金屬硫酸鹽預(yù)處理增強(qiáng)小麥秸稈的酶解糖化特性

徐 雙，王凱晴，霍 丹，付方偉，楊秋林,，張鳳山

(1.中國(guó)輕工業(yè)造紙與生物質(zhì)精煉重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津市制漿造紙重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，天津300457；2.華泰集團(tuán)華泰紙業(yè)有限公司，東營(yíng)257335)

生物質(zhì)是僅次于煤炭、石油和天然氣的世界第四大能源，在整個(gè)能源系統(tǒng)中占有重要地位[1-2]。預(yù)處理、水解和發(fā)酵是生物質(zhì)原料制備燃料乙醇的三個(gè)主要技術(shù)環(huán)節(jié)，通過預(yù)處理可以克服生物質(zhì)原料水解時(shí)可發(fā)酵單糖得率偏低的問題，也能消除原料中的雜質(zhì)對(duì)反應(yīng)體系的影響[3]。因此尋找環(huán)保高效的預(yù)處理技術(shù)對(duì)生物質(zhì)原料的后續(xù)轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。

目前，普遍認(rèn)為生物質(zhì)預(yù)處理具有如下作用：打破半纖維素和木素對(duì)纖維素的包裹和纏繞，改變植物細(xì)胞壁的物理化學(xué)特性；破壞引起纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)連接，降低其結(jié)晶度；去除部分半纖維素和木質(zhì)素；增大生物質(zhì)的疏松性，增加其比表面積和孔隙度；降低生物質(zhì)的水解頑抗性，增加纖維素酶對(duì)纖維素的有效接觸面積，提高酶解效率[4]?；瘜W(xué)預(yù)處理是最常用的生物質(zhì)預(yù)處理方法，主要包括酸預(yù)處理、堿預(yù)處理、氧化預(yù)處理、有機(jī)溶劑預(yù)處理和離子液體預(yù)處理等[5-8]。

除了上述化學(xué)預(yù)處理，金屬鹽預(yù)處理也能夠有效提高固體基質(zhì)的酶解糖化效率。金屬鹽預(yù)處理具有工藝簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、處理時(shí)間短、固體基質(zhì)得率高、預(yù)處理液易分離等優(yōu)點(diǎn)，是一種比較有前途的預(yù)處理技術(shù)。金屬鹽預(yù)處理主要是利用金屬離子與木質(zhì)纖維素之間的作用，即金屬離子與木質(zhì)纖維底物分子中羥基等絡(luò)合，影響底物形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而影響其化學(xué)反應(yīng)。此外，不同金屬離子對(duì)纖維素酶活力會(huì)產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用，從而影響生物質(zhì)原料的酶解糖化效率[9]。目前，對(duì)于金屬鹽預(yù)處理的研究主要集中在金屬氯鹽，而對(duì)金屬硫酸鹽的研究較少?；谏鲜隼碚摵脱芯楷F(xiàn)狀，本文將金屬硫酸鹽用于生物質(zhì)原料的預(yù)處理，以改善其后續(xù)酶解糖化效率。

1 原料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小麥秸稈取自河北辛集，經(jīng)微型粉碎機(jī)（FZ102型，天津泰斯特儀器有限公司）粉碎后，取40～60 目組分備用。纖維素酶（Cellulast,50.97 FPU/mL）和纖維二糖酶（Novozyme188,1 290.69 CBU/mL）由諾維信北京公司提供。其他試劑均為分析純，購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 金屬硫酸鹽預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取絕干小麥秸稈20 g，置于高壓反應(yīng)釜（4566 型，美國(guó)Parr 公司）內(nèi)，采用的固液比（質(zhì)量比）為1∶6，金屬硫酸鹽K2SO4、Na2SO4、CaSO4、MgSO4、ZnSO4和FeSO4的加入量為0.15 mol/L，其他金屬硫酸鹽（Fe2(SO4)3、Al2(SO4)3、KAl（SO4）2）的加入量為0.05 mol/L。反應(yīng)釜密封，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速為150 r/min，然后以5 °C/min 的升溫速率升溫到170 °C，預(yù)處理保溫時(shí)間為25 min。預(yù)處理結(jié)束后，將反應(yīng)釜迅速冷卻至室溫，進(jìn)行卸鍋操作。物料經(jīng)80 目篩網(wǎng)過濾后，得到的液體即為預(yù)處理液。對(duì)于固體部分，采用1 L 去離子水充分洗滌，并用80 目篩網(wǎng)過濾，重復(fù)上述洗滌和過濾操作2 次，最終得到預(yù)處理后的固體基質(zhì)。固體基質(zhì)得率為固體基質(zhì)與原料的質(zhì)量比。

