hMOF對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

齊躍，葉秋霖，劉娟娟，林蓓

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜上皮源性惡性腫瘤，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%。近年來(lái)，其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡亦趨于年輕化［1］。組蛋白乙?；揎検侵匾谋碛^遺傳學(xué)修飾之一，可通過(guò)改變某些特殊位點(diǎn)的組蛋白與DNA的某些區(qū)域結(jié)合的緊密性，從而改變相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，影響轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［2］。組蛋白乙?；揎検芤阴；负腿ヒ阴；傅碾p重調(diào)節(jié)［3］，hMOF是組蛋白乙?；溉蠹易逯蠱YST家族的重要成員［4］，又被稱(chēng)為MYST1或賴(lài)氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶8（lysine acetyltransferase 8，KAT8）。hMOF基因定位于人染色體16p11.2，編碼467個(gè)氨基酸，分子量52.4×103。hMOF參與胚胎發(fā)育、維護(hù)染色體的穩(wěn)定性［5］、DNA損傷修復(fù)［6-7］、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等多種重要基礎(chǔ)生命過(guò)程，hMOF表達(dá)異常亦影響多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后［8-9］。而hMOF在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用小干擾RNA（small intefering RNA，siRNA）

技術(shù)抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中hMOF的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的改變，為組蛋白乙?；揎棾蔀樽訉m內(nèi)膜癌新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，由盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑：hMOF鼠抗人單克隆抗體（美國(guó)GeneTex公司）；GAPDH鼠抗人單克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋試劑公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；胰酶、DMSO（美國(guó)Sigma公司）；TRIzol試劑、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；MTT（中國(guó)Solarbio公司）；細(xì)胞周期試劑盒、Annexin-Ⅴ-APC/7AAD試劑盒（中國(guó)凱基公司）；Transwell小室、細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿（美國(guó)Corning Coster公司）；BCA試劑盒（上海碧云天公司）；瓊脂糖（美國(guó)Promega公司）；PVDF膜（美國(guó)Millipore公司）；hMOF siRNA 片段和空白對(duì)照片段（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化，取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取指數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至融合度達(dá)到50%左右進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，更換Opti-MEM培養(yǎng)基，加入含有干擾片段1.5 μg的培養(yǎng)基，混勻，加入促轉(zhuǎn)染試劑3.75 μL，避光室溫放置5 min，加入混合好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染72 h后檢測(cè)干擾效果，使用轉(zhuǎn)染48～72 h的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。共設(shè)3組：對(duì)照組、空白轉(zhuǎn)染對(duì)照組（siRNA-NC組）和實(shí)驗(yàn)組（siRNAhMOF組）。

1.2.3 Western blotting檢測(cè)hMOF蛋白水平：取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，漂洗，加入細(xì)胞裂解液，冰上靜置裂解，刮取細(xì)胞，超聲波進(jìn)一步裂解，離心，留取上清，采用BCA法測(cè)∶定細(xì)胞中的總蛋白濃度，按比例稀釋蛋白樣品，煮沸蛋白變性。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠，蛋白上樣至孔槽中，每孔上樣量為50 μg，電壓為濃縮膠80 V、分離膠120 V條件下電泳。將PVDF膜在甲醇中浸泡5 min；4 ℃ 90 V電壓轉(zhuǎn)印1～3 h至PVDF膜。脫脂牛奶封閉，孵育一抗，hMOF鼠抗人單克隆抗體（1 ∶100），GAPDH鼠抗人單克隆抗體（1 ∶3 000），封膜，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。室溫復(fù)溫，漂洗，孵育二抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1 ∶5 000）或山羊抗兔IgG（1 ∶5 000）室溫?fù)u床孵育2 h。漂洗，顯色。Image J軟件測(cè)目的蛋白條帶相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，稀釋成濃度為3×103/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔加入200 μL，細(xì)胞24 h充分貼壁伸展后加入小干擾試劑，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1、2、3、4 d，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，震蕩10 min，酶聯(lián)檢測(cè)儀檢測(cè)吸光度（490 nm）。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以吸光度為縱坐標(biāo)制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：采用Annexin-Ⅴ-APC/7AAD雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，按凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞沉淀，重懸細(xì)胞，先后加入5 μL APC染劑和7AAD染劑，孵育，上機(jī)檢測(cè)存活、早期凋亡、晚期凋亡和死亡細(xì)胞百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：取指數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞接種于6孔板，融合度達(dá)90%，用移液槍頭（10 μL）在孔板中心劃取直線劃痕，PBS輕柔沖洗，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，分別在顯微鏡下觀察劃痕寬度并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：Transwell小室上室內(nèi)鋪Matrigel膠，干燥后，下室加入500 μL 5%胎牛血清培養(yǎng)基，上室加入200 μL無(wú)血清培養(yǎng)基細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)量2×105個(gè)），37 ℃孵育72 h后取出小室。多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，用棉簽將上室擦凈，顯微鏡下計(jì)數(shù)下室濾膜面浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 siRNA干擾hMOF前后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞hMOF蛋白水平的變化

