MLVA分型在布魯氏菌臨床分離株中的應用探索

呂燕寧，陳麗娟，李仁清，孫玉蘭，陳艷偉，王全意

北京市預防醫(yī)學研究中心科研項目培育專項(No.2015-BJYJ-08)

布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布魯氏菌侵入機體而引起的一種世界范圍流行的人獸共患傳染病。人間布病為我國法定的乙類傳染病[1]。近年來全國布病疫情呈現(xiàn)逐年上升趨勢[2]，防控形勢十分嚴峻[3]。對布病病人進行正確、合理、及時的治療，同時追溯感染來源并對傳染源進行有效控制是布病防控中的重要環(huán)節(jié)。

布病的臨床表現(xiàn)多種多樣，而且許多癥狀沒有特異性，患病早期有發(fā)熱、出汗、渾身疼痛等癥狀，類似普通感冒或流感樣表現(xiàn)[4]。還有一些病人出現(xiàn)肝脾腫大、黃疸等表現(xiàn)，需要與病毒性肝炎相鑒別[5]。由于布魯氏菌致病的特殊免疫病理機制，布病在臨床上存在復發(fā)與重復感染，病人會出現(xiàn)二次或多次發(fā)病的現(xiàn)象。首次患布魯氏菌病后，在傳染源存在的情況下，可以再次或多次患病，除部分為復發(fā)外，不能排除二次感染發(fā)病[6]。對于二次或多次就診的患者而言，患者主訴多為乏力、出汗、肌肉關節(jié)疼痛，布病抗體檢測又一直呈陽性，所以臨床醫(yī)生很難分清患者是普通感冒，是風濕性關節(jié)炎，還是布病復發(fā)或是重復感染[7]。急性期布病患者治愈后又重新發(fā)病，是復發(fā)還是重復感染而再次生病，這是目前臨床上很難用實驗室手段來區(qū)分的，因為大多數(shù)布病患者血液中的抗體可以持續(xù)多年，且滴度較高。用血清學檢測難以區(qū)分復發(fā)或重復感染[7]。對于布病的復發(fā)與重復感染，在患者的臨床處置以及公共衛(wèi)生領域的傳染病疫情處置程序上均有不同，對于布病復發(fā)患者重在關注臨床治療，要考慮感染病原是否耐藥，是否需要改變治療方案以及患者對于治療的依從性如何等問題。而對于重復感染的患者則需考慮是否以及如何再次接觸了傳染源，并應及時采取措施控制或消除傳染源，切斷傳播途徑等。因此對這兩種情況的科學判斷不僅能給與布病患者以明確的診斷，為臨床用藥提供理論依據(jù)，對指導臨床合理用藥，減少過度治療和藥物毒副作用對人體的傷害，降低藥物異常反應的發(fā)生率[7]，有著指示性作用，對于及時追溯與控制傳染源，控制布病的流行也具有重要意義。

本文旨在探索利用布魯氏菌多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(MLVA)的分子分型方法對布病的復發(fā)與重復感染來進行鑒別。

1 材料與方法

1.1樣本及其病例基本信息 2014-2015年在北京某醫(yī)院收集了4例布病患者先后兩次發(fā)病后的血培養(yǎng)陽性樣本共8份。通過中國疾病預防控制信息系統(tǒng)以及醫(yī)院接診記錄收集病例的基本信息。

1.2主要試劑與儀器 Platinum PCR SuperMix(美國Invitrogen公司，貨號11306-016)，哥倫比亞血平板培養(yǎng)基(英國OXOID公司，貨號PB0123A)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；核酸自動電泳用卡夾(QIAxcel DNA Screening Kit)與QX Alignment Marker 15 bp/3 kb(德國QIAGEN公司，貨號分別為929004和929522),100 bp DNA Marker(美國NEB公司，貨號為N3231L)。

毛細管電泳儀QIAXCEL(德國QIAGEN公司)，iCycler普通PCR儀(美國Bio-Rad公司)，數(shù)控干浴器AccuBlock(美國Labnet公司)，貨號為D1100。數(shù)字振蕩培養(yǎng)箱(美國Labnet公司)。

1.3菌株分離及其DNA制備 將血培養(yǎng)陽性樣本接種于哥倫比亞血平板，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72 h后，刮取1～2接種環(huán)菌苔加入150 μL三餾水中，振蕩混勻制成菌懸液，100 ℃煮沸10 min；12 000 r/min離心10 min，取上清液于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4布魯氏菌屬及種/型鑒定 采用BCSP31-PCR法進行布魯氏菌屬的鑒定，采用AMOS-PCR法進行布魯氏菌種/型的鑒定，引物序列及PCR方法參見文獻[8]。

