王美蓮，張耀文，劉北星

（中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病原生物學教研室，沈陽 110122）

瘧疾主要在撒哈拉以南的非洲地區(qū)流行，兒童較成人更易感染。瘧原蟲感染機體可造成全身多個系統(tǒng)及器官發(fā)生損傷［1］。實驗室研究中主要利用伯氏瘧原蟲（Plasmodium berghei，P.b）感染實驗動物進行相關免疫機制的研究，感染初期即發(fā)生強烈的Th1反應，其中樹突狀細胞在誘導適應性免疫過程中起到重要作用。已有研究［1］報道樹突狀細胞參與了瘧疾感染期間T細胞介導的免疫過程的建立與調節(jié)。血吸蟲感染是熱帶與亞熱帶另一種常見寄生蟲病，人們對其免疫過程的研究［2］證實血吸蟲卵可影響樹突狀細胞產(chǎn)生細胞因子的過程。此外，體外卵源性抗原刺激的樹突狀細胞可增強體內(nèi)的Th2反應。因此，樹突狀細胞免疫應答在血吸蟲感染中起重要作用［2］。

從流行病學角度來說，瘧疾與血吸蟲病可在相同區(qū)域內(nèi)流行，因此也可能在同一人群中并發(fā)。在這樣情況下，感染血吸蟲病可能會對感染瘧疾機體產(chǎn)生的免疫應答造成一定的影響。本研究探討P.b與日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，S.j）并發(fā)感染時樹突狀細胞免疫應答的改變；在改變兩種感染的寄生蟲數(shù)量或濃度時，樹突狀細胞免疫應答有無進一步改變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物感染與分組

選取5～6周C57BL/6雌性小鼠，分為低濃度組（小鼠感染150條S.j尾蚴8周后接續(xù)感染5×104P.b）、高濃度組（小鼠感染300條S.j尾蚴8周后感染5×104P.b）、對照組（單獨感染P.b小鼠）。分別在小鼠感染P.b后0、2、5、8 d后處死小鼠。本研究已獲得中國醫(yī)科大學醫(yī)學研究動物倫理委員會批準。

1.2 脾細胞分離與培養(yǎng)

處死小鼠后在無菌狀態(tài)下分離脾臟，取出后常規(guī)用0.17 mol/L NH4Cl對其內(nèi)紅細胞進行裂解。隨即加入濃度為10%的FCS及PRMI1640對脾細胞的濃度進行調整。將脾細胞懸液置于培養(yǎng)板中，37 ℃環(huán)境下加入5%的CO2培養(yǎng)48 h后收集上清液，-80 ℃環(huán)境下冷凍用于后續(xù)實驗。

1.3 細胞表面染色劑胞內(nèi)染色

（1）取單份樣品，分別加入CD11b-FITC單克隆抗體、CD11c-PE單克隆抗體及CD45R/B220-PerCP單克隆抗體，進行3種顏色分析。于染色管中加入脾細胞液后，加入FcγⅡ封閉抗體，再加入CD11b-FITC單克隆抗體、CD11c-PE單克隆抗體及CD45R/B220-PerCP單克隆抗體行細胞表面染色。（2）取單份樣品，分別加入CD11c-PE單克隆抗體、MHCⅡ-FITC單克隆抗體及CD86-PerCP單克隆抗體，進行3種顏色分析。于染色管中加入脾細胞液后，加入FcγⅡ封閉抗體，再加入CD11c-PE單克隆抗體、MHCⅡ-FITC單克隆抗體及CD86-PerCP單克隆抗體。離心后去掉上清液，重新懸浮細胞后加入流式細胞儀進行檢測。（3）取單份樣品，分別加入CD11c-PE單克隆抗體及TLR-4-FITC單克隆抗體后進行2種顏色分析。染色管中加入脾細胞液后，加入FcγⅡ封閉抗體，再加入CD11c-PE單克隆抗體及TLR-4-FITC單克隆抗體。（4）取單份樣品，加入CD11c-PE單克隆抗體并進行2種顏色分析。染色管中加入脾細胞液后，加入FcγⅡ封閉抗體，進行固定并行透膜，加入生物素-TLR9單克隆抗體。

