葡萄酒中組胺含量檢測(cè)不確定度評(píng)定

肖 超，陳大鵬，彭小東

（貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州貴陽 550014）

葡萄酒，是一種將葡萄汁加以發(fā)酵后所得的、含酒精的堿性飲料。有研究表明，葡萄酒中含有很多對(duì)人體有益的多酚類物質(zhì)。例如葡萄酒中所含的白藜蘆醇具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗過敏、抗血栓、抗高血脂、消炎、掃除自由基等多種藥理活性[1]，所以適量飲用葡萄酒有益身體健康。但在葡萄酒發(fā)酵過程中，細(xì)菌代謝過程會(huì)產(chǎn)生一定量的生物胺。組胺是生物胺中毒性最強(qiáng)的一種[2]。攝入一定量的組胺會(huì)引起中毒，從而引起頭暈、心悸、血壓下降、口腔麻木、吞咽困難等反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)生命危險(xiǎn)[3]。近年來，葡萄酒酒中的組胺也越來越受到人們的關(guān)注，因此準(zhǔn)確測(cè)量葡萄酒中組胺的含量，將為相關(guān)監(jiān)管部門規(guī)范市場(chǎng)行為，保障廣大消費(fèi)者生命財(cái)產(chǎn)安全提供依據(jù)。

測(cè)量不確定度是與測(cè)量結(jié)果關(guān)聯(lián)的一個(gè)參數(shù)，是評(píng)定測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的重要指標(biāo)。在日常檢測(cè)工作中，檢測(cè)結(jié)果往往帶有誤差，因此需要用不確定度來對(duì)檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。不確定度越小，檢測(cè)結(jié)果越可靠。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果處于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求的臨界值，有可能判定被檢測(cè)產(chǎn)品不合格時(shí)，也應(yīng)給出測(cè)量不確定度。

本文根據(jù)GB 5009.208—2016，采用液相色譜法檢測(cè)葡萄酒中組胺的含量。參照CNAS-GL06《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》和JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，采用GUM 法對(duì)液相色譜法檢測(cè)葡萄酒中組胺檢測(cè)擴(kuò)展不確定度進(jìn)行評(píng)定，并建立不確定度來源因果圖，找出影響檢測(cè)不確定度的主要因素，并進(jìn)行有效控制，有效提高葡萄酒中組胺含量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：葡萄酒。

試劑：乙腈(色譜純）、丙酮(色譜純)、乙醚(重蒸)、甲醇(色譜純)、谷氨酸鈉(分析純)、碳酸氫鈉(分析純)、氯化鈉(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、鹽酸(37%)、丹磺酰氯。

儀器：高效液相色譜儀(型號(hào)：U3000，廠家：美國賽默飛世爾公司)，檢測(cè)器(二極管陣列檢測(cè)器(DAD))，電子天平(型號(hào)：ME204E/02，廠家：梅特勒-托利多，精度：0.0001 g)，離心機(jī)(型號(hào)：Allegra X-22R，廠家：美國貝克曼庫爾特公司)，電熱恒溫水浴鍋(型號(hào)：DK-98-II 單列兩孔，廠家：天津市泰斯特儀器有限公司)，氮吹儀(型號(hào)：TufboVap LV，廠家：BIOTAGE)，數(shù)顯型混勻儀(型號(hào)：MS 3 D S025，廠家：IKA)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制

1.2.1 內(nèi)標(biāo)(1，7-二氨基庚烷)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制

準(zhǔn)確移取1，7-二氨基庚烷標(biāo)準(zhǔn)品0.1000 g，置于燒杯中，用0.1 mol/L 鹽酸溶液溶解后轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，配制成濃度為10 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液逐級(jí)稀釋為200 mg/L內(nèi)標(biāo)使用液。

1.2.2 組胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制

準(zhǔn)確稱取組胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于小燒杯中，用0.1 mol/L 鹽酸溶液溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，用0.1 mol/L 鹽酸溶液定容，配制成濃度為1000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。吸取1.0 mL組胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，配制成組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液(100 mg/L)。用0.1 mol/L 鹽酸溶液逐級(jí)稀釋配成組胺濃度分別為2 μg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試樣前處理

