甜葉菊葉斑病的病原鑒定和殺菌劑防治效果

陳葉，楊磊磊，王媛，馬銀山，王治江

（1.河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學(xué)院，甘肅張掖 734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅張掖 734000）

0 引言

甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）又名甜草、甜菊，為菊科多年生草本植物[1]。經(jīng)大量藥物實(shí)驗(yàn)證明，甜菊糖無(wú)毒副作用，無(wú)致癌物，食用安全，經(jīng)常食用可預(yù)防高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病、齲齒等病癥，是一種替代蔗糖非常理想的甜味劑[2-4]。目前，甜菊糖已被廣泛應(yīng)用于食品、飲料和醫(yī)藥等行業(yè)，是新型糖源植物[5]。在我國(guó)甜葉菊的種植主要集中在南方地區(qū)，近年來(lái)，引種到甘肅河西走廊種植。

河西走廊位于甘肅省中西部，屬于祁連山冷涼灌溉區(qū)，光照資源豐富，晝夜溫差大，氣候干燥，無(wú)霜期127～158 d，10 ℃以上有效積溫3 000～4 000℃，非常適宜甜葉菊的生長(zhǎng)[6]。自甜葉菊被引種到甘肅河西地區(qū)種植以來(lái)，呈現(xiàn)量效齊升的狀態(tài)，已經(jīng)發(fā)展成為當(dāng)?shù)氐男屡d產(chǎn)業(yè)之一。但隨著甜葉菊栽培年限的增長(zhǎng)和面積的擴(kuò)大，甜葉菊病害的發(fā)生與危害日益嚴(yán)重[7]，成為制約經(jīng)濟(jì)效益提升和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸之一。筆者對(duì)甘肅省臨澤縣甜葉菊種植田的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甜葉菊葉斑?。⊿eptoria steviae Ishiba Yokoyama et Tani）發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重，且有逐年加重的趨勢(shì)，嚴(yán)重發(fā)病地塊發(fā)病率達(dá)90%以上，甜葉菊減產(chǎn)50%～60%。此前，林雙喜等研究表明甜葉菊斑枯病的發(fā)生特點(diǎn)為發(fā)生面積大、為害周期長(zhǎng)、品種間發(fā)病程度有差異、發(fā)病損失重[8]，因此，對(duì)甜葉菊葉斑病的防治對(duì)甜葉菊種植至關(guān)重要；王光華等對(duì)甜葉菊斑枯病的防治進(jìn)行藥劑試驗(yàn)，結(jié)果表明，田間小區(qū)防治試驗(yàn)以甲基托布津防治甜葉菊斑枯病效果最好，防效可達(dá)90%以上，其次是百菌清、福美雙和多菌靈[9]；羅明華等人對(duì)四川綿陽(yáng)地區(qū)甜葉菊葉斑病的發(fā)病特征進(jìn)行了調(diào)查并篩選出75%百菌清、50%乙基托布津、65%代森鋅的防治效果較好[10]；程愛均針對(duì)濟(jì)寧地區(qū)甜葉菊葉斑病提出在種植時(shí)選擇適宜的密度、提供必需的營(yíng)養(yǎng)元素、使用高效殺菌劑來(lái)進(jìn)行防治[11]。但目前尚未見臨澤縣甜葉菊種植田中葉斑病的相關(guān)研究報(bào)道，對(duì)于此病的防治，種植戶沒有針對(duì)當(dāng)?shù)厝~斑病的配套措施，防治效果不佳，目前，葉斑病害已經(jīng)成為當(dāng)?shù)匚：μ鹑~菊產(chǎn)量和菊糖苷質(zhì)量的最大病害。為此，本試驗(yàn)針對(duì)葉斑病進(jìn)行了田間病害調(diào)查、菌種分離、病原鑒定及室內(nèi)藥劑防效研究，以期為甜葉菊葉斑病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥劑與培養(yǎng)基

