UPLC-PDA法測定甘草浸膏中甘草苷和甘草酸的含量

魏秀麗，張傳津*，馮言言，崔 進，李有志，徐恩民

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗所,山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測與風(fēng)險評估重點實驗室,動物源細菌耐藥性監(jiān)測與精準化用藥山東省工程實驗室,山東省動物用中藥制劑工程實驗室，濟南 250022；2.齊魯動物保健品有限公司，濟南 250100)

甘草浸膏活性成分主要包括甘草苷、甘草酸，在人醫(yī)臨床用于治療支氣管哮喘、咽炎、支氣管炎等；在獸醫(yī)臨床也用于緩解改善動物呼吸道疾病的癥狀，主要功效為祛痰止咳，也是制作甘草顆粒、甘草流浸膏等的原料。在中國藥典和獸藥典等文獻中甘草浸膏或其他甘草制劑對甘草苷、甘草酸的含量測定均采用普通高效液相色譜方法[1-7]，檢測時間長。本實驗研究了超高效液相色譜-二極管陣列檢測法(UPLC-PDA)測定甘草浸膏中甘草苷和甘草酸的含量，簡單快速，經(jīng)濟環(huán)保。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 甘草酸銨對照品，批號11073-2017020，含量97.7%，中國食品藥品檢定研究院。甘草苷對照品，批號111610-201005，含量94.9%，中國藥品生物制品檢定所。乙腈、冰醋酸、醋酸銨均為色譜純；乙醇分析純；超純水。甘草浸膏，來自獸藥生產(chǎn)企業(yè)報批產(chǎn)品。

1.2 儀器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀，美國Waters 公司；Waters2695高效液相色譜儀，美國Waters 公司。

1.3 方法

1.3.1 供試品溶液制備 精密稱取本品研細后的粉末，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2 標準儲備液的制備 精密稱取甘草苷對照品0.02012 g，置50 mL量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密稱取甘草酸銨對照品(折合甘草酸為0.01959 g)，置100 mL量瓶中，加70%乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻。

1.3.3 標準工作液的制備 取兩種儲備液適量，配置成混合對照品溶液：每1 mL含甘草苷200 μg、甘草酸20 μg的溶液。依次倍比稀釋得一系列標準曲線工作液：10 μg/mL甘草苷100 μg/mL甘草酸、5 μg/mL甘草苷50 μg/mL甘草酸、2 μg/mL甘草苷20 μg/mL甘草酸、1 μg/mL甘草苷10 μg/mL甘草酸、0.5 μg/mL甘草苷5 μg/mL甘草酸、0.2 μg/mL甘草苷2 μg/mL甘草酸。

1.3.4 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱：T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；以乙腈為流動相A，0.1%冰乙酸+5 mmol/L醋酸銨為流動相B，按表1規(guī)定進行梯度洗脫；二極管陣列檢測器，掃描范圍190～400 nm，檢測波長232 nm，柱溫35 ℃，進樣室溫度10 ℃，流速為0.35 mL/min，進樣量1 μL。

1.3.5 重復(fù)性試驗和精密度試驗 精密吸取甘草苷對照品溶液和甘草酸對照品溶液，制成每1 mL含甘草苷10 μg、甘草酸100 μg的混合對照品溶液，重復(fù)配置6份，進樣，計算甘草苷、甘草酸峰面積RSD。

精密吸取甘草苷對照品溶液和甘草酸對照品溶液，制成每1 mL含甘草苷10 μg、甘草酸100 μg的混合對照品溶液，重復(fù)進樣6次，計算甘草苷、甘草酸峰面積RSD。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition

1.3.6 檢測限和定量限的測定 對甘草苷、甘草酸的標準工作液進行UPLC分析，并逐級降低其濃度，以溶液檢測時的信噪比(S/N)分別大于等于3和10 作為藥物的檢測限和定量限。