1.5菌株的MLVA-16分型鑒定 共選取16個VNTR位點進行PCR擴增,PCR引物序列及熒光標記參見文獻[9]，具體見表1。采用二重聚合酶鏈反應技術(PCR)擴增各VNTR位點。反應體系：8套二重PCR均采用25 μL反應體系，其中Platinum PCR SuperMix預混液21 μL，2對混合引物(10 μm)2 μL，模板2 μL。擴增條件：預變性95 ℃ 4 min，變性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃ 7 min延伸。擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行STR(short tandem repeat)檢測，確定片段大小，計算該片段的重復單元數(shù)。逐個計算菌株每個位點的串聯(lián)重復序列數(shù)目；將每個菌株的16個位點的串聯(lián)重復序列數(shù)目輸入到布魯菌MLVA數(shù)據(jù)庫http://mlva.u-psud.fr/mlvav4/genotyping/index.php中進行比較，確定菌株基因型別。

2 結(jié) 果

2.14例病例的基本信息 見表2。

2.2菌株分離及其布魯氏菌屬及種/型鑒定結(jié)果 4個病例兩次發(fā)病的采樣時間及其血培養(yǎng)報陽時間見表3，血培養(yǎng)報陽后將培養(yǎng)物接種血平板分離培養(yǎng)3 d得到菌株。8株菌經(jīng)BCSP31-PCR擴增后，均出現(xiàn)223 bp條帶,鑒定為布魯氏菌。擴增結(jié)果見圖1。8株菌經(jīng)AMOS-PCR擴增后，均出現(xiàn)178/731 bp大小的目的條帶，鑒定為羊種布魯菌。擴增結(jié)果見圖2。

表1 MLVA-16分型引物Tab.1 Primers for MLVA-16 genotyping

表2 病例基本信息Tab.2 Basic information of the cases

表3 病例兩次發(fā)病采樣時間與血培養(yǎng)報陽時間Tab.3 Sampling time and blood culture positive report time in two onset of the cases

S1-S8為編號S1至S8的菌株，M為NEB 100 bp Marker。圖1 S1-S8菌株BCSP31-PCR擴增結(jié)果Fig.1 BCSP31-PCR amplification results of S1-S8 strains

S1-S8為編號S1至S8的菌株，M為NEB 100 bp Marker。圖2 S1-S8菌株AMOS-PCR擴增結(jié)果Fig.2 AMOS-PCR amplification results of S1-S8 strains

2.3分離菌株的MLVA-16分型鑒定結(jié)果 8株菌按照每個位點上能夠擴增出的基因片段大小及其重復片段的大小換算重復片段的個數(shù)見表。MLVA-16分型的Panel 1包括8個位點：Bruce06、08、11、12、42、43、45、55，Panel 2A包括3個位點：Bruce18、19、21，Panel 2B包括5個位點：Bruce04、07、09、16、30。結(jié)果顯示，變異最大的位點是Panel 2B的Bruce04，其次為Panel 1的Bruce43位點和Panel 2B的Bruce16位點。通過MLVA-16分型方法可將8株布魯氏菌分為7種不同的基因型，在數(shù)據(jù)庫中均不能找到完全對應的基因型，故自定義為1-7型。按照Panel 1的結(jié)果分型可分為3種基因型：3個基因型均在數(shù)據(jù)庫中存在，分別為42(1-5-3-13-2-2-3-2，N=4)，63(1-5-3-13-2-3-3-2，N=2)，114(1-5-3-13-2-1-3-2，N=2)，各菌株16個位點的重復單元個數(shù)見表4。結(jié)果顯示，4個病例中有1例兩次發(fā)病時間間隔較短的患者的兩株分離菌株的MLVA-16分型完全一致，提示為復發(fā)。另外3例兩次發(fā)病時間間隔較長的病人前后兩次發(fā)病分離到的菌株的MLVA-16分型是不同的，分別各有一個位點的差異，其中兩位病人的差異在Bruce04位點，1例病人的差異在Bruce16位點。

表4 8株布魯菌分離株MLVA-16基因分型Tab.4 MLVA-16 genotyping of 8 Brucella isolates

3 討 論

在很多國家，布病都被認為是重大公共衛(wèi)生問題。盡管該病的病死率極低，但嚴重威脅著動物飼養(yǎng)、獸醫(yī)、肉品加工等從業(yè)人員的身體健康，并給畜牧生產(chǎn)造成重大損失，還會影響旅游業(yè)及國際貿(mào)易的發(fā)展[10]。

人感染布魯氏菌可累及全身多個組織器官,臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、多汗、乏力、關節(jié)肌肉疼痛等,急性期可以治愈,但不易被確診,常遷延為慢性感染,慢性期布病患者可有肝、脾及睪丸腫大,關節(jié)和脊柱強直,肌腱攣縮變硬等,很難治愈,如引起腦炎和心肌炎者可致命,嚴重影響人類健康[8]。由于布魯氏菌感染機體后特殊的免疫病理反應，布病患者存在復發(fā)和重復感染的現(xiàn)象。而鑒別復發(fā)和重復感染，無論是對指導布病患者的治療，還是對布病患者的感染來源進行追溯和管理都具有重要的意義。