甲基硫菌靈70%WP（廣東中迅農(nóng)科股份有限公司生產(chǎn)）；粉繡寧15%WP（四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)）；百菌清75%WP（利民化工股份有限公司生產(chǎn)）；吡唑醚菌酯20%SC（利民化工股份有限公司生產(chǎn)）；代森錳鋅70%WP（利民化工股份有限公司生產(chǎn)）；苯醚甲環(huán)唑10%WDG（利民化工股份有限公司生產(chǎn)）。

1.1.2 供試病株

2018 年6 月從臨澤縣甜葉菊種植基地采集患有葉斑病的甜葉菊病葉，將葉片從莖稈上摘下后放在培養(yǎng)皿中，內(nèi)鋪吸水紙，吸水紙用蒸餾水浸濕即可，帶往河西學(xué)院生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)樓，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 田間發(fā)病率和病害特征調(diào)查

分別在2018年5月、6月、7月、8月的下旬前往臨澤縣甜葉菊種植基地，采用實(shí)地調(diào)查和走訪農(nóng)戶相結(jié)合的方法，設(shè)置4個(gè)樣點(diǎn)，調(diào)查葉斑病的發(fā)病率，記錄病害癥狀、發(fā)病特點(diǎn)和發(fā)病部位及程度。

1.2.2 菌種分離、純化

選取病癥明顯的葉片，在病健交接處割取0.5 cm×0.5 cm 大小的葉片，先將葉片浸在0.1%氯化汞溶液中15 min，然后用無(wú)菌水沖洗后，再浸入75%酒精溶液中15 s，然后用無(wú)菌水沖洗后，瀝干水分后放置于PDA平板培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d 后病葉邊緣長(zhǎng)出病原菌菌絲；用挑針挑取少量菌絲轉(zhuǎn)接到PDA平板培養(yǎng)基上進(jìn)行初步純化培養(yǎng)，按照此方法純化轉(zhuǎn)接3～4 次后，將經(jīng)過純化的菌種轉(zhuǎn)接到PDA 斜面培養(yǎng)基上，待斜面長(zhǎng)滿菌絲后，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹12]。

1.2.3 病原鑒定

將純化后的菌種接種至PDA 培養(yǎng)基平板上，在培養(yǎng)過程中定期觀察并記錄菌落形狀、質(zhì)地、顏色以及生長(zhǎng)速度等情況。從培養(yǎng)一定時(shí)間的菌落上挑取菌絲制成玻片，顯微鏡下觀察真菌菌體的形態(tài)特征，即菌絲、分生孢子和分生孢子梗的形狀、大小、顏色等或其它繁殖體形態(tài)。依據(jù)真菌分類進(jìn)行鑒定[13]。

1.2.4 含藥培養(yǎng)基制備

分別稱取甲基硫菌靈、粉銹寧、百菌清、代森錳鋅、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑6 種可濕性粉劑的對(duì)應(yīng)量倒入從高壓滅菌鍋中取出的PDA 培養(yǎng)基中（待溫度冷卻至45 ℃時(shí)），制成含藥培養(yǎng)基平板。藥劑的對(duì)應(yīng)量為每個(gè)藥劑使用濃度的最高、最低和中間值為對(duì)應(yīng)濃度（見表2）。

1.2.5 抑菌測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法，將供試甜葉菊葉斑病菌種在含藥培養(yǎng)基上分別進(jìn)行6種殺菌劑苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯、粉銹寧、代森錳鋅、百菌清、甲基硫菌靈的抑菌測(cè)定。在保存新鮮的甜葉菊葉斑病菌菌落邊緣打取直徑6 cm 的菌餅，接種于含藥培養(yǎng)基的平板中央，菌絲面朝下，每皿一個(gè)菌餅，以不加藥劑平板作為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)5 次，在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d 后，用十字交叉法測(cè)量菌餅的生長(zhǎng)直徑，通過凈生長(zhǎng)量的計(jì)算，求出抑制率（抑菌率)[7]。以殺菌劑質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑菌率概率值為縱坐標(biāo)繪制毒力回歸曲線，根據(jù)毒力回歸方程求出各殺菌劑對(duì)病原菌各菌株菌絲生長(zhǎng)有效抑制中濃度EC50，每種殺菌劑3 次重復(fù)的平均值即為該殺菌劑對(duì)甜葉菊葉斑病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病率及病害特征