1.3.7 不同色譜條件樣品檢測比較 使用高效液相色譜儀(參照中華人民共和國獸藥典2015年版甘草浸膏質(zhì)量標準色譜條件[1], 流速1.0 mL/min；進樣量10 μL)和超高效液相色譜儀在不同的色譜條件下運行，對同一樣品中兩主成分甘草苷、甘草酸的含量和出峰時間分別進行比較。

1.3.8 穩(wěn)定性試驗 進樣室溫度設(shè)置到10 ℃。取1.3.5項下10 μg/mL甘草苷100 μg/mL甘草酸溶液，在10 ℃放置3、6、12、24 h，各進樣1 μL，計算甘草苷、甘草酸各自的峰面積RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 在優(yōu)化的色譜條件下，測得甘草苷、甘草酸色譜峰峰形良好，且均達到基線分離，在1.3.4項條件下，甘草苷、甘草酸對照品和甘草浸膏樣品待測液色譜保留時間為3.17、8.95 min左右，分離度均滿足要求。

2.2 線性 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離目的峰，甘草酸在10～200 μg/mL范圍內(nèi)的標準曲線：y=1167.9x+1986.4，R2>0.999；甘草苷在 1～20 μg/mL范圍內(nèi)的標準曲線：y=7348.3x+1104.8，R2=0.999。

理論塔板數(shù)：甘草酸、甘草苷均大于20000，分離度大于4.9，對稱因子1.1。校正曲線見圖1-圖2。

圖1 甘草苷標準曲線Fig 1 Standard curve of liquiritin

圖2 甘草酸標準曲線Fig 2 Standard curve of glycyrrhizic acid

2.3 重復(fù)性試驗和精密度試驗 配制10 μg/mL甘草苷100 μg/mL甘草酸對照品溶液，重復(fù)配置6份，進樣，計算甘草苷、甘草酸峰面積RSD分別為0.53%、0.48%，滿足實驗要求。

取10 μg/mL甘草苷100 μg/mL甘草酸對照品溶液，重復(fù)進樣6次，計算甘草苷、甘草酸峰面積RSD分別為0.41%、0.39%，滿足實驗要求。

2.4 檢測限和定量限 0.5 μg/mL甘草苷5 μg/mL甘草酸對照品溶液信噪比大于3為檢出限，1 μg/mL甘草苷10 μg/mL甘草酸對照品溶液信噪比大于10為定量限。

2.5 不同色譜條件樣品檢測結(jié)果比較 不同波長下的主成分響應(yīng)值的比較見表2。通過響應(yīng)值比較及光譜圖各成分的最大吸收波長，并顧及兩種成分的峰面積平衡，選擇232 nm。色譜圖見圖3-圖13。

表2 不同波長下的主成分相應(yīng)情況Tab 2 Principal component response at different wavelengths

圖3 對照品20μg/mL甘草苷200μg/mL甘草酸UPLC色譜圖(252 nm)Fig 3 UPLC chromatogram of reference solution of 20μg/mL Liquiritin and 200μg/mL glycyrrhizic acid

圖4 對照品20μg/mL甘草苷200 μg/mL甘草酸UPLC色譜圖(232 nm)Fig 4 UPLC chromatogram of reference solution of 20 μg/mL Liquiritin and 200 μg/mL glycyrrhizic acid

圖5 對照品 20μg/mL甘草苷200μg/mL甘草酸UPLC色譜圖(237 nm)Fig 5 UPLC chromatogram of reference solution of 20μg/mL Liquiritin and 200μg/mL glycyrrhizic acid

圖6 對照品 20 μg/mL甘草苷200 μg/mL甘草酸HPLC色譜圖(237 nm)Fig 6 UPLC chromatogram of reference solution of 20μg/mL Liquiritin and 200μg/mL glycyrrhizic acid

