苦蕎芽菜游離酚、結(jié)合酚及抗氧化活性研究

孫坤坤，盧奕霏，侯澤豪，魏淑東，方正武(. 長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北荊州 43405；

2. 長江大學(xué) 生命科學(xué)院，湖北荊州 434025)

蕎麥屬于蓼科植物，主要分為甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)和苦蕎(FagopyrumtaraicumGaerth)兩個栽培種，是藥食同源的小宗糧作物。與其他谷物相比，蕎麥含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、淀粉、維生素、礦物質(zhì)等[1]，并且富含蘆丁、槲皮素和一些其他的多酚類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，受到世界各國食品界和醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注[2-3]。大量研究結(jié)果表明，蕎麥種子經(jīng)過適當(dāng)發(fā)芽，可以降低蕎麥中抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，提高其營養(yǎng)價(jià)值，形成獨(dú)特的風(fēng)味和口感等。蕎麥芽菜是近年來市場上出現(xiàn)的一種新型蔬菜，具有較高的市場應(yīng)用價(jià)值[4]。前人研究表明，以蕎麥芽菜的形式食用可有效提高人體脂肪酸、氨基酸、還原糖、類黃酮和維生素的含量，促進(jìn)抗氧化活性提高，增加人體對蛋白質(zhì)的消化率[5-6]。蕎麥芽菜風(fēng)味獨(dú)特，可以直接烹飪，還可制作面包、飲料和保健食品等[7]。因此，相對蕎麥籽粒，蕎麥芽菜具有更高的營養(yǎng)價(jià)值。

目前，關(guān)于蕎麥芽菜的研究主要集中在營養(yǎng)成分和生物活性等方面，侯建霞[8]采用毛細(xì)管電泳法測定蕎麥芽菜中蘆丁、槲皮素和表兒茶素含量的變化，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)至第7天各物質(zhì)含量最大；成少寧[9]研究蕎麥芽提取物中黃酮類物質(zhì)的含量，但是只檢測到蘆丁和槲皮素。多酚化合物作為一類次級代謝產(chǎn)物，在植物中廣泛存在，分為游離酚和結(jié)合酚[10]。前人研究發(fā)現(xiàn)玉米、小麥、大米等谷物籽粒中的酚類物質(zhì)主要是以結(jié)合態(tài)形式存在[11]。Ti等[12]研究結(jié)果表明，水稻籽粒發(fā)芽的糙米自由酚和結(jié)合酚及抗氧化活性隨著萌發(fā)時間的延長而逐漸升高。關(guān)于蕎麥籽粒萌發(fā)處理后總酚、總黃酮、抗氧化性、蘆丁和槲皮素等研究報(bào)道主要集中在酚類物質(zhì)的游離態(tài)部分，而對提取物中結(jié)合酚結(jié)構(gòu)組成和生物活性的研究卻很少涉及[13-14]。Rondini等[15]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合酚在生物體內(nèi)能發(fā)揮更好的生物活性，并且具有潛在的功效來保護(hù)生物體。因此，全面分析植物多酚化合物的含量和組成分布特點(diǎn)，為植物酚類化合物功能性食品的開發(fā)提供參考。

本試驗(yàn)通過研究苦蕎從籽粒至芽菜形成過程中游離酚和結(jié)合酚的含量、組成分布及抗氧化活性的動態(tài)變化，以期為蕎麥芽菜的功能性食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎品種‘昭苦2號’于2018-08-15種植于湖北省江漢平原長江大學(xué)農(nóng)業(yè)科研基地(112° 15′E，30°36′N，海拔34 m)，11月份收獲，種子曬干后儲藏在-20 ℃冰箱，備用。

山奈酚(Kaempferol)、表兒茶素(Epicatechin)、槲皮素(Quercetin)、沒食子酸(Gallic acid，GA)等購于Sigma公司；山奈酚-3-蕓香糖苷(Kaempferol-3-rutinoside)購于ApexBio公司；色譜純乙腈、乙酸和標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁(Rutin)購于麥克林公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器和設(shè)備有人工氣候箱JYC-412(上海佳語科學(xué)儀器有限公司)，Allegra X-30R系列離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司)，N-1200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，真空冷凍干燥機(jī)(德國Martin Christ公司)，雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 苦蕎籽粒發(fā)芽 蕎麥種子手工去殼后，蒸餾水浸泡4 h，瀝水，均勻放置在鋪滿兩層紗布的培養(yǎng)皿中，25 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)，每隔8 h澆1次水，分別在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天取樣，將樣品冷凍干燥，加工后儲存在-20 ℃冰箱，備用。

