鐵皮石斛兩個(gè)DEAD-box RNA解旋酶基因克隆及特征分析

李元敏，李 慧，梁小燕，高 靜，沈 霞，顏永剛，李依民，張 崗

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，西安 712046)

解旋酶(Helicase)是所有生命體中普遍存在的、具有促進(jìn)雙鏈DNA/RNA解鏈的驅(qū)動(dòng)蛋白。根據(jù)蛋白序列結(jié)構(gòu)域的差異，解旋酶被分為兩個(gè)主要的超家族SFⅠ和SFⅡ，其中RNA Helicase(RH)在后者中占比較大[1]。第二個(gè)基序具有的氨基酸殘基天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(D-E-A-D)特征的一類RH命名為DEAD-box RNA Helicase(DEAD-box RH)[2]。研究表明，DEAD-box RH主要作為RNA分子伴侶，參與RNA轉(zhuǎn)錄與翻譯及其他加工修飾等一系列代謝過程[3]。

目前，已有大量關(guān)于病毒[4]、細(xì)菌[5]和動(dòng)物[6]DEAD-box RH的研究報(bào)道，主要涉及RNA復(fù)制周期、細(xì)胞增殖和分化等功能，臨床醫(yī)學(xué)研究揭示RH與腫瘤發(fā)生、癌癥發(fā)展等密切相關(guān)。近年來，該基因在植物分子生理學(xué)與植物細(xì)胞生理學(xué)的研究受到關(guān)注。如OsRH2和OsRH34在調(diào)控水稻株高、花粉與種子發(fā)育方面起重要作用[7]。AtRH7是模式植物擬南芥在冷脅迫下生長發(fā)育所必需的條件[8]。蕨類問荊的EaRH1基因序列分析揭示其與植物體生理、生化和非生物脅迫應(yīng)答等相關(guān)[9]。植物RH基因研究涉及的藥用物種數(shù)量目前較局限，大多是關(guān)于玉米[1]、水稻[7]、番茄[10]等農(nóng)作物抗逆生理的研究。

蘭科鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo為多年生植物，以莖入藥，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[11]。其化學(xué)成分以多糖、生物堿類為主，同時(shí)藥理研究揭示其降低血糖、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等方面的作用機(jī)制[12]。前期，課題組構(gòu)建鐵皮石斛cDNA文庫進(jìn)行功能基因研究[13]，兩條EST C377、C468與植物RH家族成員序列相似性較高。鑒于RH在植物細(xì)胞生理過程中的重要作用，本研究利用RACE首次克隆獲得鐵皮石斛RNA解旋酶DoRH1和DoRH2基因全長，并進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析及特性預(yù)測，為后續(xù)該基因在石斛中的分子功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

野生植物材料于2017年10月采自浙江金華，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)張崗教授鑒定為蘭科石斛屬鐵皮石斛D.officinaleKimura et Migo。鐵皮石斛幼苗正值營養(yǎng)生長時(shí)期，株高(10±2)cm，取5株幼苗根、莖、葉不同部位樣品，重復(fù)3次，置液氮速凍后超低溫保存。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

利用RNA試劑盒(北京艾德萊)、RQ1無RNase活性DNA 酶(Promega，美國)、NanoDropTM2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher，美國)，依次進(jìn)行總RNA的提取、DNA雜質(zhì)的消除以及RNA質(zhì)量和純度檢測的操作，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。使用M-MLV Reverse Transcriptase kit(Promega，美國)合成cDNA第一鏈。

1.3 RACE克隆

通過序列分析可知C377編碼的肽段N端和C段均不完整，因此需進(jìn)行對其兩端進(jìn)行RACE克隆，C468序列編碼的肽鏈片段在C末端含有58個(gè)氨基酸，所以只需操作5′-RACE克隆。使用RACE cDNA Amplification Kit(Clotech，Japan)設(shè)計(jì)基因特異引物(表1)，然后利用設(shè)計(jì)所得特異引物分別與試劑盒中相應(yīng)的UPM引物依次組合進(jìn)行RACE反應(yīng)。