1.3 固體基質(zhì)酶解糖化

準(zhǔn)確稱取2 g 固體基質(zhì)，置于250 mL 錐形瓶中，加入一定量0.1 mol/L 的檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖溶液，然后加入10 FPU/g(對(duì)固體基質(zhì))的纖維素酶和15 CBU/g 的纖維二糖酶，并加入2 滴乙酸乙酯抑制水解過程中雜菌的產(chǎn)生，最后，用檸檬酸－檸檬酸鈉溶液將固體基質(zhì)濃度稀釋到2.5%。將錐形瓶置于恒溫培養(yǎng)振蕩器(KYC－100B 型，天津歐諾儀器儀表有限公司)中，以150 r/min 的轉(zhuǎn)速在50 °C 下反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后，將錐形瓶置于90 °C 的水浴中10 min，對(duì)酶進(jìn)行滅活處理。最后，將酶解懸浮液采用真空過濾器分離，得到酶解液，酶解液進(jìn)行還原糖含量檢測(cè)，根據(jù)式（1）計(jì)算固體基質(zhì)中纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率和單位質(zhì)量小麥秸稈原料的葡萄糖產(chǎn)率。

式中：mg為酶解液中葡萄糖的質(zhì)量，g；mc為酶解固體基質(zhì)中纖維素的質(zhì)量，g。

1.4 原料及固體基質(zhì)分析

原料和固體基質(zhì)的成分分析采用NREL 實(shí)驗(yàn)室的方法[10]。將0.3 g 樣品依次進(jìn)行濃酸解和稀酸水解，得到水解液和水解殘?jiān)?。水解液采用高效液相色譜（HPLC，Agilent 1260 型，美國(guó)安捷倫科技公司）測(cè)定其單糖成分，用于計(jì)算纖維素和聚戊糖含量（木糖和阿拉伯糖含量之和），同時(shí)采用紫外－可見分光光度計(jì)（970894 型，瑞典Lorentzen &Wettre 公司）分析其酸溶木素含量。水解殘?jiān)糜诜治鰳悠返乃岵蝗苣舅睾俊PLC 檢測(cè)條件為：色譜柱Bio-Rad Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm），柱溫55 °C，流動(dòng)相0.05 mol/L 硫酸，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，采用RID 和VWD 檢測(cè)器。

1.5 預(yù)處理液及酶解液分析

預(yù)處理液及酶解液在5 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，將上清液用0.22 μm 水相微孔濾膜過濾后采用HPLC 進(jìn)行成分分析，HPLC 檢測(cè)條件見1.4。

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬硫酸鹽對(duì)小麥秸稈預(yù)處理及酶解糖化的影響

在小麥秸稈的預(yù)處理過程中，受金屬離子化合價(jià)的影響，金屬硫酸鹽的加入量不同，但是體系中硫酸根離子的濃度保持一致（0.15 mol/L），其他預(yù)處理?xiàng)l件均相同。固體基質(zhì)得率及酶解轉(zhuǎn)化率見圖1，固體基質(zhì)的成分分析見表1。

圖1 金屬硫酸鹽預(yù)處理對(duì)固體基質(zhì)得率和酶解轉(zhuǎn)化率的影響

表1 固體基質(zhì)成分分析

盡管預(yù)處理洗滌過程會(huì)造成固體基質(zhì)損失，但大部分固體基質(zhì)損失是由金屬硫酸鹽預(yù)處理造成的。通過圖1 發(fā)現(xiàn)，金屬離子的化合價(jià)會(huì)影響金屬硫酸鹽對(duì)小麥秸稈原料的預(yù)處理效果。其中，一價(jià)金屬硫酸鹽預(yù)處理的固體基質(zhì)得率最高，約為70%；二價(jià)金屬硫酸鹽預(yù)處理的固體基質(zhì)得率為60%左右；而三價(jià)金屬硫酸鹽預(yù)處理的固體基質(zhì)得率最低，采用Fe2（SO4）3時(shí)固體基質(zhì)得率僅為52.5%。此外，復(fù)合鹽KAl（SO4）2中既存在Al3＋又存在K＋，由于體系中這兩種金屬離子的含量均較低（0.075 mol/L），其在預(yù)處理中的效果較弱，所得固體基質(zhì)的得率略低于一價(jià)金屬硫酸鹽。上述分析表明，金屬離子的化合價(jià)越高，越有利于生物質(zhì)原料的降解。這一規(guī)律在金屬氯鹽預(yù)處理的研究中已經(jīng)得到證實(shí)，采用0.3 mol/L 的KCl 在160 ℃預(yù)處理桉木粉20 min，固體基質(zhì)得率高達(dá)84.3%左右，而相同條件下0.1 mol/LFeCl3預(yù)處理的固體基質(zhì)得率僅為63.6%[11]。此外，Liu 等[12]用氯鹽KCl、NaCl、CaCl2、MgCl2和FeCl3在180 ℃下對(duì)木糖和木聚三糖進(jìn)行處理，結(jié)果也表明這幾種金屬氯鹽都能促進(jìn)木糖和木聚糖的降解，其促進(jìn)降解的順序依次為：FeCl3＞MgCl2＞CaCl2＞KCl＞NaCl，而且對(duì)木聚糖的降解作用比單糖更顯著。

