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    窖泥中高產己酸功能菌的分離篩選及代謝功能的研究

    2020-07-20 08:45:14楊玉珍任國軍
    釀酒科技 2020年6期
    關鍵詞:三角瓶己酸丁酸

    張 敏,郭 敬,楊玉珍,李 擎,任國軍

    (內蒙古河套酒業(yè)集團股份有限公司技術中心,內蒙古巴彥淖爾 015400)

    窖泥是濃香型白酒釀造的基礎,是釀酒功能菌繁衍棲息的場所[1]。濃香型酒功能菌區(qū)系是一個復雜的微生物群體?,F(xiàn)代科學技術的發(fā)展揭示窖泥微生物的主體功能菌——厭氧梭狀芽孢桿菌,棲息于窖內,它們根據自身特點,吸收糟醅體系中的營養(yǎng)物質,生長繁殖并進行新陳代謝,使簡單的物質進行復雜的生化合成[2]。尤其以己酸功能菌為主的微生物生長繁殖、代謝、相互協(xié)調,形成了以己酸乙酯為主體香的濃香型白酒的典型風格[3]。

    本試驗目的在于找到濃香型白酒窖泥中高產己酸的功能菌株,并對其進行代謝功能的研究,以提高窖泥的生香功能及濃香型白酒中己酸乙酯的含量。本試驗對于穩(wěn)定公司窖泥質量具有重要意義,為濃香型白酒生產提供扎實的理論依據,同時善改良酒質提供微生物資源。

    試驗研究主要分為兩個方面:一是從本廠原酒車間老窖泥(窖底泥、窖壁泥)進行富集培養(yǎng)、分離、篩選、復配試驗,篩選到健壯、活力強、高產己酸的菌種。二是對篩選得到的菌種進行產酸性能研究、代謝產物生化性能鑒定以及菌種穩(wěn)定性試驗,優(yōu)選得到適合本地區(qū)土壤、水質、氣候環(huán)境的優(yōu)良菌種,運用于窖泥車間和原酒車間。

    1 材料與方法

    1.1 材料、儀器

    1.1.1 樣品來源

    從本廠原酒車間8 個濃香型大曲酒發(fā)酵池中分別取窖底泥和窖壁泥。

    1.1.2 儀器設備

    島津GC-8A 氣相色譜儀、強極性定制填充柱(1/8′×2M)、生物安全柜、干燥箱、恒溫培養(yǎng)箱、立式高壓滅菌鍋、電子分析天平、顯微鏡、YQX 型厭氧培養(yǎng)箱、酸度計、恒溫水浴鍋等。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    (1)富集及培養(yǎng)用培養(yǎng)基:乙酸鈉0.5 %,硫酸銨0.05%,磷酸氫二鉀0.04%,硫酸鎂0.02%,酵母浸粉0.4%,無水乙醇2%,碳酸鈣1%(無水乙醇和碳酸鈣接種時加入),pH值自然。

    (2)分離培養(yǎng)基(固體巴氏培養(yǎng)基):乙酸鈉0.5 %,硫酸銨0.05 %,磷酸氫二鉀0.04 %,硫酸鎂0.02 %,酵母浸粉0.4 %,瓊脂2 %,無水乙醇2 %(滅菌后使用前加入),pH值自然。

    以上培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 高產己酸功能菌的分離純化

    1.2.1.1 富集培養(yǎng)(菌種熱處理)

    高產己酸功能菌的分離基質為車間窖底泥和窖壁泥;取不同班組不同窖齡窖壁泥和窖底泥(選取感官較好,酒樣己酸乙酯含量較高的窖泥),各稱取窖泥33 g,放入裝有少量液體巴氏培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,采用水浴鍋熱處理的方法,在85 ℃水浴鍋中熱處理6~8 min,冷卻至30~40 ℃,在無菌條件下繼續(xù)添加液體巴氏培養(yǎng)基至三角瓶口部,再加2~3滴無水乙醇封口,34 ℃兼性厭氧培養(yǎng)10~15 d(產氣結束)。然后,挑選出產氣較早、較多的三角瓶,放入85 ℃水浴鍋中熱處理6~8 min(己酸菌孢子具有耐熱性,采用熱處理可殺死雜菌及己酸菌繁殖體,純化菌種,同時激活己酸菌種,促進其迅速繁殖,從而得到純化菌種的目的),冷卻后以15 %的接種量接種于事先備好的裝有新鮮液體巴氏培養(yǎng)基的三角瓶中,添滿三角瓶,并封口,34 ℃兼性厭氧培養(yǎng)7~10 d,按此方法連續(xù)傳代3次。

