漆酶/木聚糖酶雙功能作用預水解液制備糠醛的研究

劉 婧，劉海棠,2,3

(1.中國輕工業(yè)造紙與生物質精煉重點實驗室，天津市制漿造紙重點實驗室，天津科技大學輕工科學與工程學院，天津300457；2.中國林業(yè)科學研究院林產化學工業(yè)研究所，江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，南京210042；3.天津市海洋資源與化學重點實驗室(天津科技大學)，天津300457)

資源短缺和能源匱乏是現(xiàn)在全球面臨的共同問題。據(jù)專家推斷，現(xiàn)在世界上所有已知儲備量的化石類能源，如煤炭、石油等，在200年之內將全部耗盡[1]。在被能源及環(huán)境問題限制了全球造紙工業(yè)發(fā)展的背景下，生物質精煉的發(fā)展成為不可抵擋之勢。在美國能源部的支持下，美國林產與造紙工業(yè)協(xié)會（American Forest and Paper Association,AF&PA）制訂了2020年發(fā)展規(guī)劃[2]，提出了“高效組合的林產品生物精煉”（integrated forest products biorefinery,IFBR）的概念，核心是整合全部的生物質原料，比如木材纖維等，并通過能源轉化、包裝等手段充分發(fā)揮利用其自身的價值[3]。制漿造紙產業(yè)會消耗大量的生物質資源（主要是木、竹、草等），在其所有的工序中，除了纖維素以紙漿的形式被有效地使用之外，大部分半纖維素和木質素都以廢液的形式被排出或焚燒，不僅增加了環(huán)境負荷，還浪費了大量的生物質資源。在全球資源不足和能源危機的背景下，生物質精制的概念被用于改變傳統(tǒng)的造紙產業(yè)，特別預水解液的增值化利用給傳統(tǒng)造紙行業(yè)帶來了額外的利潤。

預水解液的成分比較復雜，包括低聚木糖、木糖、木質素、甲酸、乙酸和糠醛等。其中，木糖含量最高，是生產糠醛的最主要原材料，擁有很高的潛在價值。木素作為預水解液中僅次于木糖的成分，也擁有重要的商業(yè)價值，它本身就是一種天然的膠黏劑和黏合劑，經過加工還可以制備成為燃料；在生產無煙煤和無硫固體燃料的原料中，木素就占了一定比例。乙酸是預水解物中的重要成分，主要用于生產乙醇、乙酸酐、乙酸鹽和乙酸纖維素等[4]。另外，乙酸在工業(yè)中的應用十分廣泛，在生產藥物、殺蟲劑等領域有十分重要的應用。倪永浩等[5]嘗試研究乙酸在工業(yè)生產中的循環(huán)利用，以預水解液為原料，用三辛胺/正辛醇體系萃取乙酸，再用氫氧化鈉反萃取，回收乙酸，并且取得了不錯的成效。

與預水解液中的其他物質相比，糠醛的含量是比較低的，但是這并不影響糠醛擁有最高的價值，其是化工領域30 種高價值基礎化學品之一。Di Blasi等[6]進行生產糠醛的實驗，以幾種闊葉木、針葉木及農作物秸稈等作為原料進行分析比對，結果表明用玉米芯生產糠醛的效果最好。分析得出玉米芯生產糠醛效果最好的原因是，玉米芯中擁有大量的半纖維素，而半纖維素的水解產物主要是木糖。

本文結合已有研究結果，以桉木預水解液為原料，在漆酶/木聚糖酶協(xié)同作用下去除部分木素，同時降解低聚木糖為木糖；然后以硫酸為催化劑對生產糠醛的工藝條件進行研究，以期探究糠醛生產的最適條件，實現(xiàn)造紙廢液的高值化利用，減少對環(huán)境的污染。

1 實驗

1.1 原料和試劑

桉木預水解液(PHL)由山東太陽紙業(yè)提供。濃硫酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、糠醛，色譜純，Sigma-Aldrich 公司；木聚糖酶(NS51024)、漆酶(OMN07015)，諾維信生物技術有限公司。

1.2 實驗設備

YA28X－4T 型立式壓力蒸汽滅菌器、HHS-21-4型電熱恒溫水浴鍋、HHS-21-4 型高溫高壓反應釜，上海博訊有限公司；DKM610C 型電熱鼓風干燥箱，日本雅馬拓公司；SHB－III 型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿易有限公司；AR2140 型電子天平、STARTER3100 型酸度計，奧豪斯儀器(常州)有限公司；1200 series 型高效液相色譜儀，德國愛捷倫公司；FTIR-650 型傅立葉紅外光譜分析儀，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；SL-200PL 型移液槍，梅特勒·托利多儀器有限公司；T6 新世紀型紫外可見分光光度計，北京普析儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 預水解液組分分析

