4 ASB14對(duì)心力衰竭小鼠TIM23、COXIV、p62及LC3B表達(dá)的影響（）Tab.4 Effect of ASB14 on the expression of TIM23，COXIV，p62 and LC3B in mice with heart failure（）

表4 ASB14對(duì)心力衰竭小鼠TIM23、COXIV、p62及LC3B表達(dá)的影響（）Tab.4 Effect of ASB14 on the expression of TIM23，COXIV，p62 and LC3B in mice with heart failure（）

1）compared with sham group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

圖4 Western blotting檢測(cè)各組TIM23、COXⅣ、p62及LC3B蛋白表達(dá)Fig.4 Effect of ASB14 on the expression of TIM23，COXⅣ，p62，and LC3B in mice with heart failure

心肌細(xì)胞肥厚是心力衰竭患者的早期臨床表現(xiàn)，同時(shí)心肌細(xì)胞肥厚還會(huì)引起心肌細(xì)胞纖維增生，誘發(fā)心肌膠原纖維化。過(guò)量沉積的膠原纖維會(huì)使在正常情況下彼此聚合的心肌細(xì)胞分離開(kāi)，心肌細(xì)胞之間的信息傳遞受到阻礙，心肌舒張及收縮功能受損，從而導(dǎo)致心肌泵血功能障礙［13-15］。本研究結(jié)果顯示，ASB14高表達(dá)能夠明顯改善壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠心室功能不全及心室擴(kuò)張、減輕心肌病理性損傷并減少膠原沉積，改善心肌纖維化。

心肌細(xì)胞肥厚伴隨著蛋白質(zhì)的分解與重新合成，為了維持心肌內(nèi)蛋白質(zhì)分解及合成的相對(duì)平衡，UPS的泛素化過(guò)程會(huì)清除掉心肌內(nèi)變異的蛋白質(zhì)，維持心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的分解與合成穩(wěn)態(tài)［16-18］。Pink1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，Parkin是一種E3泛素連接酶。當(dāng)線粒體在受損狀態(tài)時(shí)，線粒體膜電位下降，Pink1在線粒體外膜迅速積累，導(dǎo)致Parkin向受損線粒體集聚，增加E3泛素連接酶的活性，加速受損線粒體基質(zhì)蛋白的泛素化［19-21］。Mfn2是Parkin的受體，當(dāng)心肌受損后，Mfn2表達(dá)降低，從而組織了Parkin易位至線粒體內(nèi)膜，導(dǎo)致其在受損的線粒體上集聚［22］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASB14高表達(dá)能夠促進(jìn)Pink1及Parkin的表達(dá)，降低Mfn2的表達(dá)，說(shuō)明ASB14可以激活E3泛素連接酶的活性，啟動(dòng)泛素化，加快其對(duì)變異蛋白質(zhì)的清除。

有研究［23-25］表明，Parkin活性增加和啟動(dòng)泛素化，會(huì)促進(jìn)線粒體自噬。研究［26］顯示在心力衰竭患者的心臟組織線粒體中自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)明顯增加、p62的表達(dá)明顯降低，說(shuō)明線粒體自噬可能與心力衰竭的發(fā)展有關(guān)。本研究通過(guò)Western blotting檢測(cè)線粒體內(nèi)膜相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)探討線粒體自噬的激活情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠模型高表達(dá)ASB14后，p62、TIM23、COXⅣ的表達(dá)明顯降低，而LC3Ⅱ的表達(dá)明顯增加，進(jìn)一步說(shuō)明了ASB14可能通過(guò)增加泛素化水平，激活線粒體自噬水平來(lái)改善小鼠心力衰竭。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ASB14可能是通過(guò)激活了泛素化介導(dǎo)的線粒體自噬，從而發(fā)揮改善心力衰竭的作用。本研究初步探討了ASB14對(duì)心肌細(xì)胞泛素化及線粒體自噬的影響以及其在改善心力衰竭中的作用，為心力衰竭患者的治療提供了新的靶點(diǎn)。