1.3.2 游離酚提取 參照Perales-Sánchez等[16]和Waszkowiak等[17]的多酚提取方法并稍有調(diào)整。分別稱取萌發(fā)時間不同的樣品1 g。加入8 mL正己烷，震蕩1 min后靜置10 min，重復(fù)3次，4 ℃、4 000 g離心10 min，去除上清液，重復(fù)3次。再向沉淀中加入8 mLφ=80%乙醇，每隔10 min震蕩1 次，30 min后4 ℃、4 000 g離心 10 min，收集上清液。重復(fù)上述步驟3次，合并上清液，37 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，φ=80%乙醇定容至 10 mL，-20 ℃保存，備用。

1.3.2 結(jié)合酚提取 參照Adom等的方法[11]，向上述游離酚提取殘?jiān)屑尤?0 mL 2 mol/L NaOH，在氮?dú)鈼l件下室溫震蕩水解1～2 h后，用6 mol/L HCl將pH調(diào)至1.5～2.0。最后在溶液中加入10 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，4 ℃、 4 000 g離心10 min，收集乙酸乙酯部分。重復(fù)上述步驟5次，合并有機(jī)溶劑，37 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，用φ=50%甲醇復(fù)溶并定容至5 mL，-20 ℃保存，備用。

1.3.3 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu法[18]測定不同萌發(fā)時期苦蕎樣品中總酚的含量。以干基每1 g樣品中所含沒食子酸的量表示總酚的含量(mg/g)。

1.3.4 黃酮含量測定 采用NaNO2-AlCl3·6H2O方法測定不同萌發(fā)時期苦蕎樣品中總黃酮的含量[19]。以干基每1 g樣品中所含蘆丁含量表示總黃酮的含量(mg/g)。

1.3.5 高效液相色譜法測定酚類物質(zhì)的含量及組成 參照J(rèn)iang等[20]建立的方法鑒定苦蕎提取物中酚類物質(zhì)的組成，結(jié)果以mg/g表示。對于槲皮素-3-O-蕓香糖苷-3′-O-β-吡喃葡萄糖苷，其含量以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)表示。

1.3.6 DPPH、ABTS自由基清除能力和FRAP還原抗氧化能力 采用Brand-Williams等[21]研究方法測定提取物的DPPH自由基清除能力。DPPH值以干基每1 g樣品中所含奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)當(dāng)量(mg/g)表示。

參照Re等[22]的研究方法測定提取物的ABTS自由基清除能力。ABTS值以干基每1 g樣品中所含奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)當(dāng)量(mg/g)表示。

根據(jù)Benzie等[23]的研究方法測定提取物的FRAP還原抗氧化能力。FRAP值以干基每1 g樣品中所含奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)當(dāng)量(mg/g)表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 19.0和Sigmaplot 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，每個處理重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎不同萌發(fā)期多酚和黃酮含量

由表1可知，萌發(fā)過程中(0～7 d)游離酚的含量隨著萌發(fā)時間的延長不斷升高，相比于萌發(fā)前，游離酚的含量在萌發(fā)7 d后顯著增加3.38倍。其中0～2 d游離酚的含量增幅較小，提高 46.85%，而2～5 d增加較快，6～7 d緩慢增加，萌發(fā)到第6天達(dá)到(100.87±0.49) mg/g，并且各個萌發(fā)時間游離酚的含量差異顯著(P< 0.05)。萌發(fā)過程中結(jié)合酚的含量從(2.50± 0.03) mg/g升至(10.79±0.06) mg/g，且各個萌發(fā)期結(jié)合酚的差異顯著。總酚的含量從 (27.21±0.63) mg/g增至(118.97±0.24) mg/g，與游離酚含量的變化趨勢一致。