表1 引物及其序列Table 1 Primers and sequence

1.4 序列分析

使用在線相關(guān)分析工具對DoRH1和DoRH2基因進(jìn)行核酸及蛋白序列分析。在 NCBI的BLASTx和ORF Finder分別對cDNA序列分析；用ExPASy Proteomics Server的一系列程序工具對2個(gè)基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和基元分析；使用Protparam和SOPMA相互對比分析蛋白理化特性和二級(jí)結(jié)構(gòu)；SignalP 4.1和TMHMM推測其是否存在信號(hào)肽序列或跨膜域的個(gè)數(shù)；Plant-mPLoc預(yù)測亞細(xì)胞定位。使用DNASTAR 6.0軟件中的MegAlign程序?qū)ν易宓鞍字g進(jìn)行多序列比對；借助MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 qPCR分析

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

經(jīng)過兩次巢式RACE反應(yīng)，C377F2、C468R2′與UPM組合擴(kuò)增分別獲得預(yù)期單條帶(圖1)，經(jīng)克隆測序獲得長1 578、1 595 bp的兩條序列，均包含完整的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，無需進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證。分別拼接相應(yīng)的RACE產(chǎn)物和原始EST得到兩條cDNA序列分別長為1 648 bp和1 851 bp。通過BLASTx比對發(fā)現(xiàn)兩條序列與已注冊的多種植物RH家族成員基因的一致性評價(jià)較高(>83%)，故此定名分別為DoRH1和DoRH2，提交GenBank獲得注冊號(hào)分別為KT957555和KT957556。序列分析顯示，DoRH1與DoRH2兩序列的完整ORF分別長1 287 bp、1 500 bp，其中二者的 5′-UTR和3′-UTR分別為75 bp和 286 bp及62 bp和289 bp；且在兩條序列中均含有真核生物特有的polyA尾巴結(jié)構(gòu)，起始密碼子附近堿基序列分別為AGAATGG、GTCATGA，DoRH1符合KOZAK規(guī)則[16]。

M.DL 2000; 1.DoRH1-5′ RACE；2.DoRH1-3′RACE；3.DoRH2-5′RACE

2.2 蛋白理化特性分析

Compute pI/MW預(yù)測DoRH1和DoRH2基因編碼蛋白的分子式分別為C2135H3405N581O641S23和C2458H3903N695O737S14，相對分子質(zhì)量分別為48 206和55 432，等電點(diǎn)分別為5.51和8.65；DoRH1和DoRH2蛋白所帶正電殘基(Arg+Lys)為51和68，負(fù)電殘基(Asp+Glu)為68和64。兩個(gè)蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為41.01和39.56，脂肪系數(shù)(Aliphatic index)為94.49和82.08，親水性系數(shù)(Grand average of hydropathicity)為-0.197和-0.430。SOPMA分析表明，DoRH1和DoRH2的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由延伸鏈(16.59%和16.63%)、α-螺旋(45.09%和32.46%)、隨機(jī)卷曲(31.07%和42.69%)及β-轉(zhuǎn)角(7.24%和8.22%)組成。

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測

利用InterProScan與PROSITE的在線分析預(yù)測結(jié)果一致表明(圖2)， DoRH1和DoRH2蛋白均含有3個(gè)保守的RH結(jié)構(gòu)域，分別為 Q_MOTIF(DEAD-box RNA解旋酶Q基序)、 HELICASE_ATP_BIND_1(超家族1和2解旋酶ATP結(jié)合型-1結(jié)構(gòu)域)、HELICASE_CTER(超家族1和2解旋酶C末端結(jié)構(gòu)域)。PROSITE SCAN分析表明，兩個(gè)蛋白均含有不同氨基酸位點(diǎn)的蛋白家族基元(表2)。使用SignalP 4.1和TMHMM在線分析一致表明，兩個(gè)蛋白信號(hào)肽或跨膜域，同時(shí)Plant-mPLoc預(yù)測兩個(gè)蛋白均定位在細(xì)胞核。