受原料結(jié)構(gòu)特性影響，小麥秸稈直接酶解的轉(zhuǎn)化率僅為14.8%。通過預(yù)處理可以脫除原料中的半纖維素和木素－碳水化合物復(fù)合體，從而改善細(xì)胞壁的納孔結(jié)構(gòu)（Nano-porous structures）分布，最終提高纖維素酶對(duì)生物質(zhì)原料的可及度[13]。金屬硫酸鹽預(yù)處理可以顯著提高小麥秸稈原料的酶解糖化效率，且其提高作用也嚴(yán)重受到金屬離子化合價(jià)的影響。經(jīng)一價(jià)金屬硫酸鹽預(yù)處理后，固體基質(zhì)的酶解轉(zhuǎn)化率僅為45%左右，二價(jià)金屬硫酸鹽預(yù)處理后固體基質(zhì)的酶解轉(zhuǎn)化率在60%左右，而三價(jià)金屬硫酸鹽預(yù)處理后固體基質(zhì)的酶解轉(zhuǎn)化率可達(dá)75%以上。需要指出的是，采用Fe2（SO4）3預(yù)處理后固體基質(zhì)的酶解轉(zhuǎn)化率高達(dá)88.3%，遠(yuǎn)高于三價(jià)鹽Al2（SO4）3，這與采用Fe2（SO4）3預(yù)處理過程大量的半纖維素發(fā)生降解有一定的關(guān)系。此外，經(jīng)過預(yù)處理后部分Fe3＋會(huì)吸附或螯合到固體基質(zhì)表面，這些Fe3＋能夠顯著提高纖維素酶的活性，從而提高固體基質(zhì)的酶解轉(zhuǎn)化率[11]。

在對(duì)固體基質(zhì)的成分分析（表1）中發(fā)現(xiàn)，固體基質(zhì)中主要以纖維素為主，其含量超過50%。這是因?yàn)榻饘倭蛩猁}預(yù)處理主要導(dǎo)致原料中的半纖維素降解，而纖維素本身結(jié)構(gòu)比較致密，存在結(jié)晶區(qū)，很難在預(yù)處理中被破壞。另外，預(yù)處理過程中金屬硫酸鹽為體系提供酸性環(huán)境，導(dǎo)致大部分的酸溶木素被降解溶出，而大部分酸不溶木素仍然保留在固體基質(zhì)中。

2.2 金屬硫酸鹽預(yù)處理過程中木素及綜纖維素的降解機(jī)制

為了明確預(yù)處理過程中原料中主要成分的降解規(guī)律，實(shí)驗(yàn)中對(duì)不同金屬硫酸鹽預(yù)處理過程中木素、纖維素和聚戊糖等的降解損失進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖2 和圖3。