萌發(fā)過程中游離黃酮的含量隨著時間的延長不斷升高，其中0～1 d只增加13.05%，而2～5 d游離黃酮的含量提高較快，6～7 d緩慢增加，第6天時達(dá)到(133.87±1.81) mg/g，是萌發(fā)前游離黃酮含量(29.55±0.11) mg/g的4.53倍。結(jié)合黃酮的含量(0～7 d)為(1.43±0.01)～(8.26±0.02) mg/g，萌發(fā)時間點(diǎn)結(jié)合黃酮的含量高于籽粒萌發(fā)前。0～2 d結(jié)合黃酮含量約提高20%， 3～6 d增加緩慢，但相比于萌發(fā)前顯著提高(P<0.05)?？傸S酮含量的變化趨勢與游離黃酮一致，在萌發(fā)第7天時達(dá)到(151.06±1.01) mg/g，是萌發(fā)前的4.88倍，且每個萌發(fā)期結(jié)合黃酮的含量都存在顯著性差異(P<0.05)。

表1 苦蕎不同萌發(fā)期多酚和黃酮含量Table 1 Contents of phenols and flavonoids in tartary buckwheat sprouts at different germination stages mg/g

2.2 酚類物質(zhì)的組成及含量

如圖1所示，在苦蕎不同萌發(fā)期提取物中共鑒別出6種黃酮類物質(zhì)，依次是槲皮素-3-O-蕓香糖苷-3′-O-β-吡喃葡萄糖苷、表兒茶素、蘆丁、山奈酚-3-蕓香糖苷、槲皮素和山奈酚(峰1-6)。HPLC結(jié)果分析表明，苦蕎籽粒至苦蕎芽菜形成過程中酚類物質(zhì)的組成未發(fā)生變化，但含量卻顯著不同 (P<0.05)。

由表2可知，游離態(tài)提取物中蘆丁的含量顯著高于其他5種物質(zhì)，并且萌發(fā)后蘆丁的含量顯著提高，萌發(fā)6 d和7 d分別達(dá)到(50.80±0.15) mg/g和(52.32±0.02) mg/g。由圖2-A可見，蘆丁的含量在萌發(fā)期不斷升高，其中在4～5 d增長最快，6 d之后增加緩慢。游離態(tài)提取物中槲皮素的含量在萌發(fā)1 d(1.98 mg/g)后升至2.51 mg/g，但是第2天后槲皮素的含量開始下降，萌發(fā)至第7天降至1.20 mg/g。由圖2-A可見，槲皮素含量的變化速率相對較緩慢，第2天后槲皮素的含量不斷降低，其中0～1 d增加較快，4～5 d降低較快。游離態(tài)提取物中表兒茶素的含量在萌發(fā)后顯著升高，在第5天時達(dá)到最高(5.73 mg/g)，是萌發(fā)前的10.05倍。由圖2-A可見，表兒茶素的含量在0～5 d不斷升高，其中2～3 d含量升高最快，5～7 d不斷降低。其他3種單體的占比較小，其中槲皮素-3-O-蕓香糖苷-3′-O-β-吡喃葡萄糖苷和山奈酚-3-蕓香糖苷的含量相比于萌發(fā)前顯著升高，而山奈酚的含量變化趨勢與槲皮素一致，在萌發(fā)第7天時降至0.01 mg/g。

結(jié)合態(tài)提取物中蘆丁的含量在萌發(fā)至第5天時相比于萌發(fā)前(0.20 mg/g)顯著降低，而萌發(fā) 6～7 d迅速提高，在第7天時增加81.75%。由圖2-B可見，蘆丁含量在0～3 d不斷降低，5～7 d不斷升高，其中5～6 d增長相對較快。表兒茶素的含量相比于萌發(fā)前(0.09mg/g)不斷升高，在第6天達(dá)到最高(0.67 mg/g)。由圖2-B可見，表兒茶素含量在5～6 d迅速提高，之后開始降低。槲皮素的含量在萌發(fā)5 d后達(dá)到最高(0.08 mg/g)；0～3 d槲皮素的含量基本不變，3～4 d增加較快，之后以不同速率降低；其余3種黃酮單體的含量較低，但是隨著萌發(fā)時間的延長，顯著升高(P<0.05)。6種單體的總含量變化趨勢與游離態(tài)提取物的含量變化一致，主要是因?yàn)榭嗍w中酚類物質(zhì)以游離態(tài)形式存在。

A.苦蕎籽粒萌發(fā)前游離態(tài)提取物的液相圖；B. 苦蕎籽粒萌發(fā)前結(jié)合態(tài)提取物的液相圖；C. 苦蕎籽粒萌發(fā)1 d游離態(tài)提取物的液相圖；D.苦蕎籽粒萌發(fā)1 d結(jié)合態(tài)提取物的液相圖;1.槲皮素-3-O-蕓香糖苷-3′-O-β-吡喃葡萄糖苷；2.表兒茶素；3.蘆?。?.山奈酚-3-蕓香糖苷；5.槲皮素；6.山奈酚

