益心泰方對慢性心力衰竭兔心肌組織β-MHCmRNA及蛋白表達(dá)的影響

孫濤 劉承鑫 李雅 郭志華 張彤瑜 魏佳明 易瓊

〔摘要〕 目的 探討益心泰方對慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）兔模型心肌組織β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain， β-MHC） mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。方法 采用縮窄腹主動脈法+丙基硫氧嘧啶灌胃建立CHF兔模型。將成模家兔隨機(jī)分成模型組、益心泰低劑量組、益心泰中劑量組、益心泰高劑量組及氯沙坦鉀組，另設(shè)假手術(shù)組。每組分別予以相應(yīng)藥物灌胃，模型組及假手術(shù)組予以生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃4周。采用ELISA法檢測心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide， ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide， BNP）水平;超聲心動圖儀檢測心功能指標(biāo);采用Western blot法測檢測心肌組織β-MHC蛋白含量;RT-PCR法測定β-MHC mRNA表達(dá)，并運(yùn)用透射電鏡觀察心肌病理組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組ANP、BNP水平明顯升高（P<0.01）;左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、E峰與A峰的比值（E/A）顯著降低（P<0.01）;β-MHC蛋白及mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01）;在電鏡下觀察，模型組心肌出現(xiàn)水腫、壞死等損傷表現(xiàn)。與模型組比較，各給藥組ANP、BNP水平均顯著下降（P<0.05）;各給藥組LVEF、LVFS、E/A均顯著升高（P<0.05）;各給藥組β-MHC蛋白及β-MHC mRNA水平均顯著降低（P<0.05）;在電鏡下觀察，各給藥組心肌細(xì)胞損傷程度均得到改善。與益心泰低劑量組比較，益心泰中、高劑量組及氯沙坦鉀組的上述檢測指標(biāo)均優(yōu)于低劑量組（P<0.05）。結(jié)論 益心泰方可有效抑制心肌組織β-MHC蛋白及mRNA表達(dá)，降低ANP及BNP，改善心功能，從而發(fā)揮防治CHF的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 益心泰方;慢性心力衰竭;β-MHC蛋白;BNP;心肌組織

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.06.007

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Yixintai Fang on expression of β-myosin heavy chain （β-MHC） mRNA and its protein in myocardial tissues of rabbits with chronic heart failure （CHF）. Methods Rabbit models of CHF were established by constricting abdominal aorta and giving propylthiouracil by gavage. Successfully modeled rabbits were randomly divided into a model group， a low-， middle-， and high-dose Yixintai Fang group and a losartan potassium group. Besides， a sham operation group was set up. The corresponding drug was given by gavage in each group. Normal saline was administered to rabbits of the model group and the sham operation group by gavage. The intervention lasted for 4 weeks， once per day. The levels of atrial natriuretic peptide （ANP） and brain natriuretic peptide （BNP） were detected by ELISA. The cardiac function was detected by echocardiography. The content of β-MHC protein was detected by Western blot. The expression of β-MHC mRNA was detected by RT-PCR. The myocardial pathological structure was observed by transmission electron microscopy. Results Compared with the sham operation group， the ANP and BNP levels of the model group were significantly increased （P<0.01）. The LVEF， LVFS， and E/A of the model group were significantly decreased （P<0.01）. mRNA and protein expression levels of β-MHC in myocardial tissues were increased significantly （P<0.01）. Under the observation of electron microscope， the myocardial tissue in the model group presented edema， necrosis and other injury manifestations. Compared with the model group， the levels of ANP and BNP of each administration group decreased significantly （P<0.05）. LVEF， LVFS， and E/A of each administration group increased significantly （P<0.05）. Moreover， mRNA and protein expression levels of β-MHC in each administration group were significantly decreased （P<0.05）. Under the observation of electron microscope， the damage degree of cardiomyocytes in each group was improved compared with that in the model group. Compared with the low-dose Yixintai Fang group， the above indexes of Yixintai middle-， high-dose group and losartan potassium group were all better than the low-dose group （P<0.05）. Conclusion Yixintai Fang can effectively inhibit the expression of mRNA and protein expression of β-MHC， reduce ANP and BNP， improve cardiac function， and thus play a role in the prevention and treatment of CHF.

