苯并噻唑功能化的金屬螯合劑的合成及生物活性

孫 斌 王江淋

(1重慶高校天然藥物研究重點實驗室，重慶 400067)

(2重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種常見的與年齡相關(guān)的老年性疾病，截止到2016年，全球約有4 600萬人患有這種老年性疾病[1]。迄今為止，還沒有真正意義上的治療AD的方法，其診斷的高準(zhǔn)確性來自于對因該病致死患者腦部的尸檢。AD最典型的病理特征是神經(jīng)細(xì)胞外的淀粉樣斑塊(amyloid plaques，AP)和細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)[2]。AP 的主要成分是β-淀粉樣肽(βamyloid peptide，Aβ)[3]。Aβ的主要異形體是分別由 42 和 40 個氨基酸殘基組成的肽 Aβ1～42和Aβ1～40[4-5]。Aβ1～40在大腦中含量較高，但Aβ1～42則具有更大的神經(jīng)毒性、并且更具聚集傾向。根據(jù)Aβ級聯(lián)假說，Aβ的過度產(chǎn)生與積聚會促進(jìn)Aβ寡聚物、原纖維以及最終導(dǎo)致神經(jīng)變性的纖維生成。然而，近期研究顯示，可溶性Aβ寡聚物可能更具神經(jīng)毒性，可能會導(dǎo)致AD患者以及AD動物模型中的觸突功能障礙與記憶喪失[6-9]。在這方面，由于缺乏對各種Aβ聚集形態(tài)的神經(jīng)毒性作用的全面了解，20多年來，基于Aβ級聯(lián)假說研發(fā)的治療AD的藥物都遭到失敗。

在AD患者大腦淀粉樣板塊中，發(fā)現(xiàn)有高濃度的 銅 (394 μmol·L?1)、鋅 (1 055 μmol·L?1)和 鐵 (940μmol·L?1)，研究表明金屬離子能與Aβ相互作用并促使淀粉樣斑塊的形成[10-13]。這些金屬離子不僅加速了Aβ聚集，而且具有氧化?還原活性的金屬(如銅、鐵)還會導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成與氧化應(yīng)激[14-18]。鑒于Aβ與過渡金屬離子的相互作用，一些體外實驗研究發(fā)現(xiàn)金屬螯合劑能降低金屬-介導(dǎo)的Aβ聚集、減少ROS的生成、降低神經(jīng)毒性[19-22]。有幾種螯合劑如去鐵按(desferrioxamine，DFO)、DP-109、氯碘羥喹(clioquinol，CQ)等(圖 1)已被評估在轉(zhuǎn)基因小白鼠試驗中取得成功[23-25]。這些螯合劑除螯合金屬離子外，還能設(shè)計成具有抗氧化性能的自由基清除劑。因此金屬螯合劑療法可能是一種有前途的AD治療策略。盡管像CQ這樣的螯合劑能有效抑制Aβ聚集并改善認(rèn)知，但是CQ不會與Aβ-金屬選擇性地相互作用，會出現(xiàn)副作用，這可能會限制其長期的臨床應(yīng)用。現(xiàn)有的研究表明，對Aβ具有強親和力的配體更能有效地阻止Aβ聚集和抑制Aβ的神經(jīng)毒性。使用多重同時作用來增強靶點結(jié)合親和力及特異性是生物學(xué)中的重要概念且用途廣泛。相比較非特異性螯合劑，能識別Aβ的配體顯示出了更強的阻止纖維狀A(yù)β形成的能力[26-27]。

眾所周知，苯并噻唑經(jīng)適當(dāng)修飾后與β-淀粉樣斑塊有良好的結(jié)合性，是某些β-淀粉樣蛋白的顯像劑的重要組成部分。曲曉剛教授的研究表明，苯并噻唑修飾的螯合劑能有效抑制銅離子誘導(dǎo)的Aβ聚集，并能將聚合的Aβ-Cu加合物中的Cu螯合出來，使聚集的Aβ解聚[28]。因此我們設(shè)計合成了2種苯并噻唑修飾的螯合劑(L1、L2，圖2)，研究了它們抑制金屬離子誘導(dǎo)的Aβ聚集，對其控制Aβ-Cu產(chǎn)生H2O2的量以及緩解Aβ聚集產(chǎn)生的神經(jīng)毒性等生物活性進(jìn)行研究，并與螯合部位結(jié)構(gòu)相同但沒有苯并噻唑功能化的螯合劑(L3)進(jìn)行了對比。