表2 苦蕎不同萌發(fā)期游離酚和結(jié)合酚組成及含量Table 2 Compositions and contents of free and bound phenolic compounds in tartary buckwheat at different germination stages

A. 游離態(tài)提取物中表兒茶素、蘆丁和槲皮素變化速率；B. 結(jié)合態(tài)提取物中表兒茶素、蘆丁和槲皮素變化速率

2.3 抗氧化活性

苦蕎不同萌發(fā)期游離態(tài)和結(jié)合態(tài)提取物的抗氧化活性由DPPH、ABTS和FRAP 3種方法測定，結(jié)果如表3所示。游離態(tài)提取物的抗氧化活性隨著萌發(fā)時間的延長不斷增加。DPPH值在萌發(fā)期間變幅為(30.32±0.41)～(140.74±1.65) mg/g，其中0～1 d和6～7 d增加緩慢，萌發(fā)至第6天，抗氧化活性顯著提高3.46倍，游離態(tài)部分抗氧化活性(DPPH)占總抗氧化活性的百分比為91.54%～96.60%。游離ABTS值為13.35～54.86 mg/g，變化趨勢與DPPH一樣，萌發(fā)至6 d 后增加緩慢，到第7天時是萌發(fā)前的3.44倍，游離態(tài)抗氧化活性在萌發(fā)前占總抗氧化活性的 92.25%，萌發(fā)1～7 d的占比為91.16%～ 96.26%。游離FRAP值變化趨勢與DPPH值相同，萌發(fā)期間游離態(tài)抗氧化性占總抗氧化活性的80%以上。

結(jié)合態(tài)提取物的抗氧化活性隨著萌發(fā)時間的延長呈現(xiàn)先上升再降低后升高的趨勢。結(jié)合DPPH值從萌發(fā)前(1.67 mg/g)到萌發(fā)第7天(9.48 mg/g)提高4.29倍，并且測定的各個萌發(fā)期 DPPH值相比于萌發(fā)前都有所提高，結(jié)合態(tài)DPPH值占總抗氧化活性的百分比為3.40%～ 8.46%。結(jié)合ABTS值變化趨勢與DPPH相同，從2.07 mg/g(0 d)提高至3.86 mg/g(7 d)，占抗氧化活性的百分比為3.74%～8.84%。結(jié)合FRAP值0～7 d變幅為1.48～7.17 mg/g，是萌發(fā)前的 4.83倍，占總抗氧化活性的7.11%～ 16.53%。結(jié)果表明，結(jié)合態(tài)提取物的抗氧化活性在總抗氧化活性占比較低，但卻具有一定的抗氧化性。

總的抗氧化活性DPPH值為32.11～150.22 mg/g，變化趨勢與游離態(tài)相同，2～6 d提高較快。ABTS值和FRAP值分別為14.47～58.71 mg/g和10.37～58.89 mg/g，變化趨勢與DPPH相同。

2.4 苦蕎不同萌發(fā)期多酚、黃酮、抗氧化活性和蘆丁之間的相關(guān)性

由表4可見，游離態(tài)形式存在的多酚、黃酮、抗氧化活性和蘆丁之間顯著相關(guān)，R值在0.982以上(P<0.01)。結(jié)合態(tài)提取物中多酚和黃酮與抗氧化能力之間顯著相關(guān)，R值為0.827～0.975(P<0.01)，而與蘆丁的相關(guān)性相對較低，R值為0.613～0.801。總酚、總黃酮、總抗氧化能力和蘆丁之間顯著相關(guān)，R值在0.956以上(P<0.01)。因此，多酚和黃酮是苦蕎提取物具有抗氧化活性的主要來源物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

