博落回中四種生物堿的薄層鑒別研究

陳燕樂，楊廣民，唐昭山，2，曾建國(guó)

(1.湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司，長(zhǎng)沙 410331；2.湖南省中藥提取工程研究中心，長(zhǎng)沙410329； 3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省中獸藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；4.湖南省獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，長(zhǎng)沙410128)

博落回是一種以生物堿為主要活性成分的民間傳統(tǒng)中藥，具有散瘀、祛風(fēng)、解毒、止痛及殺蟲等功效[1]。該植物為罌粟科博落回屬的多年生草本植物，全屬共兩種，包括博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br. 與小果博落回(Macleayamicrocarpa(Maxim.)Fedde)，以博落回應(yīng)用為主，但小果博落回也作博落回使用[1～2]。博落回中的主要生物堿為原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿這四種生物堿，富集于博落回的果莢和葉片中。博落回散和博落回注射液都是以博落回果莢為原料進(jìn)行開發(fā)的新獸藥，其它藥用部位現(xiàn)在也在進(jìn)行系列產(chǎn)品開發(fā)。目前應(yīng)用液相方法檢測(cè)生物堿在博落回各個(gè)部位中的含量報(bào)道很多[3～6]，未見報(bào)道相關(guān)的薄層方法定性鑒別，但在博落回藥材質(zhì)量檢測(cè)中薄層鑒定也有很重要的意義，故對(duì)博落回各個(gè)部位中四種生物堿進(jìn)行薄層鑒別研究。

1 材 料

1.1 儀器 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬(wàn)分之一電子天平(梅托勒-托利儀器(上海)有限公司)；紫外三用儀(杭州齊威儀器有限公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠)；微量點(diǎn)樣管；玻璃噴霧瓶；雙槽玻璃展開缸。

1.2 試劑與藥品 原阿片堿(110853-201805)，血根堿(510001-201101)，白屈菜紅堿(111718-201402)均購(gòu)自中國(guó)藥品檢驗(yàn)研究院；別隱品堿(170501，湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司自制)；甲醇、鹽酸、二甲苯、氯仿、環(huán)已烷、丙酮、氨水和碘化鉍鉀均為分析純?cè)噭?。博落回果、博落回葉、小果博落回果及小果博落回葉均來(lái)自湖南美可達(dá)生物資源股份有限公司采購(gòu)，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)楊廣民教授分別鑒定來(lái)源于博落回Macleayacordata(Willd.)R.Br. 與小果博落回(Macleayamicrocarpa(Maxim.)Fedde)。

2 方法與結(jié)果

2.1 博落回供試品溶液

2.1.1 博落回果供試品溶液 取博落回果粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)10 mL，超聲處理1 h，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.1.2 博落回葉供試品溶液 取博落回葉粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)25 mL，超聲處理1 h，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.1.3 小果博落回果供試品溶液 取小果博落回果粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)25 mL，超聲處理1 h，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.1.4 小果博落回葉供試品溶液 取小果博落回葉粉末1 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)10 mL，超聲處理1 h，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液 分別取原阿片堿，別隱品堿，血根堿和白屈菜紅堿對(duì)照品，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)制成每1 mL分別含原阿片堿1 mg,別隱品堿1 mg，血根堿1 mg和白屈菜紅堿1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 二甲苯-甲醇 照薄層色譜法(附錄0502)試驗(yàn)，吸取上述4種生物堿對(duì)照品溶液，各樣品供試品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯-甲醇(5 ∶1)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，立即展開，取出，晾干。在可見光下(圖1)，原阿片堿和別隱品堿不顯色，血根堿和白屈菜紅堿分別顯紅色和黃色，博落回果和小果博落回葉供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)；在254 nm熒光下(圖2),原阿片堿和別隱品堿無(wú)熒光，博落回果和小果博落回葉供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應(yīng)位置顯明顯的相同顏色的熒光斑點(diǎn)，博落回葉和小果博落回果供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應(yīng)位置顯較弱的熒光斑點(diǎn)；噴碘化鉍鉀試液后(圖3),博落回果供試品溶液在和原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，博落回葉供試品溶液在和原阿片堿、別隱品堿相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，小果博落回果供試品溶液在和別隱品堿對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，小果博落回葉供試品溶液在和血根堿、白屈菜紅堿和別隱品堿對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

圖1 博落回TLC圖譜(日光下)Fig 1 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M.microcarpa(sunlight)

圖2 博落回TLC圖譜(254 nm熒光)Fig 2 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M.microcarpa(UV254nm)

圖3 博落回TLC圖譜(碘化鉍鉀試液顯色)Fig 3 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M.microcarpa (react with Iodized bismuth potassium solution)

2.3.2 環(huán)已烷-丙酮 照薄層色譜法(附錄0502)試驗(yàn)，吸取上述原阿片堿和別隱品堿對(duì)照品溶液，各樣品供試品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)已烷-丙酮(3∶2)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，立即展開，取出，晾干，噴碘化鉍鉀試液后(圖4),博落回果和博落回葉供試品溶液在原阿片堿和別隱品堿對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，小果博落回果和小果博落回葉供試品溶液在別隱品堿相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

圖4 博落回TLC圖譜(碘化鉍鉀試液顯色)Fig 4 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M.microcarpa (react with Iodized bismuth potassium solution)