流式細胞儀進行數(shù)據(jù)檢測分析，激發(fā)波長設置為488 nm及635 nm，使用FACS Cell quest軟件對樣品中的細胞進行分析。確定目標細胞群后，以陰性對照管內(nèi)的細胞為對照進行分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 樹突狀細胞亞群的變化

本研究檢測的細胞群中，CD11c+CD11b+以及CD11c+CD45R/B220+為2種樹突狀細胞。對并發(fā)S.j與P.b感染后不同時間檢測樹突狀細胞亞群數(shù)量的結果顯示，所有小鼠脾細胞樹突狀細胞亞群中的細胞于感染P.b后第5天達峰值，繼而下降。在感染P.b后第5天及第8天，低濃度及高濃度組小鼠樹突狀細胞亞群的數(shù)量較對照組顯著降低（P＜ 0.05）。與低濃度組比較，高濃度組在感染P.b后第5天及第8天可進一步減少樹突狀細胞亞群的細胞數(shù)（P＜ 0.05），見圖1。

2.2 樹突狀細胞成熟度的變化

CD86及MHCⅡ 2種樹突狀細胞分子是評價樹突狀細胞成熟度的指標。結果顯示，所有小鼠脾細胞中樹突狀細胞分子在感染P.b后逐漸增高，第5天達峰值后逐漸降低。在感染P.b后第5天及第8天，與對照組比較，低濃度及高濃度組小鼠樹突狀細胞分子數(shù)量顯著降低（P＜ 0.05）。與低濃度組比較，高濃度組在感染P.b后第5天及第8天樹突狀細胞分子數(shù)量進一步減少（P＜ 0.05），見圖2。

圖1 3組小鼠感染后不同時間脾細胞中樹突狀細胞數(shù)比較Fig.1 Comparison of the number of mice splenic dendritic cells among the three groups at different time points of post-infection

圖2 3組小鼠感染后不同時間脾細胞中樹突狀細胞相關分子比較Fig.2 Comparison of the number of mice splenic dendritic molecules among the three groups at different time points of post-infection

2.3 Toll樣受體數(shù)量的改變

Toll樣受體分布于不同免疫細胞表面，有時在其內(nèi)部。本研究中利用CD11c+來定義樹突狀細胞，TLR4+及TLR9+來定義不同的Toll樣受體。本研究利用流式細胞儀檢測的CD11c+TLR4+和CD11c+TLR9+為樹突狀細胞中2種不同Toll樣受體的數(shù)量。結果顯示，所有小鼠脾細胞中2種Toll樣受體數(shù)量在感染P.b后均開始增高，第5天達峰值后降低。在感染P.b后第5天及第8天，與對照組比較，低濃度及高濃度組Toll樣受體數(shù)量顯著減低（P＜ 0.05）。與低濃度組比較，高濃度組在感染P.b后第5天及第8天2種Toll樣受體數(shù)量進一步減低（P＜ 0.05），見圖3。

3 討論

圖3 3組小鼠感染后不同時間樹突狀細胞中Toll樣受體數(shù)量比較Fig.3 Comparison of the number of Toll-like receptors among the three groups at different time points of post-infection

瘧原蟲感染與血吸蟲感染均為熱帶及亞熱帶地區(qū)常見的寄生蟲病，且在當?shù)囟卟l(fā)感染亦十分常見［2-3］。人群可感染不同種屬的瘧原蟲（惡性瘧原蟲及P.b等）與血吸蟲（埃及血吸蟲及曼氏血吸蟲等），其發(fā)病過程、免疫機制及最終的結局也有所不同［4］。S.j主要存在于我國江浙一帶地區(qū)，而P.b則在東南亞地區(qū)較為流行，關于S.j與瘧原蟲并發(fā)感染的實驗室研究罕有報道。此外，大多數(shù)關于原蟲與蠕蟲并發(fā)感染的研究主要集中在Treg介導的Th1/Th2調節(jié)性免疫應答，主要涉及適應性免疫過程，鮮有關于并發(fā)感染時固有免疫機制變化的報道。