3.1 不同萌發(fā)期苦蕎的多酚組成和分布

酚類物質(zhì)主要存在于植物食品中，是一類重要的抗氧化成分。籽粒經(jīng)過萌發(fā)，可以提高多酚的含量和抗氧化性，改善谷物的營養(yǎng)品質(zhì)。本研究揭示苦蕎籽粒萌發(fā)過程中，酚類物質(zhì)含量顯著增加(P<0.05)，與前人研究小麥、豆類和蔬菜等中的報(bào)道相同[24-25]，可能與植物種子萌發(fā)過程中苯丙氨酸解氨酶活性的增加催化合成酚類化合物有關(guān)[26]。本研究分析不同萌發(fā)階段酚類物質(zhì)含量的變化，其中游離酚和游離黃酮在0～1 d緩慢增加，與趙琳[27]研究黃酮含量變化的結(jié)論相反，可能與苦蕎籽粒萌發(fā)處理?xiàng)l件相關(guān)，比如浸泡時間和發(fā)芽的溫度等[12]。本研究結(jié)果表明酚類化合物主要以游離態(tài)形式存在，約占總酚含量的80%以上，與Guo等[28]報(bào)道的結(jié)果一致，而與Adom等[11]報(bào)道的玉米、小麥、大米等其他谷物的結(jié)果不同。先前的研究關(guān)于谷物、蔬菜和水果等中總酚含量測定的報(bào)道僅分析游離態(tài)多酚而忽略了結(jié)合態(tài)多酚，導(dǎo)致整個測量值偏低。本研究結(jié)果表明整個發(fā)芽階段結(jié)合酚的含量相比于萌發(fā)前顯著提高(P<0.05)，與Ti等[12]研究的結(jié)果相似，并且本研究發(fā)現(xiàn)苦蕎結(jié)合酚的含量顯著高于發(fā)芽糙米。在4～5 d這個階段，結(jié)合酚的含量顯著降低，游離酚含量顯著增加，而在其他階段并未出現(xiàn)這一現(xiàn)象，因此，結(jié)合酚含量的降低并不是導(dǎo)致游離酚含量增加的主要原因，這一結(jié)果與Ti等[12]報(bào)道一致。

表3 不同萌發(fā)期苦蕎提取物的抗氧化活性和每個部分占總抗氧化活性的百分比Table 3 Antioxidant activities and contribution percentages of free and bound extracts of tartary buckwheat to its total antioxidant activity at different germination stages

表4 苦蕎不同萌發(fā)期多酚、黃酮、抗氧化能力和蘆丁之間相關(guān)性分析Table 4 Pearson correlation coefficients between antioxidant activities,phenol contents,flavonoid contents and rutin of tartary buckwheat at different germination stages

本研究發(fā)現(xiàn)苦蕎不同發(fā)芽期游離態(tài)和結(jié)合態(tài)提取物中主要的酚類物質(zhì)是黃酮類化合物。其中游離態(tài)提取物中主要的黃酮單體是蘆丁和槲皮素，蘆丁的含量隨著萌發(fā)時間的延長不斷提高，并且萌發(fā)至6～7 d后增加緩慢，而槲皮素則先升高后降低，與王青[29]的研究結(jié)果一致，但與石磊等[30]研究的結(jié)果卻不同，可能與萌發(fā)條件、提取方法、測定方法等有關(guān)。結(jié)合態(tài)提取物中主要的黃酮單體是表兒茶素和蘆丁，其中蘆丁的含量在第7天達(dá)到最高，表明萌發(fā)有利于酚類物質(zhì)的積累，并且蘆丁以蕎麥芽菜形式食用能夠克服其降解，充分提高蘆丁的利用率。因此，綜合考慮到蕎麥芽菜的口感、成本以及營養(yǎng)物質(zhì)等因素，選擇萌發(fā)至第6天的蕎麥作為最優(yōu)質(zhì)的蕎麥芽菜以供市場應(yīng)用開發(fā)。

3.2 不同萌發(fā)期苦蕎提取物的抗氧化活性

本研究通過DPPH、ABTS和FRAP 3種方法測定不同萌發(fā)期苦蕎的抗氧化性，總抗氧化活性隨著萌發(fā)時間的延長不斷提高，其中游離態(tài)提取物的抗氧化性占總抗氧化性的80%以上，表明苦蕎提取物的抗氧化性主要來源于游離態(tài)活性物質(zhì)。結(jié)合態(tài)提取物的抗氧化活性雖然占比較小，但萌發(fā)能夠提高結(jié)合態(tài)多酚的抗氧化活性在總抗氧化活性的百分比。研究結(jié)果表明多酚、黃酮、蘆丁的含量和3 種抗氧化活性之間顯著相關(guān)，與前人研究結(jié)果一致[31-33]，均表明酚類化合物與植物的抗氧化活性密切相關(guān)。因此，萌發(fā)有利于提高苦蕎營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)的含量，為苦蕎的深度加工提供新的途徑，以期能夠更加合理地利用苦蕎資源。