四味穿心蓮散中大青葉的薄層色譜定性鑒別方法

班燕桃，嚴(yán) 明，嚴(yán) 寒，單乃榮，吳 濤，陳 幸，陳寶宇

(廣西獸藥監(jiān)察所，南寧 530001)

四味穿心蓮散是由穿心蓮、辣蓼、大青葉、葫蘆茶四味中藥材經(jīng)粉碎、過篩、混勻制成的，收載于《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部的成方制劑，具有清熱解毒、除濕化滯的功能，主要用于泄痢和積滯的治療[1]。在目前的質(zhì)量控制方法中，收載了3味中藥的顯微特征鑒別和穿心蓮的薄層鑒別方法。組方中的大青葉為十字花科植物菘藍(lán)IsatisindigoticaFort.的干燥葉，主要化學(xué)成分為吲哚類、喹唑酮類、芥子苷類、有機(jī)酸類和氨基酸類化合物等[2]，大青葉抗氧化活性成分主要集中在極性較低的化學(xué)組分中，其主要有效成分為吲哚類、喹唑酮類和有機(jī)酸類化合物，糖類和氨基酸類化合物的抗氧化活性較弱[3]。藥理研究表明，其具有較強(qiáng)的抗菌、抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、解熱、抗炎、利膽等作用[4]。為了完善本產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法，提高產(chǎn)品質(zhì)量，本文對(duì)組方中大青葉的薄層鑒別方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明所建立的方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，可以作為該散劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 儀器 上海精密科學(xué)儀器有限公司YP802N電子天平，感量0.01 g；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器；微量移液器5 μL，美國(guó)Drummond Microcaps?微量毛細(xì)管；硅膠G薄層板(200 mm×200 mm，MERCK公司，批號(hào)：HX87777184)；雙槽玻璃層析缸。

1.2 試劑 大青葉對(duì)照藥材(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)121367-201403)、甲醇、環(huán)己烷、丙酮、三氯甲烷均為分析純。

1.3 供試品 自配四味穿心蓮散樣品1批，從廣西玉林市藥材市場(chǎng)購(gòu)進(jìn)原料藥材，按《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部收載的藥材標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)符合規(guī)定。按成方制劑四味穿心蓮散的處方投料，混合粉碎，過二號(hào)篩，混勻，即得。分別派員監(jiān)制獲得企業(yè)A樣品，批號(hào)20170901、20170902、20170903；企業(yè)B樣品，批號(hào)20171001、20171002、20171003；企業(yè)C樣品，批號(hào)20171201、20171202、20171203。

1.4 陰性對(duì)照樣品 未添加大青葉的“四味穿心蓮散”同供試品制法制得。

1.5 供試品溶液的制備 取供試品2.5 g，加甲醇30 mL，浸泡30 min，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL溶解，作為供試品溶液。

1.6 對(duì)照品藥材溶液的制備 取大青葉對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇30 mL，浸泡30 min，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

1.7 陰性對(duì)照溶液的制備 取不含大青葉的“四味穿心蓮散”陰性對(duì)照樣品2.5 g，按照1.5項(xiàng)下的方法，制成陰性對(duì)照溶液。

1.8 薄層鑒別與檢視方式 吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶9∶0.5)為展開劑，預(yù)飽和30 min，展開，取出，立即觀察。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同的藍(lán)色斑點(diǎn)和淺紫紅色斑點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

按獸用中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則進(jìn)行方法驗(yàn)證，結(jié)果如下。

2.1 重復(fù)性試驗(yàn) 采用3家企業(yè)各3批供試品，按1.5項(xiàng)下制成供試品溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，圖1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法重復(fù)性好，溶液中待測(cè)成分穩(wěn)定。

1.陰性樣品(缺大青葉) 5μL；2.大青葉對(duì)照藥材5μL；3-5.企業(yè)B供試品(20171001、20171002、20171003) 5μL；6-8.企業(yè)A供試品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企業(yè)C供試品(20171201、20171202、20171203) 5μL；12.自制樣品 5μL1.Negative sample without Isatidis Folium 5μL；2.Isatidis Folium control herbs 5μL；3-5.Test article of B factory (20171001、20171002、20171003) 5μL；6-8.Test article of A factory (20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.Test products of C factory (20171201、20171202、20171203) 5μL；12.Self made sample 5μL圖1 薄層板(MERCK)Fig 1 TLC (MERCK)