    1.2.1.2 初篩(平板分離)

    根據培養(yǎng)液的檢測結果,選取己酸含量較高的富集培養(yǎng)液進行平板分離。選用常規(guī)梯度稀釋、平板傾注分離的方法以及產酸菌分離方法(透明圈法和變色圈法)。常規(guī)梯度稀釋、平板傾注分離的方法:將選取的富集培養(yǎng)液進行10 倍梯度稀釋,從合適稀釋度(10-3~10-8)的稀釋液中分別吸取0.5 mL加入空皿中,每一稀釋度做2 個平皿,放于厭氧包和厭氧盒中,于34 ℃嚴格厭氧培養(yǎng)5~7 d。

    1.2.1.3 復篩(試管和三角瓶液體培養(yǎng))

    觀察平板分離得到的單菌落,并挑選出生長良好的單菌落,按不同菌落形態(tài),將選取的單菌落挑到盛有8 mL 已滅菌的液體培養(yǎng)基試管中,34 ℃恒溫兼性厭氧培養(yǎng)或嚴格厭氧培養(yǎng)7~10 d。觀察產氣情況,選取產氣較早、較多的試管轉接于盛有30 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基試管中,34 ℃恒溫兼性厭氧培養(yǎng)7~10 d,然后對其發(fā)酵液進行理化指標的檢測及分析,選取產己酸能力較高的菌株。將產己酸能力高的菌株傳代轉接于100 mL三角瓶及500 mL三角瓶,觀察其發(fā)酵情況、菌種生長情況及檢測其他指標。將產己酸菌較高的培養(yǎng)液制片,顯微鏡觀察菌種的生長情況及特點,并傳代觀察其穩(wěn)定性。選取初篩菌株進行己酸含量、代謝產物的測定,篩選到健壯、活力強、高產己酸的功能菌種。

    1.2.2 代謝產物分析方法

    1.2.2.1 硫酸銅顯色法(定量)

    吸取4 mL 培養(yǎng)液于試管中,再加入4 mL 的2 %硫酸銅和2 mL 無水乙醚,混勻后靜置分層,如果乙醚層呈現(xiàn)藍色則說明有己酸產生。

    1.2.2.2 氣相色譜法(定量定性)

    樣品處理:取發(fā)酵培養(yǎng)液1 mL 加入0.1 mL 鹽酸酸化后,振蕩器振搖,然后用50%的乙醇溶液定容至10 mL,振蕩器振搖后吸取上清液,用0.2 μm濾膜過濾,上氣相色譜檢測乙酸、丙酸、丁酸和己酸。

    氣相色譜儀條件為:總壓力4.0 kg/cm2,色譜柱壓力:1.0 kg/cm2,進樣口溫度:190 ℃,檢測器溫度:190 ℃,柱箱溫度:170 ℃,空氣壓力0.5 kg/cm2,氫氣壓力0.8 kg/cm2。進樣量1.0 μL。

    采用外標法,配制200 mg/100 mL 乙酸、丙酸、丁酸和己酸混標,配制成10 mL,用50 %乙醇溶液定容,待用。

    1.2.3 微生物計數(shù)方法

    采用血球計數(shù)板法計數(shù)以及觀察菌種生長情況。

    1.2.4 高產己酸功能菌培養(yǎng)條件優(yōu)化及產酸特性的研究

    1.2.4.1 培養(yǎng)溫度對高產己酸功能菌的影響

    培養(yǎng)基初始pH6.93,按15 %的接種量接入高產己酸功能菌種子液,用250 mL 三角瓶兼性厭氧培養(yǎng),在不同的溫度(28 ℃、30 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃和40 ℃)條件下分別培養(yǎng)8 d、16 d 和33 d 取樣,測定代謝產物,研究不同溫度對高產己酸功能菌產酸能力的影響,同時在培養(yǎng)33 d 時檢測最終pH值。

    1.2.4.2 初始pH值對高產己酸功能菌的影響

    使用鹽酸和氫氧化鈉調整培養(yǎng)液的初始pH值,分別調pH 值至3.35、4.07、4.53、5.05、5.57、6.00、6.53、6.93、7.49、7.95 和8.47,接種后置于34 ℃培養(yǎng)箱中兼性厭氧培養(yǎng),不同的pH 值下分別培養(yǎng)8 d、16 d 和33 d 取樣,測定代謝產物,研究不同初始pH值對高產己酸功能菌產酸能力的影響。

