獨山瓜馥木總生物堿抗結(jié)核活性初探

周 蕾，安婷婷，趙秀芹，徐冬蕾，蔣 毅，王瑞白，萬康林，楊再昌

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的傳染性疾病，是全球十大致死病因之一。耐藥結(jié)核病的增多更加重了疾病負擔[1]。2019年WHO全球結(jié)核病報告顯示全球大約有1 000萬結(jié)核病患者，死亡145萬，利福平耐藥結(jié)核病(Rifampin-resistant TB，RR-TB)患者人數(shù)約為48.4萬，其中耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant TB，MDR-TB)患者占78%，我國在全球30個結(jié)核病高負擔國家中RR-TB患者數(shù)位于世界第三[2-3]。非結(jié)分枝桿菌(Non-tuberculous mycobacteria，NTM)是除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和麻風分枝桿菌外的分枝桿菌的總稱。由其引發(fā)的疾病逐年增加，尤其是非結(jié)和結(jié)核分枝桿菌的混合感染在耐藥結(jié)核病中占到了30%以上，加重了結(jié)核的疫情和管理難度。

獨山瓜馥木主要分布于貴州獨山、安龍等地的山林中，是黔南地區(qū)的民族藥材，在民間用藥廣泛，常用根部來活血除濕，治療風濕和癆傷。本課題組的前期研究顯示從獨山瓜馥木提取的沒食子酸成分具有抗結(jié)核活性，并與異煙肼具有協(xié)同作用，可部分降低異煙肼的耐藥率[4]。提取的β-谷甾醇-9，12-十六碳二烯酸酯，可以促進休眠型結(jié)核分枝桿菌復(fù)蘇，和異煙肼聯(lián)用可以殺死休眠型結(jié)核分枝桿菌[5]。為確定從獨山瓜馥木中提取的總生物堿成分的抗結(jié)核活性及作為抗結(jié)核候選藥物進一步研發(fā)的意義，本實驗選取各耐藥類型的結(jié)核分枝桿菌及臨床常見非結(jié)核分枝桿菌對其抗分枝桿菌活性進行了全面的檢測和評價。

1 材料與方法

1.1實驗用菌株 實驗菌株來源于中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所結(jié)核病室菌株庫。23個菌株中包括19株結(jié)核分枝桿菌和4株臨床常見非結(jié)核分枝桿菌標準菌株(快生型非結(jié)分枝桿菌鳥結(jié)核分枝桿菌ATCC25291、胞內(nèi)分枝桿菌ATCC13950；慢生型非結(jié)分枝桿菌馬賽分枝桿菌DSM45103；膿腫分枝桿菌ATCC19977)。藥敏試驗中的18個結(jié)核分枝桿菌按耐藥類型分為2株全敏菌株(含標準菌株H37Rv)、4株異煙肼單耐藥菌株、4株利福平單耐藥菌株、4株耐多藥(Multidrug-resistant，MDR)菌株和4株泛耐藥(Extensively drug-resistant，XDR)菌株。除標準菌株外，均為我國臨床分離菌株。

1.2試劑和耗材 抗結(jié)核藥物購自美國Sigma公司；Middle brook 7H9 Agar、Mueller-Hinton Agar 和增菌液OADC購自BD公司；二甲基亞砜(DMSO)購自Amresco公司、Alarmar Blue 購自BIO-RAD公司；改良固體羅氏培養(yǎng)基購自珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司；薄層硅膠板 GF254、200-300目硅膠為中國青島海洋化工集團公司產(chǎn)品；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、碘化鉍鉀等為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 實驗方法

1.3.1獨山瓜馥木提取物的分離制備

1.3.1.1前處理 獨山瓜馥木根采自貴州省獨山縣，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院趙俊華教授鑒定。手工分揀、漂洗切塊后，自然干燥，粉碎。

1.3.1.2一次提取 10 kg原藥材，以6倍體積80%的乙醇，分批次回流提??；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(37 ℃)減壓蒸餾回收乙醇提取液，50 ℃水浴濃縮蒸干。以10%的乙醇再溶解提取物后，分別用1.5 倍體積的石油醚、乙酸乙酯和二氯甲烷對提取物多次萃取至無色，旋蒸萃取液，得到3種一次萃取物。