2.2 重現(xiàn)性試驗(yàn) 在不同實(shí)驗(yàn)室復(fù)核結(jié)果中，在使用規(guī)格為(100 mm×200 mm)的薄層板時(shí)，青島海洋化工廠分廠(批號(hào)20160402)和煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所(批號(hào)111218)的分離效果好，分別顯相同的藍(lán)色斑點(diǎn)和淺紫紅色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾(圖2、圖3)，使用MERCK公司薄層板(批號(hào)HX61216826)時(shí)，當(dāng)上行展開7 cm，存在斑點(diǎn)前沿稍滯后，靛玉紅斑點(diǎn)分離良好，靛藍(lán)斑點(diǎn)與其他斑點(diǎn)有時(shí)不能完全分離，會(huì)影響結(jié)果判定(圖4)，在實(shí)驗(yàn)時(shí)可適當(dāng)伸長(zhǎng)展距，得到良好的分離效果。

2.3 耐用性試驗(yàn) 此薄層色譜鑒別方法在相同來(lái)源不同批號(hào)(青島海洋化工廠分廠：20170410、20180616、20181212)和相同規(guī)格(100 mm×200 mm)不同來(lái)源的薄層板(手工鋪制：20190220、青島海洋化工廠分廠：20180616、煙臺(tái)市化學(xué)化工研究所：20181109)上的分離效果相近，分別顯相同的藍(lán)色斑點(diǎn)和淺紫紅色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。在不同溫度、濕度條件下，色譜圖的分離效果相近，表明該展開條件受溫度濕度的影響較小，可靠性強(qiáng)。

1.陰性樣品(缺大青葉) 5 μL；2.大青葉對(duì)照藥材5 μL；3-5.企業(yè)B供試品(20171001、20171002、20171003) 5μL；>6-8.企業(yè)A供試品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企業(yè)C供試品(20171201、20171202、20171203) 5 μL；12.自制樣品5 μL;1. Negative sample without Isatidis Folium 5 μL；2.Isatidis Folium control herbs 5 μL；3-5.Test article of B factory (20171001、20171002、20171003)5μL； 6-8.Test article of A factory(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.Test products of C factory (20171201、20171202、20171203)5 μL；12.Self made sample 5μL圖2 薄層板(青島海洋化工廠分廠)Fig 2 TLC (Qingdao Ocean Chemical Plant Branch)

1.陰性樣品(缺大青葉) 5 μL；2.大青葉對(duì)照藥材5 μL；3-5.企業(yè)B供試品(20171001、20171002、20171003) 5 μL；6-8.企業(yè)A供試品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企業(yè)C供試品(20171201、20171202、20171203) 5 μL；12.自制樣品5 μL;1.Negative sample without Isatidis Folium 5 μL；2.Isatidis Folium control herbs 5 μL； 3-5.Test article of B factory (20171001、20171002、20171003)5 μL；6-8.Test article of A factory(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.Test products of C factory(20171201、20171202、20171203)5 μL；12.Self made sample 5 μL圖3 薄層板(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所)Fig 3 TLC (Yantai Institute of chemical industry)

1.陰性樣品(缺大青葉) 5 μL；2.大青葉對(duì)照藥材5 μL；3-5.企業(yè)B供試品(20171001、20171002、20171003) 5 μL；6-8.企業(yè)A供試品(20170901、20170902、20170903)5μL；9-11.企業(yè)C供試品(20171201、20171202、20171203) 5 μL；12.自制樣品5 μL1.Negative sample without Isatidis Folium 5 μL；2.Isatidis Folium control herbs 5 μL；3-5.Test article of B factory(20171001、20171002、20171003)5 μL；6-8.Test article of A factory(20170901、20170902、20170903)5 μL；9-11.Test products of C factory(20171201、20171202、20171203)5 μL；12.Self made sample 5 μL圖4 薄層板(MERCK)Fig 4 TLC (MERCK)