    1.2.4.3 兼性厭氧與嚴格厭氧對高產己酸功能菌的影響

    采用100 mL 三角瓶,三角瓶液體裝滿,15%接種量接入高產己酸功能菌種子液,分別置于普通培養(yǎng)箱兼性厭氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)箱中嚴格厭氧培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為34 ℃。每天跟蹤檢測代謝產物,跟蹤到7 d,研究不同空氣接觸對己酸菌產酸能力的影響,并找出高產己酸功能菌在不同的培養(yǎng)條件下的代謝特點。

    1.2.5 高產己酸功能菌在原酒車間應用試驗

    原酒車間對高產己酸功能菌的應用試驗,主要采用淋窖的方法,發(fā)酵結束后取楂甲酒樣和翻甲酒樣,并與對照組不加高產己酸功能菌進行淋窖對比。

    2 結果與分析

    2.1 高產己酸功能菌的分離篩選結果

    本研究經過富集培養(yǎng)、初篩和復篩,利用硫酸銅顯色法初步檢測己酸含量,篩到1 株穩(wěn)定高產己酸的功能菌,命名為HJ31#,對HJ31#菌株產己酸量用氣相色譜法進行檢測,結果見表1。由表1 可知,HJ31#菌株的產己酸量為1394 mg/100 mL、1340 mg/100 mL、1266 mg/100 mL、1040 mg/100 mL和1262 mg/100 mL,平均值為1260 mg/100 mL。

    表1 HJ31#菌株產己酸量的檢測

    2.2 高產己酸功能菌HJ31#的菌落形態(tài)

    高產己酸功能菌HJ31#分離基質——老窖泥感官評定為:黃褐色,有老窖泥氣味和酯香酒香,無其他異雜味,香味較持久。經過菌落形態(tài)及革蘭氏染色觀察,HJ31#菌株革蘭氏染色觀察多數(shù)屬革蘭氏陰性菌,鏡檢初步確定己酸菌的菌體活躍健壯,營養(yǎng)細胞呈桿狀,芽孢囊膨大,呈梭狀。菌落呈黃色圓形,邊緣規(guī)則,扁平。

    2.3 高產己酸功能菌HJ31#培養(yǎng)條件及產酸特性研究結果

    通過對高產己酸功能菌HJ31#不同培養(yǎng)溫度不同時間、不同初始pH 值不同時間、兼性厭氧與嚴格厭氧不同培養(yǎng)時間條件進行優(yōu)化,經氣相色譜法檢測4 種酸類物質含量的變化,從而分析高產己酸功能菌HJ31#代謝產物變化規(guī)律。

    2.3.1 培養(yǎng)溫度對HJ31#菌種的影響

    HJ31#菌種不同培養(yǎng)溫度8 d、16 d 和33 d 分別取樣跟蹤檢測代謝產物,同時檢測不同培養(yǎng)溫度對HJ31#菌種最終pH 值的影響,檢測結果見圖1—圖4。

    從以上檢測HJ31#菌種不同培養(yǎng)溫度、不同時間代謝產物結果看:①HJ31#菌種在培養(yǎng)8 d 時,36 ℃培養(yǎng)己酸含量最高,在培養(yǎng)16 d 時,34 ℃培養(yǎng)己酸含量最高,培養(yǎng)33 d 時,36 ℃培養(yǎng)己酸含量最高,由此可知,HJ31#菌種最佳培養(yǎng)溫度為34~36 ℃,在此溫度條件下,HJ31#菌種活性最大,有最高的產己酸能力;②乙酸和丁酸含量在溫度條件不合適的情況下,對產己酸有一定的影響,乙酸和丁酸在轉化己酸時不夠徹底,丙酸含量較低,不做分析;③在不同溫度下,HJ31#菌種隨著培養(yǎng)時間的延長,己酸含量也略有上升。HJ31#菌種在不同溫度培養(yǎng)下,33 d 時檢測pH 值,沒有很大變化,都在6.0以上。