目前臨床上布病的檢測主要使用血清學檢驗技術，診斷也主要依賴于血清抗體的檢測結(jié)果。但血清學檢測方法無法鑒別復發(fā)和重復感染，也無法對布病進行病原學分型以及感染來源的追蹤溯源。人布魯氏菌病診斷的金標準是從感染者的血液或者其他臨床樣本中分離出布魯氏菌，對分離的病原進行病原學特征的分析對病人的診斷具有重要意義。目前布魯氏菌的分型方法有很多種，各有優(yōu)缺點。MLVA分型由于具有快速、操作簡單、成本低廉、重復性好的優(yōu)點，可鑒別到生物型水平，且便于實驗室之間進行比較等特點，使用較為廣泛。MLVA分型方法由Le Fleche等[11]提出，方案是對15個位點進行分析。之后，Al-Dahouk等人在此基礎上增加了Bruce19位點[12]，將其調(diào)整為16個位點。其中Panel 1包括Bruce 06、08、11、12、42、43、45和55共8個位點，適用于布魯氏菌種間比較；Panel 2A包括Bruce 18、19和21共3個位點，Panel 2B包括Bruce 04、07、09、16和30共5個位點，Panel 2適合用于基因型的比較。

Garcia-Yoldi D等[13]研究認為，MLVA是唯一一種能揭示布病暴發(fā)和確定儲存宿主的方法。該方法還可作為流行病學調(diào)查的工具，用來確定傳染源及傳播途徑，并找到菌株之間的關聯(lián)[14]，通過對菌株進行聚類分析，得知感染來源是否相關[15]。本研究利用MLVA-16的分型方法對來源于4例先后兩次發(fā)病的布病患者的8株分離菌株進行鑒定分析，探索該方法對布病復發(fā)和重復感染的鑒別診斷意義。

本研究首先采用BCSP31-PCR方法確定了8株分離菌株均為布魯氏菌；通過AMOS-PCR方法確定了其均為羊種布魯氏菌。再通過MLVA-16方法將收集到的8株菌株分為了7種基因型。沒有任何一株可以和布魯氏菌MLVA數(shù)據(jù)庫中的菌株相匹配。我們認為這主要是由于數(shù)據(jù)庫中的大部分數(shù)據(jù)都是由外國學者研究、上傳的。因不同地區(qū)，不同地域流行的布魯氏菌菌株不同，因此出現(xiàn)了基因型沒有對應的情況，且從20世紀60年代中期至今，北京地區(qū)未曾系統(tǒng)開展布病細菌學方面的研究工作，布病的病原學資料為空白。因此確實存在北京地區(qū)布魯菌菌株和其他地區(qū)區(qū)別較大的可能。此外，沒有在數(shù)據(jù)庫中找到相對應的菌株也從另一方面說明北京地區(qū)的布魯氏菌型別的分布和其他地區(qū)可能存在較大的區(qū)別[16]。

MLVA-16結(jié)果分析顯示，8株菌Panel 2B的Bruce04位點VNTR個數(shù)的變化最大，該位點多樣性最高，其分辨率也最高。其次是Panel 1的Bruce43和Panel 2B的Bruce16位點，而其他位點多樣性較低，這與很多研究結(jié)果一致[17-21]。1、3、4號患者于不同時間、兩次發(fā)病后分離的菌株S1和S2、S5和S6、S7和S8 6株菌株的MLVA-16分型均不同。S1和S2、S5和S6、S7和S8各分別相差1個位點，提示患者二次發(fā)病為重復感染，而非復發(fā)。而2號患者的前后兩次發(fā)病分離到的菌株MLVA-16分型完全一致，提示該患者的再次發(fā)病為復發(fā)，Kilic S.等人的研究也認為同一患者初次發(fā)病與復發(fā)分離到的菌株，其MLVA-16的分型是一致的[22]。有研究顯示布病復發(fā)多發(fā)生在首次發(fā)病治愈后的半年之內(nèi)[6]，而2號患者兩次發(fā)病的時間間隔為112 d，在3～4個月之間，也提示其二次發(fā)病為復發(fā)而非重復感染。1、3、4號患者的二次發(fā)病時間分別為237、276和234 d，為8～9月左右，兩次發(fā)病的時間間隔較長，這也提示其二次發(fā)病為重復感染的可能性較大。有研究認為首發(fā)布病以發(fā)燒、發(fā)冷、出汗、頭痛、頭暈癥狀為主，關節(jié)疼痛癥狀較輕，復發(fā)性布病的臨床癥狀則與前者相反[6]。也有學者認為復發(fā)為布病的慢性化，而重復感染則為急性布病的表現(xiàn)，二者在實驗室檢查上很難做鑒別，但二者的臨床表現(xiàn)是有明顯不同的，臨床醫(yī)生需要對就診的布病患者進行詳細深入的詢問，耐心細致的檢查，才會在相關的癥狀、體征上發(fā)現(xiàn)一些差別，從而做出鑒別[7]。本研究的結(jié)果表明，如果能夠從患者體內(nèi)分到病原，結(jié)合臨床表現(xiàn)，發(fā)病時間間隔、以及流行病學史等多方面的信息，對分離株的病原學特征進行分析有助于對布病的復發(fā)和重復感染進行鑒別診斷，MLVA-16分型方法對不同菌株之間的差異具有較高的分辨率，可作為布病復發(fā)和重復感染鑒別診斷的有效手段之一。

利益沖突：無