2.3.3 氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(50∶10∶1∶0.1) 照薄層色譜法(附錄0502)試驗(yàn)，吸取上述4種生物堿對(duì)照品溶液，各樣品供試品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(50∶10∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，在可見光下(圖5)，原阿片堿和別隱品堿不顯色，血根堿和白屈菜紅堿分別顯紅色和黃色，博落回果和小果博落回葉供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)；在254 nm熒光下(圖6),原阿片堿和別隱品堿無(wú)熒光，博落回果和小果博落回葉供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應(yīng)位置顯明顯的相同顏色的熒光斑點(diǎn)，博落回葉和小果博落回果供試品溶液在血根堿和白屈菜紅堿相應(yīng)位置顯較弱的熒光斑點(diǎn)；噴碘化鉍鉀試液后(圖7),博落回果和小果博落回葉供試品溶液在和血根堿、白屈菜紅堿對(duì)照品相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，原阿片堿對(duì)照品展開很小的距離，別隱品堿對(duì)照品基本上不展開，博落回果、博落回葉和小果博落回葉供試品溶液在和原阿片堿對(duì)應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

圖5 博落回TLC圖譜(可見光)Fig5 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M. microcarpa(sunlight)

圖6 博落回TLC圖譜(254 nm)Fig6 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M. microcarpa(UV254nm)

圖7 博落回TLC圖譜(碘化鉍鉀試液顯色)Fig7 TLC chromatogram of Macleaya cordata and M.microcarpa (react with Iodized bismuth potassium solution)

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

博落回中的四種生物堿在各個(gè)部位都有分布，但是含量相差較大。博落回果中以血根堿和白屈菜紅堿為主，博落回葉中以原阿片堿和別隱品堿為主，小果博落回果中以別隱品堿為主，而小果博落回葉中以血根堿和白屈菜紅堿為主，故薄層定性鑒別以主要成份為鑒別特征。

原阿片堿、別隱品堿、血根堿和白屈菜紅堿這種四種生物堿遇碘化鉍鉀試液顯紅色。血根堿和白屈菜紅堿這兩種生物堿在可見光下分別顯紅色和黃色，在254 nm紫外光下有熒光，但是原阿片堿和別隱品堿在可見光下沒有顏色，紫外光下也沒有熒光，故以碘化鉍鉀試液顯色為好。

氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(50 ∶10 ∶1 ∶0.1)系統(tǒng)能較好的分離血根堿和白屈菜紅堿。環(huán)己烷-丙酮(3 ∶2)能較好的分離原阿片堿和別隱品堿；二甲苯-甲醇(5 ∶1)能較好的分離四種生物堿，但是血根堿和白屈菜紅堿分離不算特別好，原阿片堿和別隱品堿的比移值(Rf)比較小。

獸藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)收載的博落回注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[7]中，使用氯仿-甲醇-氨水(60 ∶1 ∶0.1)系統(tǒng)，博落回總堿作為對(duì)照，展距為5 cm。我們經(jīng)過(guò)液相和薄層鑒別，博落回總堿中主要含有血根堿和白屈菜紅堿，該系統(tǒng)能對(duì)血根堿和白屈菜紅堿進(jìn)行較好的分離，但是斑點(diǎn)有拖尾，我們?cè)谠撜归_劑的基礎(chǔ)上增加二甲苯能有效降低拖尾現(xiàn)像。

湖南省地標(biāo)《博落回葉》[8]薄層中曾使用環(huán)己烷-丙酮(2 ∶1)分離鑒定原阿片堿和別隱品堿，該標(biāo)準(zhǔn)由本單位研究申報(bào)，在后續(xù)的研究中發(fā)現(xiàn)樣品溶液不用經(jīng)過(guò)萃取也能較好的鑒別出生物堿成份。經(jīng)過(guò)后期的研究，對(duì)博落回葉薄層條件進(jìn)行了簡(jiǎn)化和優(yōu)化。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

3.2.1 博落回果薄層鑒定條件 取本品粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)10 mL，超聲處理1 小時(shí)，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取血根堿鹽酸鹽和白屈菜紅堿對(duì)照品，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)制成每1 mL各含血根堿1 mg和白屈菜紅堿1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄0502)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(50 ∶10 ∶1 ∶0.1)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，立即展開，取出，晾干，噴碘化鉍鉀試液顯色，供試色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

3.2.2 博落回葉薄層鑒定 取本品粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)25 mL，超聲處理1 h，濾過(guò)作為供試品溶液。取原阿片堿和別隱品堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含原阿片堿 1 mg和別隱品堿1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄0502)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮(2 ∶1)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴碘化鉍鉀試液顯色，供試色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色斑點(diǎn)。

3.2.3 小果博落回果薄層鑒定 取本品粉末0.5 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)25 mL，超聲處理60 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取別隱品堿對(duì)照品，加甲醇制成1 mL約含0.4 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄0502)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各 3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-丙酮(3 ∶2)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴碘化鉍鉀試液顯色，供試色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色斑點(diǎn)。

3.2.4 小果博落回葉薄層鑒定 取本品粉末約1 g，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)10 mL，超聲處理60 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取血根堿鹽酸鹽和白屈菜紅堿對(duì)照品，加甲醇-1%鹽酸水溶液(50 ∶50)分別制成每1 mL含血根堿1 mg和白屈菜紅堿1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(附錄0502)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-二甲苯-甲醇-氨水(50 ∶10 ∶1 ∶0.1)為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，立即展開，取出，晾干，噴碘化鉍鉀試液顯色，供試色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。