1.3.1.3活性跟蹤 將一次萃取物溶解，與羅氏培養(yǎng)基混合，制備成濃度為80 μg/mL的含藥培養(yǎng)基；取3～4滴結(jié)核分枝桿菌BCG菌株(麥氏濁度1.0)的新鮮培養(yǎng)物接種至含藥羅氏培養(yǎng)基斜面，37 ℃培養(yǎng)2～3周。菌落數(shù)≤5個視為有效。

1.3.1.4二氯甲烷提取物定性分析 將萃取出的二氯甲烷層點板進行薄層層析，二氯甲烷/甲醇(20/1)為展開劑展開完全后，用碘化鉍鉀顯色劑均勻噴灑薄層。

1.3.1.5二次提取 對1.3.1.2中獲得的二氯甲烷萃取物(組分1)進行二次分離純化。200-300目硅膠柱，石油醚∶乙酸乙酯(7∶3)洗脫分離生物堿類成分，得到組分2；甲醇沖洗硅膠柱，沖洗液過大孔樹脂，以50%乙醇為流動相分離苷類或者黃酮類成分，得到組分3。

1.3.2體外藥物敏感試驗

1.3.2.1菌液制備 分枝桿菌新鮮培養(yǎng)物，超聲分散。結(jié)核分枝桿菌至麥氏濁度1.0，取400 μL菌液加入7.60 mL 的7H9 (10% OADC)培養(yǎng)基中，制成8 mL菌液備用；非結(jié)分枝桿菌至麥氏濁度0.5，取20 μL菌液加入7.98 mL MH (10%OADC)中，制成8 mL菌液備用(快生型非結(jié)不加OADC)。

1.3.2.2藥液制備 藥物用適宜的溶劑(水或DMSO)配制成51.2 mg/mL的儲存液，再用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基2×倍比稀釋成梯度濃度。實驗藥物的濃度范圍為40～320 μg/mL，對照質(zhì)控藥物異煙肼和利福平為0.125～64 μg/mL，卡那霉素為1～128 μg/mL。

1.3.2.3藥敏檢測 取PCR8聯(lián)管，每孔中加入相應(yīng)備用菌液100 μL后，實驗藥物組再加入100 μL梯度藥液，生長對照組再加入100 μL無藥物的培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)。快生型非結(jié)在培養(yǎng)的第2 d，結(jié)核和慢長型非結(jié)在培養(yǎng)的第6 d開始在生長對照組的第一孔中加入70 μL Alarmar Blue顯色劑，24 h之后觀察變色情況。如顯色液從藍色變成紫紅色或粉色，說明細菌已經(jīng)生長，則在該菌株的實驗藥物組中每孔加入70 μL顯色液。若生長孔未出現(xiàn)顏色變化，則依次每日在生長對照孔中添加顯色劑，直至變色為止。最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)定義為實驗藥物組中顯色劑顏色完全沒有發(fā)生改變(即仍為藍色)的最小藥物濃度。每個菌株設(shè)3個重復(fù)，整體藥敏試驗重復(fù)2次。

2 結(jié) 果

2.1獨山瓜馥木的提取物 10 kg原藥材經(jīng)乙醇提取后獲得600 g提取物。一次提取分別獲得80 g石油醚層、120 g乙酸乙酯層和120 g二氯甲烷層萃取物，其中二氯甲烷萃取物在活性跟蹤實驗中的菌落數(shù)是3個，顯示其具有抗結(jié)核活性。二氯甲烷萃取物經(jīng)薄層層析和碘化鉍鉀顯色后出現(xiàn)橙紅色斑點，說明二氯甲烷萃取物中為總生物堿類物質(zhì)。二次提取分離，獲得9.3 g組分2和20.2 g組分3。

2.2提取物的抗結(jié)核活性 中藥相對毒性低，用量可以稍大，因此在本次實驗中設(shè)置了40、80、120、160、200、240、280和320 μg/mL 8個濃度梯度。藥敏實驗結(jié)果顯示(表1)，3種組分對非結(jié)分枝桿菌的MIC值都很高，在200 μg/mL以上，沒有很好的抑菌效果。3種組分對結(jié)核分枝桿菌的MIC值明顯低于非結(jié)分枝桿菌，都有一定程度的抑制作用，抑菌效果依次為組分2>組分1>組分3。值得注意的是，3個組分對耐藥株，無論是單藥耐藥株，還是MDR菌株的抑制效果都優(yōu)于全敏感菌株。尤其是組分2，其對43.75%(7/16)的耐藥株的MIC值低于最小檢測濃度。雖然組分3對3個菌株的MIC值為40 μg/mL，但可以看出它的抑菌效果比組分1差，因此在二氯甲烷萃取的基礎(chǔ)上進行石油醚/乙酸乙酯萃取能進一步提純抗結(jié)核有效成分，而50%乙醇的洗脫無效。