（1）單糖及糠醛含量的測定：量取10 mL PHL于50 mL 錐形瓶中，向其中加入378 μL 72%的硫酸進行酸化；用錫箔紙將錐形瓶進行封口，在高壓蒸汽滅菌鍋中將錐形瓶放置于最上層，覆蓋牛皮紙；設定溫度為121 ℃，時間為60 min，進行高壓滅菌。滅菌的PHL 過0.22 μm 濾膜后用液相色譜儀測定。

（2）木素含量的測定：PHL 用去離子水稀釋一定倍數(shù)后過0.22 μm 的濾膜，以去離子水作為空白組，用紫外分光光度計測定205 nm 波長處的吸收值（TAPPI，UM250）。根據(jù)式（1）計算木素含量。

式中：ε 為吸收系數(shù)，取110 L/(g·cm)；D 為稀釋倍數(shù)；A 為吸光度；L 為1 cm 比色皿的厚度；w 為木素含量。

（3）標準曲線的繪制：

（a）葡萄糖、木糖、阿拉伯糖標準曲線的繪制方法：稱取葡萄糖、木糖標準品各0.2 g，阿拉伯糖0.15 g放入離心管中，補加流動相至20 g，編號為B1，待完全溶解后進行濃度梯度稀釋，稀釋后的樣品分別過0.22 μm 的濾膜，編號分別為B2、B3、…、B8，用液相分別測得其峰面積，以濃度(mg/g)為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

（b）糠醛標準曲線的繪制方法：稱取0.2 g 糠醛于離心管中，向離心管中補加流動相至20 g，編號為F1，搖勻后進行濃度梯度稀釋，稀釋后的樣品分別過0.22 μm 的濾膜，編號分別為F2、F3、…、F8，用液相分別測得其峰面積，以濃度(mg/g)為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，過程中注意遮光處理。

1.3.2 漆酶處理預水解液

（1）漆酶處理時間的確定：量取30 mL PHL 于50 mL 錐形瓶中，參考Wang 等[7]的研究，選用漆酶用量10 μL/mL 和溫度36 ℃的實驗條件，且在恒溫搖床150 r/min 轉速下分別處理0.5、1、2、3、4、5 h，然后滅活，過0.22 μm 的濾膜后待測，此時的預水解液記為L-PHL。

（2）木素去除率的測定：木素去除率根據(jù)式（2）計算。

式中：w 為原水解液木素的含量；w′為漆酶處理后水解液木素的含量。

（3）木素紅外光譜分析：稱?。?.001 0±0.000 2）g干燥后的漆酶處理后PHL 中析出的固體，加入（0.10±0.02）g 烘干的KBr，在瑪瑙研缽中充分研磨后壓片，空氣為背景，在檢測范圍為400～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1條件下掃描樣品。

1.3.3 木聚糖酶處理預水解液

通過初步實驗確定了木聚糖酶對L-PHL 的作用條件。將L-PHL 轉移至燒杯中，繼續(xù)向其中加入2 mL 的木聚糖酶，在溫度為70 ℃、轉速150 r/min的條件下于恒溫搖床中反應2 h，然后經滅活過0.22 μm 濾膜待測，此時的預水解液記為X-PHL。1.3.4 糠醛的制備

（1）取200 g 左右的X-PHL 于燒杯中，向其中加入98%的硫酸，使酸的質量分數(shù)為4%，混勻。

（2）在高壓反應釜中加入約2/3 體積的（1）中的混勻水解液，設定溫度為180 ℃，轉速為90 r/min，最大壓力15 MPa。

（3）等待儀器溫度升到180 ℃開始保溫，保溫時間為90 min。

（4）保溫結束后將溫度調節(jié)至40 ℃，待降溫結束后將儀器拆卸，轉移液體至燒杯中，清洗儀器。

（5）用注射器吸取燒杯中液體，通過0.22 μm 濾膜，注射于液相小瓶中待測。

1.3.5 木糖轉化率及糠醛得率的計算

L-PHL 經木聚糖酶處理后木糖轉化率依據(jù)式（3）計算。

X-PHL 在硫酸催化作用下所制備的糠醛得率依據(jù)式（4）計算。

2 結果與分析

2.1 預水解液組分分析

根據(jù)標準曲線計算預水解液中各組分含量如表1所示。

表1 預水解液中各組分含量

2.2 漆酶處理預水解液

2.2.1 漆酶處理的最適時間

漆酶處理時間與木素去除率的關系如圖1所示。由圖1 可以看出：在酶用量、溫度等因素確定的條件下，隨著漆酶作用時間的變化，其對PHL 中木質素的誘導聚合去除效果愈加明顯。作用時間達2 h 后木素去除效果基本不變，因此選取2 h 為漆酶作用PHL去除木素的最佳時間，此時的木素去除率達43%。