    2.3.2 初始pH值對HJ31#菌種的影響

    HJ31#菌種不同初始pH 值培養(yǎng)8 d、16 d 和33 d分別取樣跟蹤檢測代謝產物,檢測結果見圖5—圖7。

    從以上檢測HJ31#菌種不同初始pH 值、不同培養(yǎng)時間代謝產物結果看:①HJ31#菌種在培養(yǎng)8 d,初始pH 值在6.00 時,己酸含量最高,培養(yǎng)16 d,初始pH 值在7.95 時,己酸含量最高,培養(yǎng)33 d,初始pH 值在6.93 時,己酸含量最高,由此可知,HJ31#菌種最佳初始pH 值為6.00~7.95,在此初始pH 值條件下,HJ31#菌種活性最大,有最高的產己酸能力;②乙酸含量和丁酸含量在培養(yǎng)8 d 時,如果初始pH值不適宜,轉化己酸的能力就差。隨著時間的延長,乙酸和丁酸向己酸轉化會越來越徹底,但是不如初始pH 值范圍內轉化己酸能力強。丙酸含量較低,不做分析。

    對高產己酸功能菌的產酸特性進行研究發(fā)現(xiàn),HJ31#菌種的最佳培養(yǎng)溫度為34~36 ℃,最佳初始pH 值為6.00~7.95。該菌株在此溫度和初始pH 值條件下,菌種活性最大,有最高的產己酸能力。

    2.3.3 兼性厭氧與嚴格厭氧對HJ31#菌種的影響

    HJ31#菌種兼性厭氧與嚴格厭氧培養(yǎng)代謝產物1~7 d跟蹤檢測數(shù)據,見圖8、圖9。

    從圖8 跟蹤檢測HJ31#菌種兼性厭氧培養(yǎng)7 d代謝產物結果分析:乙酸呈先升高后降低的趨勢。丁酸呈先降低,隨后升高,最后降低的趨勢,最高值出現(xiàn)在第4 天,為135 mg/100 mL。己酸在前4 天緩慢上升,到第5 天時急劇上升,第7 天時達到最高,為989 mg/100 mL。因丙酸含量較低,不做分析。

    從圖9 跟蹤檢測HJ31#菌種嚴格厭氧培養(yǎng)7 d代謝產物結果分析:乙酸呈先升高后降低的趨勢。丁酸呈先降低,隨后升高,最后降低的趨勢,最高值出現(xiàn)在第3 天為144 mg/100 mL。己酸在前3 天緩慢上升,到第4 天時急劇上升,第6 天時達到最高,為1269 mg/100 mL。丙酸含量較低,不做分析。

    分析不同氧氣接觸水平對HJ31#菌種的影響:HJ 31#菌種兼性厭氧和嚴格厭氧培養(yǎng)乙酸和丁酸變化趨勢一致,己酸在嚴格厭氧條件下第4 天時急劇上升,比兼性厭氧培養(yǎng)大量生成己酸要提前1 天,而且在嚴格厭氧條件下,己酸含量比兼性厭氧條件高,最高為1269 mg/100 mL。己酸量與菌種生長旺盛程度成正比。

    同時跟蹤檢測HJ31#菌種的pH 值,當pH 值在6.0~7.0 之間時,HJ31#菌種的產己酸量均達到1000 mg/100 mL 以上,鏡檢菌種總菌數(shù)較多,健壯中桿菌多,活力較好。

    2.4 高產己酸功能菌HJ31#原酒車間應用結果

    原酒車間對HJ31#菌種的應用試驗,采用淋窖的方法,結果見圖10。

    分析:從楂甲和翻甲酒樣檢測指標看,使用HJ31#菌種淋窖后,對產己酸乙酯量有所提升,但是效果不顯著。

    3 結論

    通過多次對原酒車間老窖泥菌種進行分離篩選,從窖底泥中篩選得到菌體健壯、活力較好、己酸產量高、復合香氣濃郁,遺傳性狀較穩(wěn)定的菌株。革蘭氏染色觀察分離篩選得到的菌,多數(shù)屬革蘭氏陰性菌,并將其命名為HJ31#。

    通過對產酸特性的研究,窖泥分離篩選高產己酸功能菌HJ31#菌株的最佳培養(yǎng)溫度為34~36 ℃,最佳初始pH 值為6.00~7.95。HJ31#菌株兼氧、厭氧培養(yǎng)對菌種在代謝產物轉化方面會存在一定的影響,在兼氧、厭氧培養(yǎng)時,乙酸、丁酸和己酸的變化規(guī)律較一致,HJ31#菌株在厭氧培養(yǎng)條件下產己酸含量比兼氧條件下要高,HJ31#菌株在厭氧條件下,最高產己酸量為1269 mg/100 mL。己酸量與菌種生長旺盛程度成正比。

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