圖7 樣品1 UPLC色譜圖(252 nm)Fig 7 UPLC chromatogram of sample 1

圖8 樣品1 UPLC色譜圖(232 nm)Fig 8 UPLC chromatogram of sample 1

圖9 樣品1 UPLC色譜圖(237 nm)Fig 9 UPLC chromatogram of sample 1

圖10 樣品1 HPLC色譜圖(237 nm)Fig 10 HPLC chromatogram of sample 1

圖11 樣品2 UPLC色譜圖(232 nm)Fig 11 UPLC chromatogram of sample 2

圖12 樣品2色譜圖UPLC(237 nm)Fig 12 UPLC chromatogram of sample 2

圖13 樣品2色譜圖UPLC(252 nm)Fig 13 UPLC chromatogram of sample 2

使用Waters超高效液相色譜儀(本實驗色譜條件見1.3.4)和高效液相色譜儀(見1.3.7)，對同一樣品中按濕品計算兩主成分甘草苷、甘草酸的含量分別進行了比較，無顯著差異，相對偏差均小于1%，表明本實驗方法簡單可行，結(jié)果精確可靠。結(jié)果見表3。

表3 不同色譜條件檢測結(jié)果 (n=4)Tab 3 Test results using different chromatographic method (n=4)

由于兩種色譜方法均已通過其方法學(xué)驗證，均可以準確控制其指標成分。從檢測效率上看，優(yōu)選超高效法(UPLC)，各色譜圖見圖3-圖10。從樣品噪音和峰形分離度等方面來看，優(yōu)選超高效液相色譜儀條件，背景更干凈，與雜質(zhì)峰的分離度更好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 按照實驗方法，將對照品溶液貯存一段時間后進樣，所得到的圖譜中甘草苷、甘草酸峰面積RSD分別為0.38%、0.46%，說明樣品穩(wěn)定，滿足實驗要求。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測波長的選擇 本研究將甘草苷、甘草酸的對照溶液利用PDA檢測器采集其光譜圖，在波長190～400 nm范圍內(nèi)進行掃描，發(fā)現(xiàn)甘草苷在232 nm處有最大吸收，甘草酸在252 nm處有最大吸收，根據(jù)光譜圖可以判斷含有主成分,能替代藥典中2項鑒別：顏色反應(yīng)和薄層鑒別，而且快速，不需要繁雜的處理過程，減少了硫酸、正丁醇、乙酸乙酯等多種提取溶劑和薄層展開溶劑，可以節(jié)約數(shù)小時提取、展開、噴霧等所需要的工作量。

參考獸藥典含量測定項中選用的波長237 nm，在本實驗中選擇232、237、252 nm分別采集色譜圖考察其峰面積響應(yīng)、對稱因子以及分離度等，由于甘草苷的響應(yīng)值較低，最終選擇232 nm作為檢測波長。光譜圖見圖14-圖15。兩者保留時間分別為3.2、8.9 min。

3.2 流動相流速的比較 超高效液相流動相的流速為0.35 mL/min，需要運行11 min，每針運行需要3.85 mL流動相；高效液相色譜儀器流速為1.0 mL/min，運行時間50 min，每針運行需要50 mL流動相。超高效液相色譜更節(jié)約實驗耗材溶劑等，每運行一針流動相節(jié)省46.15 mL。在廢液處理高成本的今天，超高效液相色譜方法更有優(yōu)勢，更經(jīng)濟快捷。

3.3 本方法與藥典方法的結(jié)果對比 本實驗選擇了兩個企業(yè)的甘草浸膏進行含量測定，分別采用高效液相色譜方法和超高效液相色譜方法，甘草浸膏甘草苷和甘草酸含量相對偏差均小于1%，本方法運行一針需要11 min，比藥典方法50 min節(jié)約了39 min的時間，大大提高檢測效率。

本實驗建立了超高效液相色譜法對甘草浸膏中甘草苷和甘草酸進行定性和定量測定，具備精準快捷、經(jīng)濟環(huán)保的特點，可以作為企業(yè)內(nèi)控標準方法，有效控制甘草浸膏質(zhì)量。

圖14 甘草苷對照溶液光譜圖Fig 14 Control solution spectrum of liquiritin

圖15 甘草酸對照溶液光譜圖Fig 15 Control solution spectrum of glycyrrhizic acid