樹突狀細胞是固有免疫機制中涉及的主要細胞之一，在原蟲感染過程中，首先由其發(fā)現(xiàn)并吞噬瘧原蟲寄生的紅細胞，且在機體感染致病體后樹突狀細胞會增強其吞噬功能，通過抗原提呈作用將其識別的抗原提交給CD4+T細胞，從而引發(fā)T細胞介導的適應性免疫過程［5-7］。在此過程中，樹突狀細胞的活化可進而調節(jié)CD4+T細胞的表達形式及活性［8］。小鼠脾臟樹突狀細胞群中主要存在髓樣樹突狀細胞與漿樣樹突狀細胞2種細胞，在進行細胞標記時分別為CD11c+CD11b+以及CD11c+CD45R/B220+。本研究結果表明S.j與P.b并發(fā)感染時，2種樹突狀細胞的細胞數(shù)均較P.b單獨感染時顯著下降，這也可能對Th1免疫應答有潛在的抑制作用。增加感染S.j數(shù)量時樹突狀細胞的數(shù)量進一步降低，這也進一步提示了S.j感染對固有免疫應答的抑制作用。

機體對瘧原蟲感染的免疫應答中Toll樣受體發(fā)揮了不可替代的作用［9］。TLR4會針對于原蟲感染時機體內(nèi)存在的糖基磷脂酰肌醇發(fā)生免疫應答，而TLR9則會與原蟲感染時產(chǎn)生的瘧色素發(fā)生反應產(chǎn)生相應的免疫應答。隨后，機體發(fā)生進一步反應分泌相關細胞因子與化學因子，從而產(chǎn)生更多的共刺激分子。事實上，實驗性腦型瘧疾產(chǎn)生大腦的病理損傷可能與腦細胞中過多存在的樹突狀細胞以及CD8+T細胞有關，而在敲除TLR9等Toll樣受體的小鼠中發(fā)生原蟲感染時不會發(fā)生實驗性腦型瘧疾，這也說明實驗性腦型瘧原蟲感染產(chǎn)生的固有免疫過程中TLR9主要發(fā)揮免疫損傷作用［9］。本研究結果顯示S.j與P.b并發(fā)感染較P.b單獨感染時其脾細胞內(nèi)的Toll樣受體的數(shù)量顯著降低。增加感染S.j數(shù)量時Toll樣受體數(shù)量進一步降低，這也進一步提示了S.j感染對固有免疫應答的抑制作用。

已有研究［10］表明樹突狀細胞成熟的主要特征是MHCⅡ及CD86等分子表達的增加，此時樹突狀細胞的抗原提呈作用加強，從而進一步上調機體適應性免疫向Th1方向偏移。換言之，樹突狀細胞成熟度增高或減低會改變原蟲感染中Th1/Th2的平衡點。本研究結果表明S.j預感染會降低與P.b并發(fā)感染時樹突狀細胞的成熟度，而增加感染S.j尾蚴的數(shù)量時將進一步抑制樹突狀細胞的成熟。這將最終影響原蟲感染中Th1免疫應答。

綜上所述，S.j與P.b并發(fā)感染時對小鼠的固有免疫產(chǎn)生一定的影響，與P.b單獨感染比較，并發(fā)感染時小鼠脾細胞的樹突狀細胞數(shù)量、分化形式及成熟度表型會有顯著差異。這也說明了S.j感染可抑制P.b感染所產(chǎn)生的固有免疫應答，在改變感染的S.j尾蚴數(shù)量時，將對并發(fā)感染過程中的固有免疫應答產(chǎn)生進一步影響。在后續(xù)研究中，應進一步明確并發(fā)S.j感染對P.b感染Th1/Th2免疫應答的影響以及其產(chǎn)生的前炎性細胞因子與抗炎性細胞因子的影響。