表1 獨山瓜馥木根提取物3個組分藥敏試驗結(jié)果Tab.1 MIC of three extracted components of Fissistigma cavaleriei root

3 討 論

結(jié)核病因為是胞內(nèi)感染，干酪樣病灶的疏水性等原因治療困難，即使是敏感性結(jié)核病，用有效的一線藥物治療也需要6個月的療程，而利福平耐藥和耐多藥結(jié)核病不僅療程更長，經(jīng)濟負擔更重(≥7 000元)，毒副作用更強外，治愈率僅有56%[7]。雖然當前有23個藥物、14個候選疫苗及各種組合治療方案處于臨床試驗階段，鑒于目前結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的全球流行形勢，對抗結(jié)核新藥的需求仍是非常迫切的。和西藥相比，中藥多采用湯劑口服的方式，較西藥的毒副作用小，療程長時病人的依從性也較好。且中藥都不是單一化合物，尤其是按照君、臣、佐、史進行配伍使用中藥方劑，其功效也不是單一的，在抗菌的同時，還可調(diào)節(jié)機體機能，有增強機體應(yīng)激能力、自我修復(fù)能力和免疫力的作用，是綜合性治療。因此近年來，許多傳統(tǒng)中藥進入了抗結(jié)核藥物研發(fā)的范疇，如苦參[6]和益母草[8]等。

獨山瓜馥木(Fissistigmacavaleriei(Lev.) Rehd.)屬于番荔枝科(Annonaceae)瓜馥木屬(Fissistigma)攀援灌木。瓜馥木屬植物分布廣泛，全株入藥，具有祛風活血，鎮(zhèn)痛的傳統(tǒng)功效，用于治療風濕骨痛，手足麻木，小兒麻痹后遺癥，小兒驚風和骨折水腫。近年的研究發(fā)現(xiàn)拓展了瓜馥木類植物的作用。研究表明瓜馥木中的內(nèi)酰胺堿可以抑制肺癌和多種實體瘤中腫瘤新生血管的增生，具有一定的抗腫瘤作用，且毒性低[9-10]。而瓜馥木中的總生物堿類以及氯仿萃取成分對香蕉炭瘟病菌(Glorospriummusαrum)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、梨褐斑病菌(Mycosphaerellasentina)、黑斑病菌(Alternariakikuchiana)、芒果葉枯病菌(Pestalotiacalabae)的等數(shù)種病原菌有明顯的抑菌作用[11]。

本次研究的結(jié)果初步顯示獨山瓜馥木中除前期研究的沒食子酸和β-谷甾醇-9，12-十六碳二烯酸酯外，二氯甲烷提取的總生物堿成分也具有一定的抗結(jié)核活性。在進一步的研究中，我們將進行總生物堿成分的結(jié)構(gòu)解析和擴大菌株量的更系統(tǒng)的體內(nèi)外藥效評價。與β-谷甾醇-9，12-十六碳二烯酸酯促進休眠型結(jié)核分枝桿菌復(fù)蘇的作用不同，總生物堿成分及結(jié)合石油醚/乙酸乙酯萃取進一步提純的組分2對單耐菌株和耐多藥菌株具有更好的抑制作用，在當下耐藥結(jié)核病流行的嚴重形勢下，這是其明顯的優(yōu)勢。獨山瓜馥木對結(jié)核分枝桿菌敏感和耐藥菌株的作用差異也提示除已知的耐藥機制外，還有其他未闡明的遺傳因素差異在結(jié)核耐藥中起作用。獨山瓜馥木總生物堿的作用靶點及機制值得進一步研究，可能會給抗結(jié)核藥物的研究提供新的靶點和途徑，進而促進全球遏止結(jié)核病計劃的實現(xiàn)。

利益沖突：無