放線菌菌株HJG-5生防劑型的研制及對黃瓜枯萎病的防治效果

李鴻坤，米佳雯，池 明，劉慧芹，王遠宏，單慧勇

(1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.天津農(nóng)學(xué)院 技術(shù)工程學(xué)院，天津 300384)

在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于過分追求高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和高效，改變了傳統(tǒng)的種植制度，從而導(dǎo)致生態(tài)失衡，引發(fā)園藝植物土傳病害發(fā)生加劇[1-2]。黃瓜枯萎病是園藝植物土傳病害的重要代表，嚴重影響黃瓜產(chǎn)量與品質(zhì)，是導(dǎo)致黃瓜連作障礙的主要因素之一[1]?；瘜W(xué)農(nóng)藥是防治土傳病害最常用的方法，但是長期使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致的環(huán)境污染、食品安全、農(nóng)藥殘留等問題日益突顯。生物防治因其成本低、來源廣及對環(huán)境友好等特點，成為當(dāng)前國內(nèi)外防治植物土傳病害的研究熱點。篩選和構(gòu)建具有綜合優(yōu)良性能的拮抗菌株、開展生防菌劑研發(fā)已成為植物病害生物防治的重要發(fā)展方向[2-3]。

放線菌具有防效好、作用譜廣、生物多樣性強、產(chǎn)生抗生素種類豐富的特點，已被廣泛應(yīng)用于植物病害防治[4-6]。中國很早就開展了“5406”抗生菌的研究，用來防病、保苗和增產(chǎn)，并得到廣泛的應(yīng)用，以放線菌開發(fā)的井岡霉素、多效霉素、農(nóng)用鏈霉素等生物農(nóng)藥為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的效益[6-8]，但大量單一使用抗生素會導(dǎo)致病原物抗性增加，也會對人類造成危害。放線菌的活體制劑能夠避免或弱化這些弊端，但放線菌活菌制劑受環(huán)境因素影響極大，2000年美國公布的46種生防菌活菌制劑中，只有1種是放線菌，放線菌菌劑的數(shù)量非常有限，到目前仍然約有90%的放線菌資源尚未得到有效的開發(fā)[9]，放線菌活菌制劑的研制仍然是其開發(fā)應(yīng)用中亟待解決的問題 之一。

固體發(fā)酵是活菌制劑較為傳統(tǒng)的發(fā)酵方式，具有生產(chǎn)設(shè)備相對簡單、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量大及利于保存等特點而受到人們的青睞[10]。放線菌具有一定的耐熱和抗干燥特性，經(jīng)熱處理和干燥處理后可大大降低細菌的干擾，獲得更多更純的活菌，適于固體發(fā)酵的生產(chǎn)方式。冀媛媛等[11]、梁春浩等[12]、Arora等[13]學(xué)者均通過固體發(fā)酵提高了放線菌的產(chǎn)量或活性。在發(fā)酵生產(chǎn)、制劑加工、儲備和實際應(yīng)用方面，不同的微生物菌劑均有明顯差別，但研制的劑型應(yīng)該能最大限度地發(fā)揮生物的功效[11-14]。目前，國內(nèi)外市場中活菌制劑大多集中在芽孢桿菌中[15]，而放線菌則大多集中在抗生素、酶及其代謝物的利用方面[10,16]，其活菌制劑的相關(guān)研究鮮為報道。內(nèi)生放線菌HJG-5是一株分離自花椒根部的肉桂栗色鏈霉菌(Streptomycescinnamocastaneus)，對環(huán)境適應(yīng)能力強，有較強的植物根表和根圍土壤定殖能力，對多種植物病原真菌具有較強的抑制作用[17]，由中國科學(xué)院微生物研究所保藏(專利保存號：CGMCC No.14969)。為了進一步提高其發(fā)酵效能和挖掘其生防潛力，本試驗開展了菌株 HJG-5的固體發(fā)酵及菌劑研制，并開展了對黃瓜枯萎病的防效試驗，以期為植物病害的田間防治提供理論依據(jù)以及菌劑的研制開發(fā)提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：內(nèi)生放線菌菌株HJG-5由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)化保實驗室提供，黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumsp. cucumebrium)由天津農(nóng)學(xué)院植物病理實驗室提供。培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：PDA、PDB。黃瓜(CucumissativusL.)品種為‘亮優(yōu)D18’(天津億聯(lián)特科技發(fā)展有限公司)。藥劑：50%的多菌靈可濕性粉劑(江陰市農(nóng)藥二廠有限公司)、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(天津漢邦植物保護劑有限責(zé)任公司)。