將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA靶向干擾hMOF，Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后hMOF蛋白水平的變化，結(jié)果顯示，siRNA-hMOF組與siRNANC組相比hMOF蛋白水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），表明hMOF被有效沉默。見(jiàn)圖1。

圖1 Western blotting檢測(cè)siRNA干擾hMOF前后Ishikawa細(xì)胞hMOF蛋白的表達(dá)水平Fig.1 Expression of hMOF before and after transfection of siRNA-hMOF in Ishikawa cells detected by Western blotting

2.2 干擾hMOF表達(dá)前后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的變化

檢測(cè)干擾hMOF表達(dá)前后Ishikawa細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)（1、2、3、4 d）的OD值，并繪制增殖曲線。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4 d時(shí)siRNA-hMOF組與siRNA-NC組相比細(xì)胞增殖能力明顯下降（P＜ 0.01），siRNA-NC組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖2。

圖2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA干擾hMOF前后Ishikawa細(xì)胞增殖能力的變化Fig.2 The proliferation ability before and after transfection of siRNA-hMOF in Ishikawa cells detected by MTT assay

2.3 干擾hMOF表達(dá)前后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡的變化

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干擾hMOF表達(dá)前后Ishikawa細(xì)胞凋亡的變化，結(jié)果顯示，siRNA-hMOF組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率（分別為5.18%和8.28%）較siRNA-NC組（分別為3.83%和4.98%）均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 Annexin-Ⅴ-APC/7AAD雙染檢測(cè)siRNA干擾hMOF前后Ishikawa細(xì)胞凋亡的變化Fig.3 The apoptosis rates before and after transfection of siRNA-hMOF in Ishikawa cells detected by Annexin-Ⅴ-APC/7AAD assay

2.4 干擾hMOF表達(dá)前后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移能力的變化

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-hMOF組細(xì)胞遷移能力較siRNA-NC組明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），siRNA-NC組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖4。

2.5 干擾hMOF表達(dá)前后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲能力的變化

siRNA-hMOF組與siRNA-NC組相比穿膜細(xì)胞數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），siRNA-NC組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖5。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA干擾hMOF前后Ishikawa細(xì)胞遷移能力的變化Fig.4 The migration ability before and after transfection of siRNA-hMOF in Ishikawa cells detected by wound healing test

圖5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA干擾hMOF前后Ishikawa細(xì)胞侵襲能力的變化Fig.5 The invasion ability before and after transfection of siRNAhMOF in Ishikawa cells detected by Transwell assay

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，并且逐漸趨于年輕化，但其發(fā)病機(jī)制目前仍不十分明確，進(jìn)一步研究其腫瘤惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制尤為重要，探尋更為有效的治療靶點(diǎn)具有臨床意義。

近年來(lái)，有學(xué)者逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤并非全部由基因異常引起，表觀遺傳學(xué)即非DNA水平改變導(dǎo)致的基因表達(dá)水平變化亦在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，故越來(lái)越受到重視。組蛋白乙?；概c組蛋白去乙?；付吖餐饔?，維持著特殊位點(diǎn)的組蛋白賴(lài)氨酸殘基的乙?；降膭?dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)改變，從而調(diào)控某些基因的轉(zhuǎn)錄。hMOF是三大乙?；讣易逯蠱YST家族中的重要成員。組蛋白有多個(gè)乙酰化位點(diǎn)，但人類(lèi)的正常細(xì)胞中大約有60%的H4組蛋白僅發(fā)生16位賴(lài)氨酸單一位點(diǎn)的乙?；?，即多種疾病與該位點(diǎn)的乙酰化水平存在相關(guān)性。hMOF則能特異性乙?；M蛋白H4K16位點(diǎn)［9-10］，與胚胎發(fā)育、維護(hù)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)［9］、染色體穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［5-7］、DNA損傷修復(fù)［6］等密切相關(guān)?？梢?jiàn)，hMOF在多種基礎(chǔ)生理過(guò)程中起著調(diào)控作用，而hMOF酶活性的喪失可能在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