圖1 幾種重要的治療AD的金屬螯合劑Fig.1 Several important chelators for AD therapy

圖2 能識別Aβ的金屬螯合劑的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of metal chelators with function of recognizing Aβ

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

所有試劑都是從試劑公司購買，如未特別指明，使用前所有試劑都未進(jìn)行特別處理。螯合劑L3是已知化合物，由本實驗室按文獻(xiàn)[29]方法自制。反應(yīng)進(jìn)程由薄層層析監(jiān)控，斑點用紫外燈或含有Ce(NH4)2(NO3)6(0.5 g) 和 (NH4)6Mo7O24·4H2O(24.0 g)的6%H2SO4(500 mL)的黃色溶液顯色。反應(yīng)產(chǎn)物的核磁共振氫譜由Varian mercury plus 400 MHz核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo))測定，ESI質(zhì)譜由Q-TOF Ultima API LC-MS液?質(zhì)聯(lián)用儀分析確定。

Aβ儲備液是將 Aβ1～40(人)(2 mg)溶于氫氧化鈉(500 μL，20 mmol·L?1)，經(jīng)超聲處理30 s后，用超純水(1.5 L)稀釋，再超聲處理 30 s后，用 0.1 mol·L?1的鹽酸調(diào)pH值到7.4，用0.22μm的濾器(Millipore)過濾，Aβ儲備液濃度由BCA蛋白試驗測定后置于?20℃下 保 存 。Zn2+和 Cu2+(200 μmol·L?1，以 pH=7.4 的HEPES(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid)緩沖液配制)分別用Aldrich原子吸收標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。螯合劑L1，L2和L3分別溶于DMSO中配成最終濃度為4 mmol·L?1的溶液。實驗所用水均為蒸餾去離子水用超濾膜過濾所得，所用儀器還有TECAN多功能酶標(biāo)儀(瑞典)。

1.2 合成

螯合劑按Scheme 1合成。

3-(苯并[d]噻唑-2-基)-1，2-苯二酚(3a)：2-氨基苯硫酚(1)(2.5 g，20 mmol)與 2，3-二羥基苯甲醛與無水乙醇(40 mL)混合，回流攪拌24 h。冷卻后，有大量固體出現(xiàn)，過濾，濾餅用冷乙醇洗滌2次后，用乙酸乙酯重結(jié)晶得到3a(3.65 g，75%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ9.66(s，br，1 H，OH)，9.44(s，br，1 H，OH)，8.30(d，J=7.8 Hz，1 H)，7.93(d，J=7.8 Hz，1 H)，7.50(d，J=1.6 Hz，1 H)，7.46(d，J=7.8 Hz，1 H)，7.39～7.33(m，2 H)，6.86(d，J=8.2 Hz，1 H)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ168.0，151.1，149.4，146.2，134.5,126.8，125.3，122.7，122.5，119.9，116.6，114.4。ESI-HRMS：C13H9NO2SNa[M+Na]+，理論值266.025 2，實驗值266.026 6。

Scheme 1 Synthesis of the chelators

4-(苯并[d]噻唑-2-基)-1，2-苯二酚(3b)：3b 的合成方法與3a 相同(3.84 g，79%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ11.5(s，br，1 H，OH)，9.67(s，br，1 H，OH)，8.11(d，J=7.8 Hz，1 H)，8.03(d，J=8.2 Hz，1 H)，7.55～7.48(m，2 H)，7.42(t，J=7.8 Hz，1 H)，6.95(dd，J=7.8，1.2 Hz，1 H)，6.81(t，J=8.2 Hz，1 H)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ166.9，151.8，146.7，146.1，134.2，127.0，125.6，122.5，120.0，118.9，118.7，118.3。ESIHRMS：C13H10NO2S[M+H]+，理論值244.043 2，實測值244.044 4。