1.2 種子液制備

從活化好的菌株HJG-5平板上打取2個菌餅(d=5 mm)，接種在100 mL PDB培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d、5 d、7 d后得到不同種子培養(yǎng)液[17]，取100 μL涂布在PDA培養(yǎng)基上，測定其活菌數(shù)，挑選培養(yǎng)時間最優(yōu)的種子液進行后續(xù)試驗。用無菌水將菌液活菌數(shù)調(diào)至約為106～107cfu/mL[18]。

1.3 菌株 HJG-5的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的篩選：選取大米粉、玉米粉和小米粉3種基質(zhì)，分別稱取144 g不同基質(zhì)放入500 mL燒杯中于121 ℃滅菌20 min，等量分裝成12小份置于50 mL的滅菌小燒杯中。固體發(fā)酵條件：接種量30%,初始含水量達到50%， pH=7，HJG-5種子液與每份固料充分混合，用封口膜封蓋，每隔12 h 搖晃1次，置28 ℃恒溫培養(yǎng) 7 d，30 ℃烘干后。采用平板菌落計數(shù)法，測定不同處理的菌落生長情況[18]，下同。每個處理設(shè)6次重復(fù)。

1.4 碳、氮源篩選

從“1.3”篩選出的最佳基質(zhì)(大米粉，下同)，分別添加葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、紅糖、乳糖、玉米秸稈、紅薯粉和麥麩等碳源及胰蛋白胨、酵母粉、花生粉、黃豆粉、尿素、硫酸銨、硝酸鉀、氯化銨、綠豆粉和小米粉等氮源。以不加碳氮源的大米粉為對照。依照10∶1的質(zhì)量比把基質(zhì)和各種碳或氮源放置于燒杯中進行混合，121 ℃滅菌20 min，再加入3 mL HJG-5種子液混勻，采用“1.3”方法培養(yǎng)、烘干、稀釋、涂布、測定活菌數(shù)。設(shè)3次重復(fù)。

1.5 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

通過L16(45)正交表，測定初始pH值(7、 7.5、8、8.5)、接種量(1.0、0.8、0.6、0.4 mg/g)、培養(yǎng)時間(120、144、168、192 h)、碳源(麥芽糖200、150、100、50 mg/g)、氮源(胰蛋白胨100、75、50、25 mg/g)5因素4水平，采用“1.3”處理方法培養(yǎng)并測定固態(tài)發(fā)酵物的活菌數(shù)，設(shè)3次重復(fù)。

1.6 助劑篩選

將“1.5”中最佳發(fā)酵配方所得的固體發(fā)酵物在25 ℃鼓風(fēng)機中干燥，研碎備用。將固態(tài)發(fā)酵物分別與12種助劑按質(zhì)量比20∶1分別進行混合，不加助劑為對照。助劑包括：載體(硅藻土、殼聚糖、高嶺土、碳酸鈣)、分散劑(海藻酸鈉、腐植酸鈉、糊精、可溶性淀粉)、紫外保護劑(十二烷基硫酸鈉、吐溫-80、羧甲基纖維素鈉、聚四氟乙烯濃縮分散液)。添加載體和分散劑的處理在28 ℃培養(yǎng)箱室溫下靜置5 d，添加紫外保護劑的處理則在254 nm 紫外燈下距離 40 cm 處照射4 h，在 28 ℃培養(yǎng)箱室溫下靜置5 d。采用“1.3”方法測定添加助劑后的活菌數(shù)。設(shè)3次重復(fù)。