圖2 DoRH1和DoRH2蛋白的PROSITE分析Fig.2 PROSITE analyses of DoRH1 and DoRH2 proteins

表2 DoRH1和DoRH2蛋白序列的保守基元Table 2 Conserved motifs of DoRH1 and DoRH2 proteins

2.4 蛋白多序列比對

借助DNAStar 6.0軟件中的MegAlign對RH家族的兩個(gè)目的蛋白和其他植物蛋白進(jìn)行多序列比對(圖3-A、3-B)。數(shù)據(jù)分析顯示，DoRH1與葡萄Vitisvinifera(XP_002268833)、可可Theobromacacao(EOY29499)、番木瓜Caricapapaya(XP_021912509)和芝麻Sesamumindicum(XP_011070464)的相似性分別高達(dá)94%、95%、95%和95%。DoRH2與中華獼猴桃Actinidiachinensisvar.chinensis(PSS18057)、葡萄Vitisvinifera(XP_002268823)、苦瓜Momordicacharantia(XP_002279117)和柑桔Citrussinensis(XP_006466042)等蛋白的相似性分別高達(dá)86%、85%、84%和84%。此外，兩個(gè)蛋白各有3個(gè)保守的RH結(jié)構(gòu)域，符合DEAD-box RNA helicases家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

2.5 蛋白分子進(jìn)化關(guān)系

為分析鐵皮石斛DoRH1、DoRH2基因編碼蛋白的分子進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA 6.0軟件鄰接法(Neighbour-Joining)從利用phytozome數(shù)據(jù)庫選取擬南芥、水稻、大豆和雷蒙德氏棉等4種植物的部分DEAD-box RNA helicase蛋白家族成員[17]，構(gòu)建分子進(jìn)化樹。對比擬南芥進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)Ⅲ支中AT2G45810(AT2G45810.1)、AT4G00660(AT4G00660.1、AT4G00660.2)、AT3G61240(AT3G61240.1、AT3G61240.2)分別被命名為ATRH6、ATRH8、ATRH12；Ⅳ支中AtRH20 (AT1G55150.1) DEAD-box解旋酶是酵母Dbp2 DEAD-box解旋酶的直系同源物，同支水稻基因LOC_Os01g68320.1、LOC_Os01g68320.2、LOC_Os01g10050.1、LOC_Os01g10-050.2均具有相同的Dbp2基因，系Dbp2 DEAD-box解旋酶[18]。從圖4可以看出，所選RH蛋白被聚成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4小支；目標(biāo)DoRH1、DoRH2蛋白分別聚在Ⅲ、Ⅳ支。

Vv.葡萄；Cp.番木瓜； Si.芝麻；Tc.可可豆；Do.鐵皮石斛；Acc.中華獼猴桃；Cs.柑桔；Mc.苦瓜；實(shí)線為2個(gè)RH結(jié)構(gòu)域，1.DEAD-box RNA解旋酶Q基序譜；2.超家族1和2解旋酶ATP結(jié)合型-1結(jié)構(gòu)域；3.超家族1和2解旋酶C末端結(jié)構(gòu)域

2.6 組織表達(dá)特異性分析

分別提取鐵皮石斛根、莖、葉各樣品總RNA，借助qPCR檢測2個(gè)基因的不同組織表達(dá)特性。由圖5可見，DoRH1和DoRH2基因轉(zhuǎn)錄本在3種組織中的相對表達(dá)量有差異，但基因表達(dá)趨勢類似，二者均在根中高豐度表達(dá)。DoRH1在根中的相對表達(dá)量為葉中的1.26倍，而在莖中為葉中的0.76倍；DoRH2在根中的相對表達(dá)量為葉中的3.26倍，莖中與葉中的表達(dá)量近似，僅葉中的1.04倍。

3 討 論

DEAD-box RNA解旋酶通過NTP(大多為ATP)水解產(chǎn)生能量來修飾RNA，廣泛參與RNA生物化學(xué)反應(yīng)各個(gè)過程，在細(xì)胞核內(nèi)主要參與核糖體發(fā)生、轉(zhuǎn)錄和mRNA前體剪接，胞質(zhì)中主要參與miRNA加工、無義突變介導(dǎo)的mRNA降解、蛋白翻譯和細(xì)胞器特異的RNA代謝等[19]。目前已有玉米[1]、水稻[7]和擬南芥[8]等植物中DEAD-box RNA解旋酶家族基因的系統(tǒng)研究，揭示其在植物生長發(fā)育和生理適應(yīng)中的作用。本研究首次從鐵皮石斛中分離到DoRH1和DoRH2基因全長，與GenBank中已注冊的植物DEAD-box RNA解旋酶家族成員基因一致性很高，2個(gè)基因編碼蛋白各有3個(gè)保守域，如DEAD-box RNA解旋酶Q基序，符合其家族高度保守的特征[1]。2個(gè)蛋白預(yù)測都定位在細(xì)胞核，可能參與細(xì)胞核生化反應(yīng)，與已報(bào)道中DEAD-box RNA解旋酶主要作用于核RNA加工的研究相符合[20]。