由表1 可知，從5 月到8 月甜葉菊葉斑病在田間的發(fā)病率為11.2%～65.6%，隨著月份的增加，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重發(fā)病地塊發(fā)病率達(dá)90%以上。在植株發(fā)病初期，在葉片上出現(xiàn)淺色病斑，病斑先從植株下部葉片上發(fā)生，由下而上蔓延，病斑大小約在2～13 mm，初期時(shí)斑點(diǎn)較小，隨后逐漸發(fā)展成大的長(zhǎng)形、不規(guī)則形的褐色或黑褐色病斑，病斑中間出現(xiàn)小黑點(diǎn)，邊緣黃化，嚴(yán)重時(shí)多斑聯(lián)合，重者整個(gè)葉片枯死。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，發(fā)病后期部分葉片脫落，特別是貼近地面部分發(fā)病最嚴(yán)重，脫落最多。

表1 甜葉菊葉斑病田間發(fā)病率調(diào)查結(jié)果Table 1 Field incidence rate of stevia leaf spot disease

2.2 菌種鑒定

將菌種培養(yǎng)一周后觀察，生長(zhǎng)特征為：前期菌落呈現(xiàn)淺綠色,后期轉(zhuǎn)為橄欖綠至褐色，氣生菌絲比較豐富，呈現(xiàn)棉絮狀（圖1a）；顯微鏡下觀察得分生孢子梗單生或簇生，大多直向少數(shù)偏向一側(cè)彎曲，有分隔，用目鏡測(cè)微尺測(cè)得分生孢子大小為17.60～23.80μm×8.80～12μm，平均為21.60μm×10.60μm，呈倒棍棒形、長(zhǎng)卵圓形或梭形等；有2～5 個(gè)橫隔、0～2 個(gè)縱隔，喙較短，呈現(xiàn)柱形狀，大小為2.74～4.50μm×2.40～4.16μm，無(wú)分隔（圖1b）。將分離后的菌種用無(wú)菌水沖洗，制成菌懸液，然后將盆栽的甜葉菊葉片用細(xì)紗布輕輕地摩擦，將菌懸液噴灑在摩擦后的葉片上，保濕培養(yǎng)，結(jié)果在葉片上出現(xiàn)與甜葉菊田間病害癥狀一致的病斑。根據(jù)真菌分類初步鑒定臨澤縣當(dāng)?shù)靥鹑~菊葉斑病菌為鏈格孢真菌（Alternariasp.），屬半知菌綱、鏈孢霉目、黑霉科。

2.3 不同藥劑對(duì)甜葉菊葉斑病菌的抑菌效果

由表2和圖2可知，不同藥劑對(duì)甜葉菊葉斑病菌菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用，同一藥劑的抑菌效果隨濃度的減小而降低。用苯醚甲環(huán)銼處理的抑菌圈直徑為0.26～0.40 cm，抑菌率為90.00%～93.50%，其中，10%苯醚甲環(huán)唑50 μg/mL 抑菌效果最好。用吡唑醚菌酯處理的抑菌圈直徑為0.28～0.42 cm，抑菌率為89.50～93.00%，抑菌效果僅次于苯醚甲環(huán)銼，其中，20%吡唑醚菌酯80μg/mL抑菌效果最好。用粉銹寧的抑菌圈直徑為1.03～1.20 cm，抑菌率為70.00～74.25%，其中，15%粉銹寧134μg/mL抑菌效果最好。用代森錳鋅處理的抑菌圈直徑為1.53～1.67 cm，抑菌率為58.25～61.75%，其中，280μg/mL時(shí)抑菌效果最好。用百菌清處理的抑菌圈直徑為1.51～1.66 cm，抑菌率為58.50～62.25%，而甲基硫菌靈的抑菌效果較差，抑菌圈直徑為2.03～2.22 cm，抑菌率最高僅為49.25%。由此可以看出，用10%苯醚甲環(huán)唑50μg/mL和20%吡唑醚菌酯80μg/mL的抑菌效果（93.50%、93.00%）最好。