已有研究表明，hMOF的表達(dá)異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)，但其在不同腫瘤中的表達(dá)并不完全相同。hMOF在某些腫瘤中表達(dá)增高，表現(xiàn)為致癌作用。有研究［11］發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌組織中hMOF和H4K16乙酰化水平較正常組織升高，hMOF能夠促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、黏附，并通過(guò)Skp2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入S期，與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。還有研究［12］發(fā)現(xiàn)，hMOF介導(dǎo)Nrf2乙?；龠M(jìn)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和耐藥。前列腺癌研究［13］發(fā)現(xiàn)，hMOF與WDR5在雄激素受體靶基因上存在共定位，敲除hMOF基因后，顯著降低了雄激素受體靶基因的表達(dá)，且降低了前列腺癌細(xì)胞增殖?？谇簧圜[狀細(xì)胞癌研究［14］發(fā)現(xiàn)，hMOF在癌組織中呈高表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān)，同時(shí)EZH2（Zeste基因增強(qiáng)子人類(lèi)同源2）亦呈高表達(dá)，敲低hMOF降低了EZH2的表達(dá)，可見(jiàn)EZH2是hMOF的作用靶點(diǎn)之一。然而，hMOF在其他某些腫瘤中表達(dá)卻降低，表現(xiàn)為抑癌作用。腎癌、結(jié)直腸癌和胃癌研究［15］發(fā)現(xiàn)，hMOF蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯降低，與胃癌患者的生存時(shí)間存在相關(guān)性。腎透明細(xì)胞癌、乳腺癌和髓母細(xì)胞瘤研究［16-17］發(fā)現(xiàn)，hMOF的表達(dá)與H4K16位點(diǎn)的乙?；骄黠@降低，其表達(dá)下降是髓母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在腎透明細(xì)胞癌中，其表達(dá)還與臨床分期、病理分級(jí)密切相關(guān)［18］。在肝癌組織和細(xì)胞中hMOF蛋白和mRNA水平均顯著下降，hMOF低表達(dá)預(yù)示總生存和無(wú)病生存情況較差；敲低hMOF后則促進(jìn)了肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，過(guò)表達(dá)hMOF則抑制其生長(zhǎng)［19］。本課題組的前期研究曾檢測(cè)卵巢癌組織中hMOF的表達(dá)，在上皮性卵巢癌中，其蛋白和mRNA水平均顯著降低，與分期存在密切相關(guān)；且hMOF高表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯高于低表達(dá)患者，從而說(shuō)明hMOF高表達(dá)在卵巢癌中是一種保護(hù)性因素［20］。可見(jiàn)，hMOF在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但其作用并不完全相同。

hMOF在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其與腫瘤惡性生物學(xué)行為的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)hMOF呈高表達(dá)，本研究又將Ishikawa細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hMOF的小干擾片段，敲低hMOF后，表現(xiàn)為Ishikawa細(xì)胞的增殖能力明顯下降，早期凋亡率和晚期凋亡率均增加。本研究發(fā)現(xiàn)，hMOF與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖存在相關(guān)。敲低hMOF后，Ishikawa細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯下降?？梢?jiàn)，hMOF同時(shí)又與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)。

綜上所述，本研究通過(guò)siRNA技術(shù)構(gòu)建了hMOF低表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系，以探討hMOF在子宮內(nèi)膜癌惡性生物學(xué)行為中的作用。本研究結(jié)果提示，干擾hMOF表達(dá)后，抑制了子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡?？梢?jiàn)，hMOF在子宮內(nèi)膜癌的惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，可能影響子宮內(nèi)膜癌預(yù)后。本研究?jī)H局限在hMOF對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外惡性生物學(xué)行為的影響，與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系及其作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究，以期為子宮內(nèi)膜癌的治療尋找新的靶點(diǎn)。