準(zhǔn)確移取1.0 mL樣品于塑料離心管中，依次加入200 μL 1,7-二氨基庚烷(200 mg/L)，1 mL 飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL濃度為1 mol/L氫氧化鈉溶液、1 mL 濃度為10 mg/mL 的丹磺酰氯溶液，渦旋混勻1 min，放入60 ℃恒溫水浴中進(jìn)行衍生，15 min后取出，加入濃度為50 mg/mL谷氨酸鈉溶液100 μL，振蕩混勻，放入60 ℃恒溫水浴中反應(yīng)15 min，取出冷卻至室溫，分別加入1 mL 超純水，渦旋混勻，40 ℃水浴下氮吹除去約1 mL 丙酮，加入0.5 g 氯化鈉，渦旋振蕩至完全溶解，加入5 mL 乙醚，渦旋振蕩2 min，靜置分層后，吸出乙醚(上層)，再次萃取，合并萃取液，40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL 乙腈渦旋振蕩使殘留物完全溶解，過有機(jī)濾膜，收集濾液于進(jìn)樣小瓶中，上機(jī)測(cè)定。

分別移取1.0 mL 組胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，置于10 mL 具塞試管中，依次加入100 μL 內(nèi)標(biāo)使用液(200 mg/L)，同試樣一起進(jìn)行衍生。

1.3.2 色譜條件

檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。

色譜柱：C18柱，4.6×250 mm，5 μm，柱溫：35 ℃。

流動(dòng)相：甲醇+水（梯度洗脫，見表1），流速：1.0 mL/min。

表1 梯度洗脫程序表

進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將上述組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生液分別上機(jī)檢測(cè)，以保留時(shí)間定性；以組胺的濃度為橫坐標(biāo)，以組胺的峰面積與1,7-二氨基庚烷的峰面積的比值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

1.5 樣品檢測(cè)

將試樣的衍生溶液上機(jī)檢測(cè)分析，測(cè)得組胺和1,7-二氨基庚烷的峰面積，以保留時(shí)間定性。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合線性方程，得到待測(cè)液中組胺的含量。

2 數(shù)學(xué)模型的建立和不確定度來源分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)GB 5009.208—2016，組胺檢測(cè)結(jié)果計(jì)算公式如下：

式中：X——樣品中組胺的含量（mg/L）；

c——待測(cè)溶液中組胺的濃度（μg/mL）；

υ——待測(cè)溶液的體積（mL）；

f——稀釋倍數(shù)，f=1；

V——試樣的體積（mL）。

2.2 不確定度來源

根據(jù)組胺檢測(cè)過程和計(jì)算公式，不確定度主要來源如圖3所示。

3 不確定度評(píng)定

3.1 檢測(cè)結(jié)果重復(fù)性引起的不確定度

將葡萄酒樣品在重復(fù)性條件下重復(fù)檢測(cè)10次，檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)的測(cè)量值

根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算出10 次檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差S（x）。

所以由檢測(cè)重復(fù)性引起的相對(duì)不確定度：

3.2 回收率引起的不確定度

按標(biāo)準(zhǔn)要求分別移取10 個(gè)平行樣，進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)量為40 mg/L。按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行處理和檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)回收率，檢測(cè)結(jié)果見表3。樣品按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行處理，平行測(cè)定2 次，得到樣品本底值為：7.61 mg/L、7.62 mg/L，平均值為7.615 mg/L。

通過以上數(shù)據(jù)，可計(jì)算出平均回收率R=93.56%，回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差SR=2.09%，則回收率引起的相對(duì)不確定度為：。

通過t 值檢驗(yàn)判斷回收率R 與1 是否有顯著差異。當(dāng)置信概率P=95%，自由度為5，通過查表得到tcrit,5=2.26，t 值按公式計(jì)算9.76。t＞tcrit，回收率R 與1 有顯著差異，應(yīng)該考慮回收率引起的不確定度。

表3 加標(biāo)回收檢測(cè)結(jié)果

3.3 校準(zhǔn)曲線引起的不確定度

將處理好的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)檢測(cè)，得到組胺峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積（見表4）。通過擬合得到線性曲線方程y=0.048x-0.0121，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。樣品平行測(cè)定2 次值為：7.61 mg/L、7.62 mg/L，平均值為7.615 mg/L。

表4 標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)峰面積

根據(jù)最小二乘法擬合，所以標(biāo)準(zhǔn)曲線引起的不確定度根據(jù)下列公式計(jì)算。

U(curve)=，式中SR為回歸曲線的剩余殘差，；a 為擬合曲線的斜率；p 為待測(cè)樣品重復(fù)檢測(cè)次數(shù)；n 為擬合曲線的點(diǎn)數(shù)；yi為各組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值；y0為各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度帶入回歸方程得到的組胺和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值；Cstj為各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值；C 為待測(cè)樣品濃度平均值。