Boc保護(hù)的2-溴乙胺(5)：2-溴乙胺氫溴酸鹽(4)(8.2 g，40 mmol)溶于干燥的甲醇(40 mL)中，向溶液中加入甲醇鈉(2.16 g，40 mmol)，室溫攪拌30 min后，加入1，4-二氧六環(huán)(120 mL)和二碳酸二叔丁酯(6.96 g，40 mmol)以及三乙胺(4.04 g，40 mmol)?；旌衔镌谑覝叵吕^續(xù)攪拌2 h。濾去溴化鈉，旋干，殘余物溶于二氯甲烷(600 mL),水洗3次。有機相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，旋干，殘余物經(jīng)硅膠柱色譜(VEtOAc∶Vhexane=1∶3)純化后得到5(7.62 g，85%)。

Boc保護(hù)的 2，2′-(3-(苯并[d]噻唑-2-基)-1，2-苯基)二氧乙基二胺(6a)：化合物 3a(2.43 g，10 mmol)與化合物 5(4.28 g，20 mmol)溶于 DMF(40 mL)中，向溶液中加入K2CO3(2.76，20 mmol)與四丁基溴化銨(1.61 g，5 mmol)?；旌衔镌?5℃下攪拌24 h。濾去固體物后，濾液用乙酸乙酯(200 mL)稀釋。用飽和食鹽水洗滌3次，有機相經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，旋干，殘余物經(jīng)硅膠柱色譜(VEtOAc∶Vhexane=1∶3)純化得6a(3.87 g，73%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ8.07(d，J=5.4 Hz，1 H)，8.04(d，J=5.4 Hz，1 H)，7.93(d，J=4.8 Hz，1 H)，7.51(t，J=5.4 Hz，1 H)，7.43(t，J=5.4 Hz，1 H)，7.24～7.14(m，2 H)，7.01(s，br，1 H，NH)，6.92(s，br，1 H，NH)，4.15(t，J=4.0 Hz，2 H)，4.05(t，J=3.6 Hz，2 H)，3.45～3.35(m，4 H)，1.36(s，9 H)，1.33(s，9 H)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ170.7，162.7，156.1，156.0,152.1,146.4,136.0,126.73,126.70，125.7，124.7，123.1,122.2,120.7，116.5，78.2，71.8，68.0，60.2，40.1，28.7。ESI-HRMS：C27H35N3O6SNa[M+Na]+，理論值552.214 4，實驗值 552.216 8。

Boc保護(hù)的 2，2′-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)-1，2-苯基)二氧乙基二胺(6b)：6b的合成方法與6a相同(4.08，77%)。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ8.10(d，J=8.2 Hz，1 H)，7.86(d，J=7.8 Hz，1 H)，7.73(s，1 H)，7.65～7.56(m 1 H)，7.46(t，J=5.4 Hz，1 H)，7.35(t，J=7.6 Hz，1 H)，6.98(d，J=8.2 Hz，1 H)，5.28(s，br，2 H，2 NH)，4.19(t，J=4.6 Hz，2 H)，4.12(t，J=5.2 Hz，2 H)，3.51(s,4 H),1.45(s,18 H)。13C NMR(100 MHz，CDCl3)：δ167.4，146.2，154.1，134.9，132.8，127.6，126.3，125.0,124.8,122.9,122.1,121.5,119.7,94.0,82.4,79.7,69.6,69.1，40.1，28.4。ESI-HRMS：C27H35N3O6SNa[M+Na]+，理論值552.214 4，實驗值552.212 8。

2，2′-(3-(苯并[d]噻唑-2-基)-1，2-苯基)二氧乙基二胺(7a)：化合物 6a(2.65 g，5 mmol)溶于二氯甲烷(15 mL)，冷卻至0℃，在此溫度和攪拌下，滴加濃鹽酸(4.1 mL)，完畢后繼續(xù)攪拌20 min，過濾，濾餅用蒸餾水溶解后，用1 mol·L?1的NaOH溶液調(diào)pH值到9～10。用二氯甲烷萃取該混合物，有機相用飽和食鹽水洗滌3次，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后旋干，得7a(1.45 g，88%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ8.11(d，J=4.8 Hz，1 H)，8.03(d，J=4.8 Hz，1 H)，7.93(d，J=2.8 Hz，1 H)，7.51(t，J=4.8 Hz，1 H)，7.43(t，J=4.8 Hz，1 H)，7.22(s，2 H)，4.12(s，2 H)，4.04(s，2 H)，3.04(s，2 H)，2.98(s，2 H)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ162.2，152.4,152.1，146.7，135.9，126.8，125.7，124.8，123.0，122.4，120.4，116.5，75.3，70.9，55.3，42.0，41.1。ESIHRMS：C17H20N3O2S[M+H]+，理論值 330.127 6，實驗值330.126 0。