以AT、LOC_Os、Glyma和GRMZM起始的符號(hào)分別為擬南芥、水稻、大豆和雷蒙德氏棉的RH基因注冊號(hào)

圖5 q-PCR分析 DoRH1和 DoRH2基因的組織表達(dá)Fig.5 Tissue-specific expression of DoRH1 and DoRH2 genes using q-PCR analysis

進(jìn)化樹分析2個(gè)鐵皮石斛RH基因分別聚為Ⅲ、Ⅳ兩大支，Ⅲ支中ATRH6會(huì)受低溫誘導(dǎo)，ATRH8是馬鈴薯屬病毒VPg(Viral genome-linked protein)蛋白感染過程中所需要的一個(gè)宿主因子，幫助病毒復(fù)制，若敲除后會(huì)使植物體不僅在表型上與野生型無異，還會(huì)在被病毒侵染過程產(chǎn)生抗性[19]。Ⅳ支中AtRH20與Dbp2蛋白功能在tombusvirus家族TBSV病毒(Tomatobushystuntvirus)的復(fù)制中具有高度相似性，均促進(jìn)RNA病毒復(fù)制[21]；據(jù)報(bào)道在該病毒天然宿主植物番茄、模式植物擬南芥以及菠菜植株體內(nèi)感染TBSV病毒后，植物的表型均發(fā)現(xiàn)明顯的發(fā)育畸變，生長發(fā)育遲緩，葉量濃密，葉子尺寸變小且卷曲，基部葉片褪綠呈紫色，果實(shí)產(chǎn)量大大降低且多無籽[22]。因此，推測DoRH1、DoRH2參與石斛特殊生境下的生理適應(yīng)，其具體作用方式仍需要深入研究。

解析基因功能多樣性的首要工作是對基因表達(dá)差異的研究。DEAD-box RNA helicase家族成員的基因表達(dá)具有組織表達(dá)、時(shí)空表達(dá)或響應(yīng)脅迫等特點(diǎn)，功能涉及到植物生長發(fā)育和抗逆生理性等多方面[23]。擬南芥中有多個(gè)DEAD-box家族基因參與抗逆，其中AtRH38和AtRH42是對溫度脅迫反應(yīng)最具典型的代表[19]。對玉米配子體細(xì)胞質(zhì)雄性不育系分析發(fā)現(xiàn)，ZmRH2表達(dá)在葉、根和雌穗3個(gè)器官中無明顯差異，而對于花絲和花粉器官中的表達(dá)明顯可育系高于不育系S-Mo17rf3rf，說明ZmRH2參與可育系花粉發(fā)育調(diào)控[1]。PRH75基因在菠菜下胚軸、根和頂芽等器官中表達(dá)水平較高，在葉子發(fā)育進(jìn)程中明顯下降，表明PRH75與葉細(xì)胞的快速增殖和分裂有關(guān)[24]。在本研究中，qPCR對DoRH1和DoRH2基因檢測分析發(fā)現(xiàn)，DoRH1不具有器官表達(dá)差異，推測參與在石斛各器官本底的生長發(fā)育；DoRH2在各器官中表達(dá)豐度差異明顯，依次為根>莖>葉，推測在根中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。由此可見，多基因家族成員通過協(xié)同表達(dá)調(diào)控發(fā)揮基因功能。當(dāng)然，更具體確切的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。鐵皮石斛作為珍稀傳統(tǒng)名貴中藥材，臨床療效顯著，具有可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值；但其生長環(huán)境條件特殊，表現(xiàn)出一定的生理適應(yīng)。后續(xù)通過RNAi或過表達(dá)研究DoRH1和DoRH2的分子作用，為石斛資源可持續(xù)控制與利用提供 支撐。