〔Keywords〕 Yixintai Fang; chronic heart failure; β-MHC protein; BNP; myocardial tissues

隨著社會水平的提高，我國人口老齡化日趨加劇，慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）的發(fā)病率逐年上升，現(xiàn)已成為主要危害人類生命健康的疾病之一[1]。心肌病理性重構(gòu)被認(rèn)為是心力衰竭最基本的病理生理機(jī)制[2]，而病理性心肌肥厚是心肌重構(gòu)的重要表現(xiàn)形式之一。病理性心肌肥厚在一定條件下是可逆的[3]，而這種可逆性為臨床改善心肌重構(gòu)乃至心力衰竭提供了可能手段。近年來有研究[4-5]表明，心肌肥厚的再表達(dá)與β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain， β-MHC）等肥大相關(guān)基因的表達(dá)增加有關(guān)。β-MHC基因表達(dá)的增加，可加重心肌病理性重構(gòu)，從而促使心力衰竭加劇。因此，降低β-MHC肥大相關(guān)基因的表達(dá)，可能有助于改善心肌重構(gòu)，進(jìn)而有助于延緩心衰發(fā)展的進(jìn)程。有研究[6-7]表明，中醫(yī)藥改善慢性心衰療效確切，且對于β-MHC基因及其蛋白具有調(diào)節(jié)作用。益心泰方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)郭志華教授用于治療蛋白重鏈（MHC）的臨床科研方[8]，前期臨床觀察及動物實(shí)驗(yàn)研究表明益心泰方對于CHF具有確切的療效，對于心肌重構(gòu)具有一定調(diào)節(jié)作用[9-12]，但其在治療過程中具體的作用機(jī)制仍未完全闡明，因此需要繼續(xù)深入研究。本研究將探討益心泰方對CHF兔模型心肌β-MHC蛋白、β-MHC mRNA、心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide， ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide， BNP）、心功能及心肌病理組織結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 ?動物

成年新西蘭大白兔120只，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，雌雄各半，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SYXK（京）2017-0033。實(shí)驗(yàn)場所由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，室內(nèi)溫度21～23 ℃，濕度52%～60%，通風(fēng)，分籠飼養(yǎng)，飼料及水均由中心提供。

1.2 ?藥物

益心泰方由黃芪、紅花、丹參、澤瀉、豬苓、葶藶子組成，按3∶1∶1∶2∶1∶1質(zhì)量配比，中藥飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。取益心泰方加入處方劑量10倍水，浸泡30 min后，煎煮2次，每次45 min，合并兩次藥液，過濾，濃縮至2.1 g/mL。氯沙坦鉀（杭州默沙東制藥有限公司，批號：20171020）。丙基硫氧嘧啶（精華制藥集團(tuán)股份有限公司，批號：31170303）。

1.3 ?主要試劑與儀器

β-MHC抗體（上海康朗生物科技有限公司，貨號：KL15444R）;GAPDH抗體（上海振譽(yù)生物科技有限公司，貨號：bs-0755R-1）;ANP ELISA檢測試劑盒（江萊生物公司，貨號：JL22215）;BNP ELISA檢測試劑盒（eBioscience公司，貨號：XY-1900）;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司，貨號：RR047A）;SYBR Premix EX Taq TM II（Takara公司，貨號：DRR820A）;Trizol（Invitrogen公司，貨號：15596-026）;RIPA裂解液、PMSF（北京索萊寶生物科技有限公司）;DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）;SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)、iQ5 PCR儀（Bio-Rad公司）;Sequoia 512超聲心動圖儀（西門子公司）;Sigma 300掃描電鏡（Carl Zeiss Vision公司）。

1.4 ?造模

120只新西蘭家兔，隨機(jī)選取20只作為假手術(shù)組，其余100只進(jìn)行造模。參照文獻(xiàn)[13]采用縮窄腹主動脈法建立CHF兔模型，將兔固定于手術(shù)臺上，使用20%烏拉坦按5 mL/kg的劑量進(jìn)行腹腔麻醉。沿腹部正中線逐層切開腹壁，在右側(cè)腎動脈分支上方處分離出一段腹主動脈。用手術(shù)線將注射器針頭和與之平行度腹主動脈一同結(jié)扎，其后將針頭取出;假手術(shù)組同樣予以開腹，但不需結(jié)扎腹主動脈。術(shù)后按標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。術(shù)后，對所有造模家兔進(jìn)行丙基硫氧嘧啶灌胃，假手術(shù)組給予生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)6周。造模后，模型兔彩超提示左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、E峰與A峰的比值（E/A）顯著降低（P<0.01），并出現(xiàn)少動、氣促、納食減少、精神差等表現(xiàn)，說明造模成功。