2，2′-(4-(苯并[d]噻唑-2-基)-1，2-苯基)二氧乙基二胺(7b)：7b 的合成方法與 7a 相同(1.43 g，87%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ8.06(d，J=7.8 Hz，1 H)，7.99(d，J=7.8 Hz，1 H)，7.64(d，J=1.5 Hz，1 H)，7.57(dd，J=8.2，1.5 Hz，1 H)，7.49(t，J=7.8 Hz，1 H)，7.39(t，J=7.8 Hz，1 H)，7.10(d，J=8.2 Hz，1 H)，4.05～3.95(m，4 H)，2.94～2.85(m，4 H)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ167.6，154.0，151.9，149.2，134.7，127.0，126.2，125.6，122.9，122.6，121.6，114.2，112.2，72.0，71.7，41.4，41.0。ESI-HRMS：C17H20N3O2S[M+H]+，理論值330.127 6，實驗值330.129 0。

N，N′-雙(水楊醛)縮-2，2′-(3-(苯并[d]噻唑-2-基)-1，2-苯基)二氧乙基二胺(L1)：化合物 7a(0.66 g，2 mmol)溶于無水乙醇(10 mL)中，向溶液中加入水楊醛(0.488 g，4 mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2 h，得大量黃色結(jié)晶，過濾，濾餅用冷乙醇洗滌3次，真空干燥得產(chǎn)物 L1(0.91 g，85%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ13.47(s，br，1 H，OH)，13.36(s，br，1 H，OH)，8.67(s，1 H，CH=N)，8.47(s，1 H，CH=N)，7.97(d，J=5.2 Hz，1 H)，7.94(d，J=4.8 Hz，1 H)，7.72(d，J=5.2 Hz，1 H)，7.48～7.43(m，2 H)，7.38～7.27(m，5 H)，7.23～7.19(m，1 H)，6.94～6.87(m，4)，4.39(t，J=3.0 Hz，2 H)，4.33(t，J=3.0 Hz，2 H)，4.03(t，J=3.0 Hz，2 H)，3.87(t，J=3.0 Hz,2 H)。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6):δ167.74,167.70,162.4,161.1,161.0，152.2，146.1，136.8，135.9，132.93,132.85,132.2,129.6,126.7,125.6，123.0，121.9，120.6,119.9,119.1,117.7,117.0,116.9,116.5,72.1,68.6，59.8，58.2。ESI-HRMS：C31H27N3O4SNa[M+Na]+，理論值560.162 0，實驗值560.164 4。

N，N′-雙(水楊醛)縮-2，2′-(3-(苯并[d]噻唑-2-基)-1，2-苯基)二氧乙基二胺(L2)：L2的合成方法與L1相同 (0.85 g，79%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ13.35(s，br，1 H，OH)，13.32(s，br，1 H，OH)，8.52(s，2 H，2 CH=N)，8.03(d，J=7.8 Hz，1 H)，7.98(d，J=7.8 Hz，1 H)，7.64(s，1 H)，7.60～7.55(m，1 H)，7.48(d，J=7.8 Hz，1 H)，7.42～7.34(m，3 H)，7.29(t，J=7.8 Hz，2 H)，7.16～7.09(m，1 H)，6.89～6.81(m，4 H)，4.35～4.24(m，4 H)，3.87(s，4 H)。13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：δ167.8,161.0,154.0,151.6，148.9，134.8，132.1，126.9，126.6,125.6,123.0,122.6，121.9，119.1，119.0，118.96，117.0,114.9,113.2,69.0，68.6，58.0，57.9。ESI-HRMS：C31H27N3O4SNa[M+Na]+，理論值 560.162 0，實驗值560.159 8。

