蒲公英提取物聯(lián)合多種抗生素對(duì)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的體外協(xié)同抑菌實(shí)驗(yàn)

魏秀麗，李晴，徐恩民，張秀英，楊志昆，張志賓，李有志*

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)與精準(zhǔn)化用藥山東省工程實(shí)驗(yàn)室，山東省動(dòng)物用中藥制劑工程實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250022； 2.日照市莒縣畜牧獸醫(yī)局，莒縣276500； 3.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081；4.河北冀中藥業(yè)有限公司，石家莊071500)

抗生素是目前我國(guó)畜牧業(yè)中使用最廣泛和最重要的抗感染藥物,在控制畜禽的傳染性疾病和提高畜禽的生產(chǎn)性能方面發(fā)揮了巨大的作用.抗生素一方面具備重要的醫(yī)用價(jià)值,另一方面如獸用抗生素使用不當(dāng),出現(xiàn)濫用現(xiàn)象,會(huì)給禽畜個(gè)體及畜牧產(chǎn)業(yè)帶來(lái)眾多問題[1].蒲公英為菊科植物蒲公英、堿地蒲公英或同屬數(shù)種植物的干燥全草。味甘、微苦，性寒，無(wú)毒，用于疔瘡腫毒、乳癰、咽痛、濕熱黃疸、熱淋澀痛，藥材及相關(guān)制劑被收錄于中華人民共和國(guó)藥典和獸藥典[2-4]。由于其良好的治療效果和經(jīng)濟(jì)性，蒲公英提取物在獸藥中的研究也成為焦點(diǎn)，但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道不同來(lái)源產(chǎn)地的蒲公英其有效成分差異很大，其中以咖啡酸、菊苣酸、單咖啡酰酒石酸等為代表成分，進(jìn)行液相色譜含量測(cè)定，進(jìn)行定量控制成為必然[5-8]。

奶牛乳房炎是奶牛常見多發(fā)病,也是對(duì)奶牛生產(chǎn)危害性最大的一種疾病.據(jù)報(bào)道,臨床乳房炎占奶牛總發(fā)病率的19%～21%,在閩南農(nóng)村以個(gè)體散戶分散飼養(yǎng)為主的奶牛發(fā)病率達(dá)23%～26%,獸醫(yī)臨床中奶牛隱性乳房炎難以發(fā)現(xiàn),更難治療,特別是治療過(guò)程中由于使用抗生素和化學(xué)藥品,在牛奶中形成藥殘,直接威脅人類健康安全,所以,尋求一種安全、高效、方便、廉價(jià)而又無(wú)藥殘的藥物,已成為當(dāng)務(wù)之急。隨著臨床奶牛乳房炎治療應(yīng)用乳房注入劑的增多，會(huì)呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，采用浦公英配合治療奶牛乳房炎，取得良好的效果，關(guān)于蒲公英治療奶牛乳房炎的報(bào)道也日漸增多[9-10]。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 耐藥性金黃色葡萄球菌(金Z、金4、金5、金C、金L、金6、金F、金I、金2、金D)及其質(zhì)控菌ATCC18036由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.2 主要儀器 分析天平(感量0.00001g)； Waters 2695超高效液相色譜儀；布蘭德移液器(10 μL、200 μL、1000 μL)；8道布蘭德電動(dòng)移液器(30-300 μL)；動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性藥敏檢測(cè)板(上海佰星生物技術(shù)有限公司)；培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；高壓滅菌鍋(日本 CL-32L)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)；麥?zhǔn)媳葷醿x(法國(guó)梅里埃)。

1.3 藥品及試劑 菊苣酸對(duì)照品(批號(hào)111752-200902)；咖啡酸對(duì)照品(批號(hào)110885-201703)；

單咖啡酰酒石酸對(duì)照品(批號(hào)18101022)；

蒲公英提取物(北京生泰爾科技股份有限公司小試產(chǎn)品、河北冀中藥業(yè)有限公司小試產(chǎn)品、東北大興安嶺格林格貝寒帶生物科技股份有限公司小試產(chǎn)品)。