圖1 漆酶處理時間與木素去除率的關系

2.2.2 漆酶處理前后PHL 中各組分的變化

漆酶處理前后PHL 中各組分含量變化如表2所示。由表2 可以看出：經過漆酶處理后，PHL 中木素的含量由4.14%下降到了2.36%，木素的去除率達到了43%，溶液中各糖組分的含量沒有發(fā)生大幅度的變化，葡萄糖、木糖、糠醛的含量有小幅度的增加，而阿拉伯糖則略微減少。根據(jù)以上數(shù)據(jù)的分析，漆酶對PHL 中的木素有著選擇吸附使得木素聚合的作用，這與Bourbonnais 等[8]的研究結果一致。

表2 漆酶處理前后PHL中各組分含量的變化

2.2.3 紅外光譜分析

加入漆酶后燒杯中析出固體與加入木聚糖酶后析出固體的紅外光譜圖相似，所以只分析加入漆酶后析出固體的紅外光譜圖，見圖2。

圖2 木素的紅外光譜圖

由圖2 木素的紅外光譜圖分析可知，3 429 cm-1是羥基的特征吸收峰；2 932 cm-1是—CH2—的特征吸收峰；1 542 cm-1、1 514 cm-1、1 422 cm-1為木素苯環(huán)骨架振動特征吸收峰；1 458 cm-1是CH3—O 的吸收峰；1 215 cm-1是木素結構中C—C、C—O、C=O 的振動吸收峰，以上吸收峰說明漆酶法處理預水解液后的析出固體為木素。

付時雨[9]和宋麗巖[10]經過對木素的紅外光譜進行分析和比對得出結論，如果在制漿或者漂白的過程中出現(xiàn)了碳水化合物的氧化反應，則在光譜圖的1 730 cm-1處出現(xiàn)吸收峰。而在本實驗所得的光譜圖里，在1 730 cm-1沒有相關峰生成，這說明溶液中沒有發(fā)生氧化反應，即漆酶除木素不會引起氧化反應的生成，并且從漆酶的作用機理進一步分析可知，相比PHL 中的其他組分漆酶對木素有選擇吸附的作用，具有除木素的專一性。

2.3 木聚糖酶處理L-PHL

木聚糖酶處理前后預水解液組分的變化如表3所示。木聚糖酶處理L-PHL 只對其中糖類起作用，主要是L-PHL 中的單糖組分葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，對其他組分無明顯效果，所以表3 中僅涉及相關單糖含量，尤其是木聚糖在木聚糖酶作用下降解成木糖的含量，以及后續(xù)實驗中糠醛含量的變化。

表3 木聚糖酶處理前后預水解液各組分含量的變化

由表3 可以看出：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖的含量都增加了，其中葡萄糖增加最多，木糖和阿拉伯糖的增加率也達到了20%以上，而糠醛略微減少。糖含量的變化說明溶液中加入的木聚糖酶不僅作用于主鏈的β-1,4-糖苷鍵水解木聚糖分子，而且作用于木聚糖中阿拉伯糖側鏈殘基等，最終將木聚糖轉化為它的組成單糖。

2.4 制備糠醛

經過在高壓反應釜中的反應后，預水解液中各組分含量變化如表4所示。由表4 可以看出：反應后的糠醛含量大幅增加，阿拉伯糖含量有小幅增加，而葡萄糖含量略微降低，木糖含量大幅減少。由此可以得出結論，在以酸為催化劑時，溶液中的木糖大部分轉化為糠醛，有一少部分會轉化為阿拉伯糖。

表4 制備糠醛前后預水解液中各組分含量的變化

根據(jù)式（1）和式（2）計算可得：糠醛得率只有56.95%；木糖轉化率較高，為89.8%。導致這種現(xiàn)象的原因可能有：當溶液中含有硫酸時，生成的糠醛可能會發(fā)生磺化反應，導致已經在溶液中的糠醛發(fā)生副反應，降低了糠醛的得率。Zeitsch[11]的研究也證實了這一點，硫酸會與溶液中生成的糠醛發(fā)生反應，使得實驗結果中的得率較低。根據(jù)反應結果分析得到的糠醛轉化率低的原因還可能是糠醛自身的降解反應。Williams 等[12]曾定量地分析了糠醛在硫酸作反應催化劑時損失反應的動力學，研究表明糠醛的降解率不僅與氫離子濃度成比例關系，而且反應溫度和糠醛濃度都會對其造成影響，該降解反應為一級反應。

3 結論

（1）在本實驗條件下用漆酶處理預水解液除木素，最佳的處理時間為2 h。

（2）木聚糖酶處理L-PHL 后，在硫酸催化作用下木糖的轉化率為89.8%，糠醛的得率為56.95%。在漆酶/木聚糖酶雙功能作用下，木糖未能全部轉化為糠醛，可能有部分轉化為了阿拉伯糖。