1.3 生物活性測試

1.3.1 Aβ比濁度測定

在 198 μL 的 HEPES 緩 沖 溶 液(50 mmol·L?1HEPES，150 mmol·L?1NaCl，pH=7.4)中 加 入 20μmol·L?1的Aβ1～40和40 μmol·L?1的鋅離子或銅離子，在室溫下反應(yīng)5 min后，加入2μL的L1、L2以及L3的DMSO儲備液，使螯合劑在樣品溶液中的濃度為40 μmol·L?1，DMSO含量1%。在37 ℃條件下孵育24 h，每個樣品溶液分別移至96孔板的一個孔中，樣品溶液的濁度通過405 nm處的吸光度獲得。相同條件下，以Aβ1～40溶液作對照，相同實驗做3組，以計算誤差。

1.3.2 Bicinchoninic acid(BCA)蛋白測定

樣品的配制方法與1.3節(jié)中的相同，但Aβ1～40的濃度為 100 μmol·L?1，金屬離子的濃度與 Aβ1～40相同，每個含有Zn2+(或Cu2+)的樣品準(zhǔn)備12份，樣品溶液在37℃下孵育48 h后，只含Aβ1～40的樣品和從含有Zn2+或Cu2+的樣品中取出3份，在14 000 r·min?1轉(zhuǎn)速下高速離心20 min。取出上層清液用Micro BCA protein Assay Kit測定蛋白濃度。另外剩下的9份Zn2+(或Cu2+)的樣品分成3組，分別加入與金屬等物質(zhì)的量的螯合劑L1和L2以及L3，然后再在37℃并不斷搖動下孵育24 h，樣品在 14 000 r·min?1轉(zhuǎn)速下高速離心20 min。取出上層清液用Micro BCA protein Assay Kit測定蛋白濃度。相同實驗做3組，以計算誤差。

1.3.3 H2O2的測定

H2O2的測定由HRP/Amplex Red實驗完成。將試劑按以下次序加入到96孔板中，使其體積為100μL，樣品溶液中含有 Aβ1～40(0.2 μmol·L?1)和銅離子(0.2或0.4 μmol·L?1)以及螯合劑L1、L2、L3(0.2或0.4μmol·L?1)、抗壞血酸(10 μmol·L?1)，用只含有 Aβ1～40和銅離子的溶液作為對照組。樣品在室溫下孵育30 min后，向每個孔中加入50μL新配制的工作液，其中含有0.1μL的Amplex Red(Sigma-Aldrich)和0.2 U·mL?1的 HRP(Sigma-Aldrich)，繼續(xù)在室溫下孵育30 min，熒光光譜用一臺瑞典生產(chǎn)的TECAN多功能酶標(biāo)儀(λex=530 nm，λem=590 nm)測得。相同實驗做3組，以計算誤差。

1.3.4 MTT實驗分析細(xì)胞毒性

PC12細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%(%)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞毒性檢測時，將對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞接種于12孔板中，孵育過夜后，將實驗分為正常細(xì)胞對照組、Aβ1～40-M2+(Zn2+，Cu2+)組、Aβ1～40-M2+(Zn2+，Cu2+)+不同待測螯合劑(L1，L2，L3)組，按照分組，分別加入不同濃度的待測樣品(20 μmol·L?1)、10 μmol·L?1Aβ1～40和 20μmol·L?1的銅離子繼續(xù)孵育48 h后，加入終濃度為0.5 mg·mL?1的MTT在37 ℃孵育2 h。最后去掉上清液，用DMSO室溫裂解細(xì)胞，溶解甲臜鹽，然后在酶標(biāo)儀570 nm處檢測吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制Aβ聚集

已有的研究表明，金屬離子如Cu2+和Zn2+等都能促進(jìn)Aβ聚集，而金屬螯合劑則能阻止或減弱這種聚集作用[30-31]。本實驗通過Aβ比濁度分析來檢測螯合劑L1和 L2在金屬離子(Zn2+、Cu2+)誘導(dǎo)的 Aβ1～40聚集的干預(yù)作用，結(jié)果見圖3。

圖3結(jié)果顯示，在沒有金屬離子和螯合劑存在下，Aβ1～40聚集很低，在405 nm的吸光度只有0.006，而有螯合劑(L1、L2、L3)存在，沒有金屬離子時，與純的Aβ1～40相比，吸光度稍有變化，但都小于0.009。當(dāng)有Zn2+或Cu2+存在時，樣品溶液的比濁度大幅增加，吸光度分別達(dá)到0.062和0.039，這與文獻(xiàn)報道的在pH=7.4條件下Zn2+比Cu2+更能促進(jìn)Aβ聚集的結(jié)果相符[24]。螯合劑L1和L2雖然不能完全抑制Zn2+或Cu2+誘導(dǎo)的Aβ1～40聚集，但抑制效果非常顯著。L1和L2分別使含鋅的樣品吸光度下降到0.021和0.025；分別使含銅的樣品吸光度下降到0.017和0.020。不含苯并噻唑而螯合部位相同的螯合劑L3雖然也能抑制Aβ1～40聚集，但其效果比L1和L2差。