抗菌藥物原料(阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟、利福昔明、硫酸慶大霉素、金霉素、鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考)為國(guó)內(nèi)獸藥企業(yè)提供。

金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、LB瓊脂、MH肉湯，均購(gòu)自北京路橋公司。

1.4 高效液相色譜儀測(cè)定蒲公英提取物主要成分及含量

1.4.1 液相色譜測(cè)定用中藥提取物的配制 稱取三種來(lái)源的蒲公英提取物溶解并定容于10 mL 50%的甲醇中過(guò)濾，終濃度為1 mg/mL；

1.4.2 液相色譜條件 色譜柱：C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相A：水(0.4%磷酸)；流動(dòng)相B：乙腈，進(jìn)行梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃，進(jìn)樣室溫度10 ℃。二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm。液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition table

1.5 多種抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值測(cè)定

1.5.1 藥敏試驗(yàn)藥物的配制 將所需抗菌藥物按照試驗(yàn)需要配制成適當(dāng)濃度的儲(chǔ)備液，所有藥物儲(chǔ)備液過(guò)濾除菌，-20 ℃保存。

1.5.2 菌液的制備 將培養(yǎng)好的菌落，用滅菌肉湯稀釋至0.5麥?zhǔn)蠁挝?。取適量菌液用滅菌肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行100倍稀釋，菌懸液濃度約為1.5*106CFU/mL,備用。

1.5.3 金黃色葡萄球菌MIC測(cè)定 采用微量肉湯稀釋法進(jìn)行測(cè)定[11]。

1.6 棋盤法聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 選取金黃色葡萄球菌金4作為后續(xù)聯(lián)合用藥試驗(yàn)菌株。

(1)將各種藥物原液按512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)，用MHB營(yíng)養(yǎng)肉湯依次倍比稀釋梯度。

(2)取出滅菌的96孔板，采用棋盤法，在96 孔板的橫列和縱列中將不同濃度的2 種藥物加入50μL，不同濃度組合的2種藥物混合液置于各孔中。

(3)在加藥的96孔板的每個(gè)孔里加入100 μL稀釋好的106CFU/mL金黃色葡萄球菌懸液，然后放入37 ℃溫箱中，12～14 h后觀察結(jié)果，用肉眼觀察每個(gè)孔的渾濁度，計(jì)算統(tǒng)計(jì)聯(lián)合用藥的效果。

(4)重復(fù)三次棋盤試驗(yàn)[12]。

1.7 計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)FIC 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果濃度(Fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)IC)指數(shù)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)，計(jì)算公式如下：

其中FIC ≤ 0.5為“協(xié)同作用”；0.5

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來(lái)源蒲公英提取物的含量測(cè)定 結(jié)果，見表2，圖1-圖5。

表2 不同來(lái)源蒲公英提取物含量Tab 2 Contents of Dandelion extracts from different sources

圖1 約40 μg/mL單咖啡酰酒石酸對(duì)照品色譜圖Fig 1 Chromatogram of about 40 μg/mL mono caffeinated tartaric acid reference substance

圖2 約20 μg/mL綠原酸、咖啡酸、60 μg/mL菊苣酸對(duì)照品色譜圖Fig 2 Chromatogram of 20 μg/mL chlorogenic acid, caffeic acid and 60 μg/mL cichoric acid reference substance

圖3 蒲公英提取物(河北冀中)液相色譜圖Fig 3 HPLC of dandelion extract (Jizhong, Hebei)

圖4 蒲公英提取物(東北)液相色譜圖Fig 4 HPLC of dandelion extract (Dongbei)

圖5 蒲公英提取物(北京生泰爾)液相色譜圖Fig 5 HPLC of dandelion extract (shengtai'er of Beijing)