圖2 金屬硫酸鹽預(yù)處理過程中的木素?fù)p失

圖3 金屬硫酸鹽預(yù)處理過程中的綜纖維素?fù)p失

受預(yù)處理體系酸性環(huán)境的影響，原料中的酸溶木素較為容易溶出，而大部分酸不溶木素仍然保留在固體基質(zhì)中（圖2），其中一價(jià)金屬硫酸鹽預(yù)處理對(duì)酸溶和酸不溶木素的降解作用均較弱，而三價(jià)金屬硫酸的降解作用則較強(qiáng)。聚戊糖為小麥秸稈原料中最主要的半纖維素成分。通過圖3 可以發(fā)現(xiàn)，金屬硫酸鹽預(yù)處理主要導(dǎo)致大量半纖維素降解，而對(duì)纖維素的降解作用較弱。盡管一價(jià)金屬硫酸鹽在預(yù)處理中的作用較弱，原料中的聚戊糖損失也高達(dá)65%以上；而采用Fe2（SO4）3時(shí)，原料中聚戊糖的損失率達(dá)到最高水平，為91.8%，遠(yuǎn)高于一價(jià)和二價(jià)金屬硫酸鹽。對(duì)于纖維素的降解損失，采用一價(jià)金屬硫酸鹽預(yù)處理時(shí)纖維素的損失僅為10%左右；采用二價(jià)金屬硫酸鹽預(yù)處理時(shí)纖維素的降解損失略高于一價(jià)金屬硫酸鹽，為12%～13%；而三價(jià)金屬硫酸預(yù)處理時(shí)纖維素的降解損失最大，高達(dá)16%以上。將固體基質(zhì)的酶解轉(zhuǎn)化率最終換算成單位質(zhì)量小麥秸稈原料的葡萄糖轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖4。盡管三價(jià)金屬硫酸鹽預(yù)處理導(dǎo)致大量的纖維素?fù)p失，但其固體基質(zhì)酶解轉(zhuǎn)化率（29.0%）遠(yuǎn)高于一價(jià)和二價(jià)金屬硫酸鹽，這也意味著原料中73.8%的纖維素已經(jīng)轉(zhuǎn)化為葡萄糖，最終導(dǎo)致小麥秸稈原料的葡萄糖產(chǎn)率也處于較高水平，即三價(jià)金屬硫酸鹽預(yù)處理更有利于提高生物質(zhì)原料的酶解轉(zhuǎn)化率。

圖4 金屬硫酸鹽預(yù)處理對(duì)原料的葡萄糖產(chǎn)率影響

2.3 金屬硫酸鹽預(yù)處理液的分析及表征

預(yù)處理液中的葡萄糖主要和纖維素的降解反應(yīng)有關(guān)，而木糖則為半纖維素的主要降解產(chǎn)物。此外，預(yù)處理過程中存在葡萄糖和木糖的副反應(yīng)，葡萄糖副反應(yīng)產(chǎn)物主要是5-羥甲基糠醛（5-HMF），5-HMF可進(jìn)一步降解并產(chǎn)生乙酸，而木糖副反應(yīng)的主要產(chǎn)物則為糠醛，糠醛可進(jìn)一步分解產(chǎn)生甲酸[14]。為了進(jìn)一步明確纖維素、半纖維素等在預(yù)處理過程中的降解反應(yīng)，對(duì)預(yù)處理液中上述成分進(jìn)行了分析檢測(cè)，結(jié)果見表2。

表2 預(yù)處理液主要成分分析

由于預(yù)處理過程中主要導(dǎo)致半纖維素降解，因此預(yù)處理液中均存在大量的木糖，其中Fe2（SO4）3預(yù)處理的木糖含量最高（6.84 mg/mL）。此外，預(yù)處理液中存在少量的糠醛和甲酸，這說明有少量的木糖發(fā)生副反應(yīng)，這與預(yù)處理時(shí)間較短有關(guān)（25 min）。由于纖維素的降解損失較少，預(yù)處理液中的葡萄糖含量也相對(duì)較低。其中，F(xiàn)e2（SO4）3預(yù)處理的葡萄糖含量最高，為4.14 mg/L，與此對(duì)應(yīng)，F(xiàn)e2（SO4）3預(yù)處理過程中纖維素的降解損失最大。此外，所有預(yù)處理液中均存在較多的5-HMF 和乙酸，特別是乙酸，其含量普遍高于葡萄糖，這表明有相當(dāng)一部分葡萄糖發(fā)生降解轉(zhuǎn)化。

3 結(jié)論

金屬硫酸鹽預(yù)處理可以高效降解小麥秸稈中的半纖維素，提高所得固體基質(zhì)的酶解糖化效率。相對(duì)于一價(jià)和二價(jià)金屬硫酸鹽，三價(jià)金屬硫酸鹽對(duì)原料中半纖維素(聚戊糖)和纖維素的降解作用更強(qiáng)，更有利于固體基質(zhì)的酶解轉(zhuǎn)化率。在預(yù)處理液中，大量的葡萄糖會(huì)進(jìn)一步發(fā)生降解轉(zhuǎn)化，而木糖則很少發(fā)生副反應(yīng)。此外，預(yù)處理過程中少量金屬離子會(huì)螯合或吸附到固體基質(zhì)表面并影響酶的活性，從而影響固體基質(zhì)的酶解糖化。