3 討論與結(jié)論

3.1 提取方法的優(yōu)化 按《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部第29頁(yè)中收載的大青葉薄層鑒別方法(2)進(jìn)行驗(yàn)證，色譜結(jié)果中供試品與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，展開結(jié)果靛藍(lán)斑點(diǎn)位置上無(wú)干擾，靛玉紅斑點(diǎn)有黃綠色雜質(zhì)干擾。在供試品溶液的制備方法中考察了不同溶劑、溶劑用量比例及提取方式：①取樣品加三氯甲烷超聲提取，濾過，濾液蒸干，三氯甲烷溶解作為供試品溶液；②取樣品加無(wú)水乙醇超聲提取，濾過，濾液蒸干，三氯甲烷溶解作為供試品溶液；③取樣品加甲醇超聲提取[5]，濾過，濾液蒸干，三氯甲烷溶解作為供試品溶液；④取樣品加甲醇浸泡[6]30 min再超聲提取，濾過，濾液蒸干，三氯甲烷溶解作為供試品溶液。結(jié)果以方法④效果較好。選擇甲醇作為本研究的提取溶劑，主要考慮到用量比較大，且甲醇屬于低毒毒性，穩(wěn)定性良好，而氯仿毒性較強(qiáng)，也有文獻(xiàn)報(bào)道靛玉紅在氯仿溶劑中穩(wěn)定性較差[7]，同時(shí)也改善樣品溶液的粘稠度，易于點(diǎn)樣。

3.2 展開劑的優(yōu)化 展開劑考察中進(jìn)行了苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶1)[1,8]、苯-三氯甲烷-丙酮(5∶4∶2)[9]、環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶8∶0.5∶1)、環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶8∶1∶1)、環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶8∶1)、環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶9∶0.5)等試劑不同配比試驗(yàn)研究，因?yàn)楸降亩拘源?，長(zhǎng)期使用會(huì)對(duì)檢測(cè)工作人員的身體健康造成危害，也會(huì)對(duì)環(huán)境造成一定影響，所以最終選擇低毒的環(huán)己烷代替苯作為展開劑的一種。結(jié)果表明前五種配比試驗(yàn)樣品斑點(diǎn)有干擾，色譜分離度較差，不予采用，而以環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮(4.8∶9∶0.5)作為展開劑得到的色譜分離度及斑點(diǎn)相對(duì)位置重現(xiàn)性好。為避免產(chǎn)生邊緣效應(yīng)，本展開劑系統(tǒng)應(yīng)至少飽和半個(gè)小時(shí)，展開時(shí)應(yīng)保持密閉狀態(tài)。

3.3 薄層板的選擇 參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》中大青葉藥材的薄層鑒別方法選擇使用硅膠G薄層板，在重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)使用規(guī)格為100 mm×200 mm MERCK薄層板時(shí)，出現(xiàn)影響結(jié)果判定的現(xiàn)象(圖4)。MERCK板是進(jìn)口產(chǎn)品，購(gòu)買時(shí)間較長(zhǎng)，相對(duì)其他板價(jià)格昂貴，目前采用進(jìn)口板的實(shí)驗(yàn)室相對(duì)比較少。而使用青島海洋化工廠分廠和煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所薄層板時(shí)，達(dá)到很好的分離效果，重現(xiàn)性較好，陰性無(wú)干擾(圖2、圖3)。這兩種板屬于國(guó)內(nèi)生產(chǎn)產(chǎn)品，在市面上容易購(gòu)得，價(jià)格也比較實(shí)惠，可以降低分析成本，得到大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的青睞。雖有瑕疵，但對(duì)方法使用影響較小。

3.4 對(duì)照藥材的選擇 由于我國(guó)南北緯度、氣候等因素差異較大，不同產(chǎn)地生產(chǎn)的大青葉外觀品質(zhì)和質(zhì)量之間會(huì)有很大差異，從而引起有效成分種類和成分間配比的變化[10]。由于樣品提取成分復(fù)雜，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分別采用大青葉對(duì)照藥材與靛藍(lán)、靛玉紅對(duì)照品作為質(zhì)控指標(biāo)相比較，在薄層鑒別上采用大青葉對(duì)照藥材作為質(zhì)控指標(biāo)產(chǎn)生靛藍(lán)、靛玉紅斑點(diǎn)大小合適，顏色清晰，專屬性強(qiáng)，可同時(shí)解決復(fù)方組成藥味的真?zhèn)?或有無(wú))和優(yōu)劣(或劑量)等問題，已達(dá)到質(zhì)量控制的效果，所以選用大青葉對(duì)照藥材為參照。由于靛藍(lán)易氧化褪色，薄層板取出后應(yīng)立即觀察。

本研究建立了四味穿心蓮散中大青葉的薄層色譜鑒別方法，說明四味穿心蓮散的質(zhì)量可控，且方法簡(jiǎn)便，方法專屬性強(qiáng)，可為建立和完善四味穿心蓮散中大青葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。