2.2 體外抑菌實(shí)驗(yàn)MIC測(cè)定 根據(jù)蒲公英提取物成分及含量測(cè)定結(jié)果，選取河北冀中的蒲公英提取物進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)。對(duì)10株金黃色葡萄球菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)MIC測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 多種藥物對(duì)10株金黃色葡萄球菌體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab 3 In vitro antibacterial test results of various drugs on 10 strains of Staphylococcus aureus

2.3 聯(lián)合用藥對(duì)金黃色葡萄球菌藥敏試驗(yàn)聯(lián)合用藥指數(shù)(FIC)結(jié)果表

表4 聯(lián)合用藥對(duì)金黃色葡萄球菌聯(lián)合用藥指數(shù)Tab 4 FIC value of Staphylococcus aureus in combination

從表中看出，蒲公英提取物與7種藥物聯(lián)合應(yīng)用，都具有很好地協(xié)同作用，能大幅度地抗菌藥的抑菌濃度，減少用藥量，給中西藥聯(lián)合應(yīng)用推薦抗菌藥減量化應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

3 討論與結(jié)論

獸用抗生素是目前我國(guó)畜牧業(yè)中使用最廣泛和最重要的藥物,在防控畜禽疫病和提高畜禽生產(chǎn)性能方面功不可沒,但它的不當(dāng)使用,也對(duì)公共衛(wèi)生造成了極大的危害[13]。本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同的菌株對(duì)不同的藥物敏感性差異較大，與奶牛場(chǎng)的用藥習(xí)慣有關(guān)，治療奶牛隱性乳房炎，有必要提前進(jìn)行藥敏試驗(yàn)來(lái)科學(xué)精準(zhǔn)的應(yīng)用藥物。臨床上應(yīng)用較久的阿莫西林、氨芐西林已經(jīng)出現(xiàn)了部分耐藥菌株，最為敏感的是齊魯動(dòng)物保健品有限公司和齊魯晟華制藥有限公司的利福昔明和頭孢噻呋、頭孢喹肟；單硫酸卡那霉素對(duì)金黃色葡萄球菌有的極為敏感，有的非常耐藥。還有幾種藥物并未應(yīng)用于臨床，其耐藥性差異較大，例如鹽酸多西環(huán)素、恩諾沙星、硫酸慶大霉素、金霉素、氟苯尼考等。

獸藥行業(yè)大發(fā)展創(chuàng)新日新月異，不少企業(yè)或科研院所研究鹽酸頭孢噻呋乳膏劑、含蒲公英藥材提取物的中藥，來(lái)治療奶牛乳房炎[14-17]。現(xiàn)在臨床治療奶牛乳房炎的藥物用很多，有硫酸頭孢喹肟乳房注入劑、硫酸頭孢喹肟乳房注入劑、利福昔明乳房注入劑[18-22]。本試驗(yàn)，可以看出，蒲公英提取物在一定程度上具有抗菌作用，與多種藥物聯(lián)合應(yīng)用在體外對(duì)奶牛乳房炎的主要病原菌具有良好的協(xié)同作用，理論能在一定程度上減少抗菌藥物的使用，從而減少藥物殘留，縮短棄奶期。但，如何進(jìn)行中西方的復(fù)配，如何優(yōu)化生產(chǎn)工藝是產(chǎn)品穩(wěn)定有效，臨床效果的實(shí)現(xiàn)還需要很多的探索性試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

另外蒲公英提取物，對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑菌和殺菌的作用，但體外最小抑菌濃度在78.1～625 μg/mL的范圍內(nèi)，與抗菌藥相比，是有些差的，與文獻(xiàn)報(bào)道的比較一致[23]，但由于中藥有對(duì)機(jī)體整體的調(diào)節(jié)作用，這種作用也不容忽視，相對(duì)于耐藥菌而言，有些菌株對(duì)蒲公英提取物反而更敏感。