1.5 ?分組與給藥

將成模兔隨機(jī)分模型組，氯沙坦鉀組和益心泰低、中、高劑量組，另設(shè)假手術(shù)組。于實(shí)驗(yàn)第7周開始灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4周;根據(jù)人體表面積換算法，將益心泰低、中、高劑量組分按照2.1、4.2、8.4 g/（kg·d）劑量標(biāo)準(zhǔn)（分別相當(dāng)于臨床人用藥劑量5、10、20倍），加生理鹽水配制成懸濁液后灌服，給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)4周;氯沙坦鉀組予氯沙坦鉀2.73 mg/kg，溶水后灌胃，每日1次，連續(xù)4周。造模和給藥期間，模型組，益心泰低、中、高劑量組，氯沙坦鉀組因麻醉意外等原因分別死亡6只、4只、5只、4只、3只，而假手術(shù)組死亡2只。

1.6 ?取材

連續(xù)給藥4周后，使用彩色超聲診斷儀檢測家兔心功能，其后對所有實(shí)驗(yàn)家兔予以靜脈采血，并采用空氣栓塞法處死全部實(shí)驗(yàn)家兔，其后取家兔心肌組織，約100 mg/份，以備指標(biāo)檢測。

1.7 ?觀察指標(biāo)

1.7.1 ?血清ANP、BNP水平檢測 ?造模及治療后，分別于所有實(shí)驗(yàn)兔耳緣靜脈采血3 mL，根據(jù)試劑盒說明采用ELISA法檢測血清ANP、BNP水平。

1.7.2 ?心功能指標(biāo)檢測 ?應(yīng)用彩色超聲診斷儀檢測實(shí)驗(yàn)兔心功能指標(biāo)：LVEF、LVFS、E/A。

1.7.3 ?心肌組織病理結(jié)構(gòu) ?取出各組兔模型心臟，剪取體積為3 mm×3 mm×3 mm大小的心肌組織，經(jīng)過固定、漂洗、脫水、干燥、包埋、染色等一系列工序處理后，在透射電子顯微鏡下拍攝觀察。

1.7.4 ?Western blot法檢測心肌β-MHC蛋白表達(dá) ?取100 mg心肌組織加入裂解液，高速勻漿2～3 min，冰上放置20 min，收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，即為心肌組織蛋白，配制BCA工作液及SDS-PAGE濃縮膠與分離膠、上樣，電泳，首先穩(wěn)壓80 V電泳約20 min，待樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)至穩(wěn)壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部時停止，其后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，待轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBST液洗滌印跡膜3次，每次5 min，之后放入5%脫脂奶粉/TBST封閉液內(nèi)，室溫封閉1 h，分別加入稀釋后抗體β-MHC及GAPDH，經(jīng)過一抗孵育、二抗孵育后及標(biāo)記物顯色等步驟后，顯影成像，計算β-MHC與GAPDH兩者灰度值之間的比值，并將基礎(chǔ)數(shù)值（假手術(shù)組）設(shè)置為1進(jìn)行比較，從而得出各組最后結(jié)果。

1.7.5 ?RT-PCR法測定心肌β-MHC mRNA表達(dá) ?將100 mg心肌組織置于Trizol的勻漿管中，提取總RNA，并使用超微量分光光度計檢測RNA純度及濃度并定量。之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物設(shè)計與合成：β-MHC上游：5-CCACAACCAGTACAAGTTCG-3，下游5-CTGGATGATCAGCAAGGAGT-3，PCR產(chǎn)物長度：190 bp;內(nèi)參基因GAPDH上游：5-GTCCCCGAGACACGATGGTGAAGGT-3，下游：5-TTCTCAGCCTTGACCGTGCCG-3，PCR產(chǎn)物長度：199 bp。配制實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系：采用iQ5 PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃酶激活2 min，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)，然后72 ℃、10 min，擴(kuò)增完成后行溶解曲線檢測，驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性，之后計算并分析每個樣本相應(yīng)的Ct值，并將基礎(chǔ)數(shù)值（假手術(shù)組）設(shè)置為1進(jìn)行比較，從而得出各組最后結(jié)果。