1.7 粉劑及顆粒劑的制備

參考“1.6”測定的結(jié)果，選取殼聚糖、糊精、聚四氟乙烯濃縮分散液3種助劑。采用L9(33)正交試驗測定3種助劑3個水平(100、50、20 mg/g)下的活菌數(shù)。3種助劑分別與HJG-5固態(tài)發(fā)酵物充分混勻，烘干后用小型粉碎機磨成菌粉，在28 ℃培養(yǎng)箱室溫下靜置5 d。采用“1.3”處理方法測定活菌數(shù)。3次重復(fù)。根據(jù)正交試驗結(jié)果選出的最優(yōu)組合，按照其配方將固體發(fā)酵物與3種助劑混勻、烘干、磨碎后制成粉劑。

將10 mg/g的海藻酸鈉以及上述粉劑按質(zhì)量比4∶3進行混合，再滴入0.028 g/mL的氯化鈣，成粒后瀝水，室溫中自然風(fēng)干，制成顆粒劑。

1.8 菌劑對枯萎病的溫室防效

試驗地選擇在天津農(nóng)學(xué)院小棗園。于2019-06-26進行黃瓜催芽試驗，3 d后選擇露白種子種植在花盆中(d=10 cm)。試驗共設(shè)5個處理。于7月7日將粉劑、顆粒劑采用拌土處理，分別與營養(yǎng)土混勻(質(zhì)量比1∶100)；發(fā)酵種子液與營養(yǎng)土混勻(體積與質(zhì)量比為1 mL∶50 g)；用50%的多菌靈可濕性粉劑稀釋500倍液和10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑稀釋1 500倍液進行灌根。另設(shè)清水對照。于7月17日在幼苗的根莖基部用一次性注射器針頭輕微刺傷3處，采用灌根法，分別接種10 mL 1×108cfu/mL的枯萎病菌。每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)為20株。接種7 d、14 d和28 d后，記錄植株發(fā)病情況。按沈萍等[18]方法劃分病情級數(shù)。病情指數(shù)=∑(病級×該病級株數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級)×100；防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指 數(shù)×100%。

1.9 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法做差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HJG-5種子液及固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的篩選

不同培養(yǎng)時間下種子液中的活菌數(shù)呈極顯著差異(P<0.01)。培養(yǎng)7 d時種子液的活菌數(shù)最多，達1.263×107cfu/mL，明顯高于3 d (2.56×103cfu/mL)和5 d(7.18×104cfu/mL)種子液的活菌數(shù)。3種發(fā)酵基質(zhì)對菌株HJG-5產(chǎn)孢量也存在極顯著差異(P<0.01)，活菌數(shù)分別為：大米粉1.665×108cfu/g，小米粉1.467×108cfu/g，玉米粉1.270×108cfu/g。可見，大米粉處理下的活菌數(shù)優(yōu)于小米粉和玉米粉，后續(xù)試驗將菌株 HJG-5固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)選定為大米粉。

2.2 菌株HJG-5碳源和氮源的篩選

不同碳源和氮源均影響菌株 HJG-5的活菌數(shù)(表1)。麥芽糖為碳源時，其活菌數(shù)為 16.27×108cfu/g，顯著優(yōu)于其他碳源，而蔗糖效果最差，活菌數(shù)只有5.8×108cfu/g，甚至低于對照。將麥芽糖選定為最終碳源；在有機氮源中，胰蛋白胨處理組的活菌數(shù)最多，達6.77×109cfu/g，顯著高于其他處理，將胰蛋白胨選定為最終氮源。

表1 不同碳源和氮源下菌株HJG-5的活菌數(shù)Table 1 Colony count of strain HJG-5 under different carbon and nitrogen sources