圖3 抑制Aβ聚集實驗中，螯合劑、Zn2+、Cu2+、Aβ1～40(20 μmol·L?1)在37 ℃、pH 7.4的緩沖溶液中孵育24 h后樣品溶液的比濁度(A405)Fig.3 Turbidity(absorbance at 405 nm)of Aβ1～40(20 μmol·L?1)solutions without or with Zn2+,Cu2+ion in the absence and presence of chelators after incubation at 37℃and pH 7.4 for 24 h

考察螯合劑對Aβ1～40聚集的抑制作用，也可用micro bicinchoninic acid(BCA)蛋白標(biāo)定試劑盒測試法測定樣品溶液上層清液中可溶性的Aβ百分含量來實現(xiàn)。測量可溶性的Aβ百分含量時樣品的配制方法與比濁度分析相同，但可溶的Aβ以及相應(yīng)的金屬離子和螯合劑濃度都是比濁度分析時的5倍。結(jié)果見圖4。

圖4 Zn2+、Cu2+與Aβ1～40(100 μmol·L?1)在37 ℃、pH 7.4下孵育24 h后,再加入螯合劑在相同條件下又共同孵育24 h后,上層清液中Aβ的百分含量Fig.4 Percentage of soluble Aβ1～40after Zn2+,Cu2+and Aβ1～40(100 μmol·L?1)incubated at 37 ℃,pH 7.4 for 24 h,then the mixture with chelator incubated under same conditions for 24 h

在沒有金屬離子存在下，無論樣品中是否含有螯合劑，游離的Aβ百分含量是93%左右，但是在Zn2+或Cu2+存在，沒有螯合劑存在時，其可溶性Aβ百分含量分別下降到18%和46%。當(dāng)Aβ與金屬離子的樣品在37℃下孵育48 h后，再加入螯合劑又共同孵育24 h后，含有所合成的螯合劑L1和L2的樣品上層清液中可溶性Aβ的百分含量顯著增加，L1和L2分別使含鋅離子的上層清液中可溶性Aβ的百分含量上升到55%和43%；分別使含銅離子的上層清液中可溶性Aβ的百分含量上升到74%和66%。而當(dāng)螯合劑是L3時，可溶性Aβ的百分含量也有一定程度增加，但增幅不大，使含鋅或銅離子的上層清液中可溶性Aβ的百分含量分別上升到26%和44%。這可能是含有苯并噻唑的螯合劑能識別Aβ，與Aβ-M加合物相互作用，從而將金屬離子從Aβ-M加合物中螯合出來，促使聚合的Aβ解聚[28]，而L3因不能識別Aβ，不能很好地與Aβ-M加合物相互作用，因此其促使聚合的Aβ解聚的作用并不明顯。

2.2 控制Aβ-Cu的H2O2產(chǎn)物形成

Aβ肽與具有氧化?還原活性的金屬離子(如Cu2+)相互作用會形成活性氧(reactive oxygen species，ROS)(如H2O2)和與Aβ神經(jīng)毒性相聯(lián)系的氧化應(yīng)激[32-33]，因此，從理論上講，具有識別Aβ功能的金屬螯合劑可以控制活性氧的形成。L1和L2對Aβ-Cu2+形成H2O2的影響用HRP/Amplex Red實驗測定。其結(jié)果如圖5所示。

圖5 Amplex Red分析中在Aβ、Cu2+、螯合劑、抗壞血酸鈉存在下產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)過氧化氫的量Fig.5 Normalized amounts of H2O2produced in presence of Aβ,Cu,the chelating agent,and sodium ascorbate,as determined by the Amplex-Red assay