帶入值計(jì)算，得到由回歸曲線引起的不確定度Ucurve=1.1×10-3，相對(duì)不確定度10-4。

3.4 樣品前處理引起的不確定度

在樣品前處理和衍生過程中使用1000 μL 移液槍14 次，200 μL 移液槍2 次，100 μ移液槍5 次。根據(jù)移液槍校準(zhǔn)證書顯示，1000 μL 移液槍容量為1000 μL 時(shí)，相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel=0.1 %，k=2；200 μL 移液槍容量為200 μL 時(shí)，相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel=0.3 %，k=2；100 μ移液槍容量為100 μL 時(shí)，相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel=0.4%，k=2。由樣品前處理引入相對(duì)不確定度：

3.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引起的不確定度

（1）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)組胺鹽酸鹽(C14213050)證書顯示，組胺鹽酸鹽濃度為99.57%，其相對(duì)擴(kuò)展不確定度為1.06 %，包含因子K=2，則引起的不確定度為：。

（2）1,7-二氨基庚烷(21744)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書顯示，其濃度為99.5 %，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為2.0 %，包含因子K=2，則引起的相對(duì)不確定度為：Urel(內(nèi)標(biāo))=。

3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程引起的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)曲線配制過程中不確定度主要來源于分析天平、玻璃量具和室溫。本實(shí)驗(yàn)室配備有中央空調(diào)，溫度控制在20 ℃±5 ℃條件。

（1）天平引起的不確定度

根據(jù)檢定證書，電子天平的示值誤差為1 mg，按照矩形分布處理，，則其引起的不確定度。稱取組胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1656 g，所以相對(duì)不確定度為10-4。稱取1,7-二氨基庚烷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1000 g，所以相對(duì)不確定度。天平引起的合成相對(duì)不確定度為：6.8×10-4。

（2）玻璃量具引起的不確定度

在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液過程中，用到10 個(gè)A 級(jí)10 mL容量瓶、7支A級(jí)1 mL單標(biāo)線吸量管和1支A級(jí)2 mL單標(biāo)線吸量管。JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》中規(guī)定，A 級(jí)10 mL 容量瓶最大允許誤差為±0.020 mL，A 級(jí)1 mL 單標(biāo)線吸量管大允許誤差為±0.007 mL，A 級(jí)2 mL 單標(biāo)線吸量管大允許誤差為±0.010 mL。按三角形分布處理，取包含因子k=，根據(jù)公式可計(jì)算出容量瓶引起的相對(duì)不確定度Urel(V1)=8.2×10-4、1 mL 單標(biāo)線吸量管引起的相對(duì)不確定度Urel(V2)=2.9×10-3、2 mL 單標(biāo)線吸量管引起的相對(duì)不確定度Urel(V3)=2.04×10-3。由玻璃量具引起的合成相對(duì)不確定度：

（3）溫度引起的不確定度

查閱JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》，得知水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，玻璃的膨脹系數(shù)為2.5×10-5/℃。玻璃儀器檢定是在室溫為20 ℃環(huán)境條件下進(jìn)行的，而本實(shí)驗(yàn)是在20 ℃±5 ℃條件下進(jìn)行的，按矩形分布計(jì)算，取，所以10 mL A 級(jí)容量瓶由溫度變化引起的相對(duì)不確定度：；

由溫度引起的合成相對(duì)不確定度：

由配標(biāo)過程引起的相對(duì)不確定度：

3.7 液相色譜儀引起的不確定度

根據(jù)液相色譜儀檢定證書顯示，液相色譜儀的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3 %，所以設(shè)備引起的相對(duì)不確定度為：。

3.8 擴(kuò)展不確定度

綜上所述，各相對(duì)不確定度分量如表5所示。

葡萄酒中組胺檢測(cè)合成相對(duì)不確定度為：Urel=。

當(dāng)葡萄酒中組胺含量為7.615 mg/L 時(shí)，合成不確定度U=Urel×c=0.13 mg/L。取置信概率P=95 %，則k=2，計(jì)算擴(kuò)展不確定度Uk=U×k=0.26 mg/L，所以該葡萄酒樣品中組胺含量為（7.615±0.26）mg/L，k=2。

4 結(jié)論

在葡萄酒中組胺檢測(cè)過程中，對(duì)檢測(cè)結(jié)果不確定度影響最大的是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)賦值，其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度。樣品前處理、加標(biāo)回收率以及儀器重復(fù)性等對(duì)檢測(cè)不確定度的影響也是不可忽略的。因此在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)選購中，一定要從正規(guī)渠道購買有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；在檢測(cè)工作中，一定要嚴(yán)格按照國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，注意操作的規(guī)范性，定期對(duì)設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)和檢定，選用級(jí)別更高的檢定合格的計(jì)量器具，以減少不確定度，保證葡萄酒中組胺含量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。