2.3 菌株HJG-5固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

菌株HJG-5固態(tài)發(fā)酵的正交統(tǒng)計結(jié)果如表2所示。在試驗的 5個不同因素中，根據(jù)直觀分析極差R值和F測驗結(jié)果可知：氮源(胰蛋白胨)(43.50)>初始pH(30.66)>碳源(麥芽糖) (25.84)>培養(yǎng)時間(24.00)>接種量(11.83)。氮源對活菌數(shù)的影響最大，而接種量值影響最小。5個因素主效應(yīng)中，只有接種量的4個水平之間差異不顯著，其他4個因素差異均顯著。處理組合1和組合6的活菌數(shù)最大，但二者之間差異不顯著，組合6的活菌數(shù)極顯著高于其他處理組合，該組合為麥芽糖50 mg/g，胰蛋白胨50 mg/g，接種量0.8 mL/g，培養(yǎng)時間120 h，pH 7.5。直觀分析最佳發(fā)酵條件應(yīng)為：麥芽糖50 mg/g，胰蛋白胨50 mg/g，接種量0.8 mL/g，培養(yǎng)時間120 h，pH 7.0。二者只有pH不同，分別為7.5與7.0，但差異不顯著。因此本試驗采用了組合6作為固態(tài)發(fā)酵條件。

表2 菌株HJG-5固態(tài)發(fā)酵的正交試驗結(jié)果 Table 2 Orthogonal test of solid-state fermentation of strain HJG-5

2.4 助劑的篩選及其優(yōu)化配比

不同助劑對HJG-5原粉活菌數(shù)的影響如表3所示。不同的載體、保護劑、分散劑處理后均會改變原粉的活菌數(shù)。在載體中，高嶺土效果最佳，活菌數(shù)達1.66×1010cfu/g；保護劑中海藻酸鈉效果最佳，活菌數(shù)達1.67×1010cfu/g；分散劑中羧甲基纖維素鈉效果最佳，活菌數(shù)達1.35×1010cfu/g；而原粉對照活菌數(shù)為1.05×1010cfu/g(固態(tài)正交發(fā)酵組合6活菌數(shù)為12.10×109cfu/g)。3種助劑均能極顯著提高原粉的活菌數(shù)(P< 0.01)。選擇這3種助劑開展優(yōu)化配比的正交 試驗。

HJG-5原粉助劑優(yōu)化配比的正交統(tǒng)計結(jié)果如表4所示。根據(jù)直觀分析極差R值和F測驗結(jié)果可知：高嶺土(67.67)>羧甲基纖維素鈉 (21.78)>海藻酸鈉(14.33)，高嶺土(載體)對活菌數(shù)的影響最大，海藻酸鈉(保護劑)最小。直觀分析與多重比較結(jié)果一致，均以組合3為最佳配比，即高嶺土100 mg/g，羧甲基纖維素鈉20 mg/g，羧甲基纖維素鈉20 mg/g，HJG-5粉劑活菌數(shù)達到1.74×1010cfu/g。主效應(yīng)中，高嶺土和羧甲基纖維素鈉的3個水平之間差異顯著，而海藻酸鈉的差異不顯著。采用組合3做為粉劑及顆粒劑制備的助劑配方。

表3 不同助劑下HJG-5原粉活菌數(shù)Table 3 Viable count of GSH-5 raw powder under different adjuvants

表4 助劑優(yōu)化配比的正交試驗Table 4 Orthogonal test of optimum proportion of adjuvant

2.5 不同劑型對黃瓜枯萎病的防治效果

菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果如表5所示。7 d時，HJG-5發(fā)酵液、粉劑、顆粒劑防效均超過60%，均高于多菌靈的58.62%。其中粉劑效果最佳，達68.97%，顯著高于多菌靈的(P<0.05)，但三者防效又均顯著低于苯醚甲環(huán)唑的(P< 0.05)。14 d時，發(fā)酵液的防效下降較明顯，粉劑和顆粒劑的防效仍保持在60%以上，顯著高于發(fā)酵液和多菌靈的(P<0.05)，但仍顯著低于苯醚甲環(huán)唑的(P<0.05)。28 d時，HJG-5發(fā)酵液、粉劑、顆粒劑防效均有所下降，但仍高于多菌靈的，且顆粒劑顯著高于發(fā)酵液的(P<0.05)。在28 d的防治期內(nèi)，苯醚甲環(huán)唑的防效一直在80%以上，而生防菌劑的防效均高于多菌靈的，且總體上粉劑與顆粒劑的防效又高于發(fā)酵液的。