在還原條件下，Cu2+-Aβ與氧氣作用產(chǎn)生H2O2，加入我們合成的螯合劑L1和L2后，能清除絕大部分(80%以上)由Cu2+-Aβ產(chǎn)生的H2O2，這說明螯合劑L1和L2能有效控制Aβ-Cu產(chǎn)生H2O2的量。而不能識別Aβ的螯合部位相同的螯合劑L3雖然也能使H2O2產(chǎn)生量減少，但其作用沒有L1和L2明顯，只能清除40%左右的H2O2。這可能是因為螯合劑L1(或L2)被苯并噻唑功能化后，增強了與Aβ相互作用的能力，從而更易接觸Cu2+-Aβ加合物，將Cu2+從Cu2+-Aβ中螯合出來，從而阻止了H2O2產(chǎn)生。這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果相符[34]。

2.3 抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性

上文的結(jié)果表明，螯合劑L1和L2能有效抑制金屬Zn2+、Cu2+誘導(dǎo)的Aβ聚集，同時具有抗氧化能力，因此，我們進(jìn)一步利用PC12細(xì)胞株——一個常用的神經(jīng)作用細(xì)胞株(來源于一種可移植的鼠嗜鉻細(xì)胞瘤)，來檢測在細(xì)胞水平上，螯合劑L1或L2對Aβ1～40聚集造成的神經(jīng)細(xì)胞活力損傷的保護(hù)作用下由單體到聚合體進(jìn)程變化，結(jié)果見圖6。

圖6 MTT法測定Aβ1～40在金屬離子與螯合劑存在與否時對PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性Fig.6 Neurocytotoxicity of Aβ1～40in the absence or presence of metal ions and chelators toward PC12 cells determined by MTT assay

圖 6 的結(jié)果表明，當(dāng) 10 μmol·L?1的 Aβ1～40與 20μmol·L?1的Zn2+作用PC12細(xì)胞48 h后，PC12細(xì)胞存活率下降到 44%；而 10 μmol·L?1的 Aβ1～40與 20μmol·L?1的Cu2+作用PC12細(xì)胞48 h后，PC12細(xì)胞存活率下降到37%。當(dāng)10 μmol·L?1的Aβ1～40、20 μmol·L?1的 Zn2+與 20 μmol·L?1的螯合劑 L1 或 L2 作用PC12細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率分別為71%和63%；20 μmol·L?1的螯合劑 L1 或 L2 與 10 μmol·L?1的Aβ1～40、20 μmol·L?1的Cu2+作用PC12細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率分別提升到80%與70%。螯合劑L3也具有抑制Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的作用，但效果比螯合劑L1 和 L2 差，當(dāng) 10 μmol·L?1的 Aβ1～40、20 μmol·L?1的Zn2+或20 μmol·L?1的Cu2+與20 μmol·L?1的螯合劑L3作用PC12細(xì)胞48 h后，細(xì)胞存活率分別提升到50%和54%。實驗結(jié)果表明，相比較單一功能螯合劑，苯并噻唑功能化的螯合劑L1和L2更能抑制Aβ1～40聚集介導(dǎo)的神經(jīng)毒性并提高細(xì)胞存活率。

3 結(jié) 論

合成了2種未見文獻(xiàn)報道的苯并噻唑功能化的金屬螯合劑L1和L2。通過比濁度分析、BCA蛋白測定考察了這2種螯合劑抑制金屬Zn2+與Cu2+誘導(dǎo)的 Aβ1～40聚集的性能；通過HRP/Amplex Red實驗測定了它們控制Cu-Aβ加合物產(chǎn)生H2O2的量；通過MTT實驗檢測其存在與否對金屬離子誘導(dǎo)的Aβ1～40聚集對PC12細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞毒性的影響，并與非苯并噻唑功能化的螯合部位相同的螯合劑進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)這2種螯合劑都能有效抑制Zn2+與Cu2+誘導(dǎo)的Aβ1～40聚集；大幅減少Cu-Aβ加合物產(chǎn)生H2O2的量；有效抑制Zn2+、Cu2+誘導(dǎo)Aβ聚集而產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞毒性并大幅提高細(xì)胞存活率。作為對比，非苯并噻唑功能化但螯合部位相同的螯合劑雖然在相同條件下也有作用，但其活性遠(yuǎn)低于苯并噻唑功能化的金屬螯合劑。這一研究表明，對照單一功能的金屬螯合劑，苯并噻唑功能化的金屬螯合劑更有可能成為治療AD的藥物。

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