1.8 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以“x±s”表示，組間比較若滿足正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性，則使用ANOVA法分析，若不符合正態(tài)分布、方差齊性，采用Kruska-Wallis H進(jìn)行統(tǒng)計處理，組與組之間兩兩比較可采用LSD法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?益心泰方對兔血清ANP、BNP水平的影響

與假手術(shù)組比較，模型組家兔ANP、BNP水平顯著升高（P<0.01）;與模型組相比，益心泰低、中、高劑量組及氯沙坦鉀組均能降低ANP、BNP水平（P<0.05），且益心泰中、高劑量組和氯沙坦鉀組優(yōu)于益心泰低劑量組（P<0.05）。見表1。

2.2 ?益心泰方對兔心功能指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組家兔LVEF、LVFS、E/A下降顯著（P<0.01），提示造模成功。與模型組相比，益心泰低、中、高劑量組，氯沙坦鉀組均能提高LVEF、LVFS、E/A水平（P<0.05）;且益心泰中、高劑量組和氯沙坦鉀組優(yōu)于益心泰低劑量組（P<0.05）。見表2。

2.3 ?益心泰方對兔心肌組織超微結(jié)構(gòu)的影響

假手術(shù)組可見：肌原纖維排列整齊、緊密，密度均勻一致，肌絲排列整齊，肌節(jié)、Z線及M線清晰，線粒體豐富且結(jié)構(gòu)清晰，嵴密集排列，線粒體膜完整，間質(zhì)無變化。模型組可見：心肌超微結(jié)構(gòu)中肌原纖維溶解、壞死，Z線及M線模糊不清，只殘留肌原纖維輪廓，線粒體腫脹、變性，有空泡樣改變，嵴變疏短，線粒體膜不完整。經(jīng)用藥4周后，各治療組心肌結(jié)構(gòu)均較模型組有所改善，肌原纖維溶解、壞死范圍縮小，線粒體的結(jié)構(gòu)也有不同程度的改善。益心泰低劑量組：心肌肌絲稀疏，心肌纖維可見溶解、壞死，線粒體固縮，結(jié)構(gòu)模糊，有空泡樣改變，膜不完整。益心泰中劑量組：心肌肌原纖維出現(xiàn)部分溶解、壞死，線粒體稍腫脹，部分空泡化。益心泰高劑量組：心肌肌纖維各帶較為鮮明，肌小節(jié)明顯，Z線及M線較清晰，線粒體排列較規(guī)則，部分線粒體變細(xì)，部分空泡化。氯沙坦鉀組：心肌肌絲呈現(xiàn)出局灶性溶解，線粒體結(jié)構(gòu)大致完整。見圖1。

2.4 ?益心泰方對β-MHC mRNA及β-MHC蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組β-MHC蛋白、β-MHCmRNA表達(dá)升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示造模成功;與模型組比較，益心泰低、中、高劑量組及氯沙坦鉀組β-MHC蛋白、β-MHC mRNA表達(dá)均有所下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;且益心泰中、高劑量組和氯沙坦鉀組優(yōu)于益心泰低劑量組（P<0.05）。見圖2-3，表3。