3 討 論

生防菌的菌體存活力是決定其最終防效的因素之一。菌株在培養(yǎng)中所涉及到的營養(yǎng)成分、培養(yǎng)條件決定了菌株產(chǎn)生活性物質(zhì)的種類和產(chǎn)量[12]。本試驗確定了菌株HJG-5的最佳固體發(fā)酵基質(zhì)為大米粉，這與冀媛媛等[11]對放線菌 SC1-1菌劑研制中所得結(jié)果一致。大米粉有利于發(fā)酵基質(zhì)的松散，便于菌體的呼吸，且成本較低，是許多菌株發(fā)酵所選的重要基質(zhì)。但不同的放線菌對淀粉性基質(zhì)的選擇具有多樣化，如王婷婷等[8]認為放線菌WZ60最優(yōu)基質(zhì)是黃豆粉；梁春浩等[12]認為放線菌PY-1最優(yōu)基質(zhì)是玉米粉；王彥等[19]認為放線菌16-3-10最優(yōu)基質(zhì)是小米粉?？傊?，優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可獲得最佳的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益。

表5 HJG-5不同制劑對枯萎病的田間防效Table 5 Field control effect of different agents of HJG-5 against Fusarium wilt

在實際生產(chǎn)過程中，除發(fā)酵條件外仍有眾多因素影響影響生防菌劑的效果，選擇適合的載體和助劑是衡量生物農(nóng)藥最佳配方的首要因素[15]。助劑不僅可以增加生物菌劑的活性或保存期，而且可以加強宿主植物機體的抵抗能力，提高體內(nèi)某些酶的活性，也能夠幫助宿主植物吸收氮、磷、鉀等元素，提高其對環(huán)境的適應(yīng)能力[20]。在本研究的助劑正交試驗中，HJG-5粉劑的活菌數(shù)超過1.74×1010cfu/g，即活菌數(shù)每克超過100億。這與冀媛媛等[11]對放線菌SC1-1粉劑助劑的篩選研究其活菌數(shù)量達到1.72×1010cfu/g的結(jié)果 相近。

菌株HJG-5對黃瓜枯萎病的防效均高于常見藥劑多菌靈，但又顯著低于新型藥劑苯醚甲環(huán)唑。從HJG-5不同劑型的防效上看，發(fā)酵液是低于制劑的，可能是其原本活菌數(shù)較低的緣故。粉劑早期效果好于顆粒劑，但后期顆粒劑效果更好，這與劑型的物理化學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性密切相關(guān)。將生防菌制備成顆粒劑后，由于其形態(tài)較為固定，可以緩慢釋放，持效期長，甚至雨水能夠充當(dāng)其與土壤以及寄主生物相融合反應(yīng)的媒介[15,21]。粉劑與土壤的表面接觸面積更大，但是其因釋放過快，效果不能持久，反而會減緩防病效果。因此，顆粒劑作為一個緩慢釋放生物拮抗菌的劑型，盡管其在初期的效果可能不如粉劑與發(fā)酵液，但由于其持效期長，對所含生防菌的利用度高，且不低于常規(guī)藥劑的防效，因而更適宜用于植物土傳病害的防治，目前顆粒劑已成為代表省力化劑型開發(fā)的新熱點[22-23]。在田間使用菌株HJG-5粉劑和顆粒劑時，建議間隔期不超過14 d，應(yīng)重復(fù)使用，在田間會有更突出和更持久的效果。