表2 不同藥劑對(duì)甜葉菊葉斑病病菌的抑菌效果Table 2 Antimicrobial effects of different bactericides on stevia leaf spot

圖2 6種藥劑最高稀釋倍數(shù)抑菌效果Fig.2 Bacteriostasis effect of maximum dilution multiple of six bactericides

2.4 甜葉菊葉斑病菌與不同殺菌劑間敏感性回歸分析

利用回歸統(tǒng)計(jì)方法，將濃度轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)和百分率轉(zhuǎn)換成機(jī)率值，分別求出甜葉菊葉斑病對(duì)6 種殺菌劑相關(guān)回歸方程和相關(guān)系數(shù)、有效抑制中濃度EC50。如表3所示，甜葉菊葉斑病菌對(duì)苯醚甲環(huán)銼和吡唑醚菌酯的敏感EC50值最低，分別為3.43μg/mL和10.85μg/mL，說明甜葉菊葉斑病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯表現(xiàn)敏感，也說明抑菌效果最好；而對(duì)粉銹寧、代森錳鋅、百菌清、甲基硫菌靈的EC50值分別為23.15 μg/mL、76.92μg/mL、49.10μg/mL和75.75μg/mL，說明甜葉菊葉斑病菌對(duì)代森錳鋅、甲基硫菌靈和百菌清產(chǎn)生較強(qiáng)的抗藥性，其中，對(duì)代森錳鋅和甲基硫菌靈的抗性最大，也說明二者抑菌效果最差。

表3 甜葉菊葉斑病菌與6 種藥劑敏感相關(guān)回歸分析Table 3 Regression analysis of correlation between stevia leaf spot and 6 kinds of bactericides

3 討論與結(jié)論

在甜葉菊生長(zhǎng)過程中，葉斑?。⊿eptoria steviae Ishiba Yokoyama et Tani）是發(fā)生較為普遍的一種病害，造成直接的產(chǎn)量和品質(zhì)的損失[14-15]。目前防治甜葉菊葉斑病的藥劑報(bào)道較多，但各地防治的效果各不相同[16-18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，甜葉菊葉斑病在田間的發(fā)病率為11.2%～65.6%，嚴(yán)重發(fā)病地塊發(fā)病率達(dá)90%以上，并且病害的發(fā)生隨著月份的增加而增加，在防治時(shí)以早防為主。通過6種藥劑對(duì)甜葉菊葉斑病抑菌效果與敏感性分析，10%苯醚甲環(huán)唑50 μg/mL 和20%吡唑醚菌酯80 μg/mL 時(shí)的抑菌效果最好，抑菌率分別為93.50%和93.00%，而70%甲基硫菌靈和70%代森錳鋅的抑菌效果最差。張金蘭等研究認(rèn)為大田種植的甜葉菊上發(fā)生的葉斑病為甜菊葉斑病Septoria steviae，是隨日本甜葉菊種苗帶入的一種國(guó)內(nèi)新記錄病害，該病病原為殼針孢屬真菌[19]。本試驗(yàn)初步鑒定臨澤縣甜葉菊葉斑病菌為鏈格孢真菌（Alternariasp.），屬半知菌綱、鏈孢霉目、黑霉科，可能與生長(zhǎng)地不同，使葉片產(chǎn)生病斑的真菌也不同有關(guān)。為此，建議對(duì)臨澤縣甜葉菊種植田的葉斑病選用10%苯醚甲環(huán)唑50μg/mL 或20%吡唑醚菌酯80μg/mL 藥劑進(jìn)行防治。為提高防效、防止產(chǎn)生抗藥性，可交替使用這兩種藥劑，以達(dá)到經(jīng)濟(jì)、安全、有效的目的。本試驗(yàn)所選出的藥劑僅僅是實(shí)驗(yàn)室測(cè)定得出的結(jié)果，在大田中效果如何有待今后進(jìn)一步驗(yàn)證。