3 討論

CHF是眾多心血管疾病所引起的心臟結(jié)構(gòu)和功能性的病變，使心室收縮、舒張功能發(fā)生障礙，進(jìn)而導(dǎo)致一系列復(fù)雜的臨床綜合征[14]。心肌病理性肥厚是心肌重構(gòu)重要的病理生理機(jī)制表現(xiàn)之一，也是導(dǎo)致心衰的病理生理機(jī)制之一。心肌細(xì)胞肥大和蛋白質(zhì)合成增加是心肌病理性肥厚的主要特點(diǎn)[15]。心肌肌球MHC可分為α-MHC和β-MHC，是決定心臟收縮力和收縮速度的重要因素[16]。心肌肥厚與β-MHC基因過度表達(dá)有關(guān)[17]，有研究[18]表明，以β-MHC為特征的心肌重構(gòu)，可促進(jìn)心力衰竭的病情進(jìn)展。其具體機(jī)制為：當(dāng)心肌細(xì)胞受到各種刺激后，心肌細(xì)胞內(nèi)包括β-MHC在內(nèi)的各種基因被激活，促使心肌肥厚表型的再表達(dá)[19]，從而導(dǎo)致心肌肥大，β-MHC蛋白增多使心肌肥厚、心肌纖維收縮力受損，進(jìn)而造成心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生持續(xù)性改變，心功能則因此明顯下降，從而導(dǎo)致并加重CHF。在心肌重構(gòu)的進(jìn)展過程中，心肌細(xì)胞會產(chǎn)生ANP、BNP，研究表明ANP、BNP與CHF程度呈正相關(guān)[20]，因此，該兩項(xiàng)指標(biāo)常用以評估CHF的進(jìn)展情況。

本研究采用縮窄腹主動脈法+丙基硫氧嘧啶灌胃建立CHF兔模型。CHF兔模型組β-MHC蛋白及mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01）;ANP、BNP水平明顯升高（P<0.01）;LVEF、LVFS、E/A顯著降低（P<0.01）;電鏡下示，模型組心肌超微結(jié)構(gòu)可見肌原纖維溶解、壞死，線粒體腫脹、變性，有空泡樣改變，線粒體膜不完整，心肌發(fā)生壞死、溶解。以上結(jié)果說明CHF兔模型心肌受損，心功能下降，CHF兔模型造模成功。用藥4周后，益心泰低、中、高劑量組和氯沙坦鉀組ANP、BNP降低（P<0.05），心肌組織β-MHC蛋白及mRNA表達(dá)降低（P<0.05），LVEF、LVFS、E/A升高（P<0.05），且電鏡結(jié)果顯示，心肌肌絲僅出現(xiàn)局灶性壞死、溶解，說明益心泰方可有效降低ANP及BNP水平，抑制心肌組織β-MHC蛋白及mRNA的表達(dá)，改善心肌超微結(jié)構(gòu)，提高心功能。

CHF的臨床癥狀與體征，與中醫(yī)學(xué)“心痹”“心水”“水腫”等病類似，故而往往從以上病癥論治。該病病性為本虛標(biāo)實(shí)，本虛主要為氣（陽）虛，標(biāo)實(shí)主要為血瘀、水濕[21]，因此，抓住其氣虛血瘀水停這一病機(jī)則是治療CHF的關(guān)鍵。針對這一病機(jī)，補(bǔ)益元?dú)?、活血化瘀、利水消腫為治療CHF的主要中醫(yī)治法。益心泰方主要由黃芪、丹參、紅花、葶藶子、澤瀉、豬苓等組成。該方中黃芪具有補(bǔ)氣溫陽、利水消腫之功，為益氣行水之要藥;人參為甘溫之品，具有補(bǔ)益元?dú)獾墓πВc黃芪相配伍，可增強(qiáng)益氣之功，共為君藥;丹參、紅花相配伍，具有活血化瘀通絡(luò)的作用，共為臣藥，與黃芪、人參合用，既可益氣，又可活血，使得血瘀得以消除，此為治療心衰之基礎(chǔ);茯苓、豬苓、澤瀉、葶藶子均為利水之要藥，可入上、中、下三焦而利三焦之水濕，與人參、黃芪相伍，化水濕而有力，進(jìn)而使得利水消腫之功得以增強(qiáng)，是為佐藥。全方相伍共奏補(bǔ)益元?dú)?、活血化瘀、利水消腫之功，達(dá)到元?dú)獬溆?、血行通暢、水瘀盡除的效果，從而改善心衰。

綜上所述，益心泰方可通過下調(diào)β-MHC mRNA及其蛋白表達(dá)水平，以改善心肌重構(gòu)，提高心功能，進(jìn)而延緩CHF進(jìn)程。這可能是益心泰方調(diào)節(jié)CHF的作用機(jī)制之一，但CHF的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)僅通過β-MHC蛋白這一主要指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)研究，尚不能完全解釋益心泰方的作用機(jī)制。故而對CHF的研究，應(yīng)逐步深入，選擇全面又密切相關(guān)的指標(biāo)，綜合闡釋益心泰方的作用機(jī)制。

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