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    氟苯尼考緩釋顆粒的制備及體外釋放特性

    2020-07-16 15:13:30梁立杰黎鍵業(yè)劉雅紅黃顯會
    華南農(nóng)業(yè)大學學報 2020年4期
    關鍵詞:氟苯尼緩沖液介質(zhì)

    梁立杰,黎鍵業(yè),許 穎,劉雅紅,黃顯會

    (華南農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院/國家獸醫(yī)微生物耐藥性風險評估實驗室/廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室,廣東 廣州 510642)

    氟苯尼考(Florfenicol)是美國先靈–保雅(Schering-Plough)公司在19世紀70年代末研制的一種動物專用的新型酰胺醇類廣譜抗菌藥,對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌如胸膜放線桿菌和大腸埃希菌都有強大的抑菌能力[1]。氟苯尼考具有抗菌譜廣、吸收好、體內(nèi)分布廣等特點[2],在獸醫(yī)臨床上廣泛應用于豬、禽和水產(chǎn)動物的疾病治療[3-5],僅2013年氟苯尼考的用量就達到了1萬 t[6]。在獸醫(yī)臨床上氟苯尼考常用的給藥方式是混飼或飲水,目前,氟苯尼考的制劑類型主要有與葡萄糖等輔料簡單混合的普通粉劑、以紐氟羅為代表的預混劑和為了提高溶解度研制的環(huán)糊精包合物等[7-8]。無論粉劑、預混劑還是環(huán)糊精包合物都存在達峰時間快、峰濃度高、消除快等問題,容易導致多劑量連續(xù)給藥時藥物峰谷濃度差較大,且谷濃度低于有效濃度產(chǎn)生抑菌空檔期,同時過高的峰濃度不會增強藥物療效反而容易導致免疫抑制[9-10]和胚胎毒性[11]的發(fā)生。為減少氟苯尼考在豬體內(nèi)的峰谷濃度差,消除間歇采食導致的谷濃度低于有效濃度的時間和多劑量給藥抗菌空檔期,避免誘導耐藥性,降低峰濃度值避免藥物在體內(nèi)的浪費,達到增強藥物療效、避免產(chǎn)生耐藥性的目的,亟需研制氟苯尼考新劑型。

    本試驗通過選用合適的稀釋劑、填充劑、緩釋劑和粘合劑等輔料,以藥物體外釋放度為評價指標,運用離心噴霧干燥造粒技術(shù)制備了一種緩釋、長效的新劑型?氟苯尼考緩釋顆粒,以縮小氟苯尼考在動物體內(nèi)血藥濃度的峰谷濃度差,延長氟苯尼考在腸道釋放吸收的時間,從而減少藥物的使用量,避免因多劑量連續(xù)使用氟苯尼考產(chǎn)生免疫抑制,降低產(chǎn)生胚胎毒性的風險,為氟苯尼考產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供新的劑型及工藝。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    高效液相色譜儀(1260型,四元泵,紫外檢測器,美國安捷倫公司);色譜柱 (Gemini C18 110A,250 mm×4.6 mm×5 μm,美國 Phenomenex 公司);溶出試驗儀(RCY-808型,天津海益達公司);pH測定計(PHS-3C型,上海雷磁儀器廠);數(shù)控超聲儀(KH-500DB型,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

    1.2 藥品與試劑

    氟苯尼考對照品(w,99.3%)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;氟苯尼考原料藥(w,99.8%)購自浙江海翔川南藥業(yè)有限公司;氟苯尼考粉(w,10%)購自正典生物技術(shù)有限公司;硬化油購自杭州油脂化工有限公司;甘油酯購自廣州嘉德樂生化科技有限公司;乙腈,色譜級純,批號:122269,購自 Thermo Fisher Scientific公司;鹽酸、冰醋酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氯化鉀、十二烷基硫酸鈉(w,95.0%)等均為國產(chǎn)分析純。

    1.3 氟苯尼考緩釋顆粒的制備

    稱取處方量的氟苯尼考原料藥和輔料(質(zhì)量比為 1∶9),將水加熱至 60~75 ℃ 后,加入緩釋劑、稀釋劑和黏合劑,勻速攪拌均勻,得到混勻物料A;待混勻物料A溫度上升至80~85 ℃后,再投入填充劑和矯味劑,勻速攪拌使物料完全融溶,得到混勻物料B;將氟苯尼考投入混勻物料B中,攪拌物料至無堆積后,乳化 20~50 min,得到混勻物料 C;將混勻物料C在70 ℃保溫后進行離心噴霧干燥,冷卻,篩選出粒度大小為300~450 μm的藥物顆粒,備用。

    1.4 體外溶出分析方法的建立

    1.4.1 色譜條件 參考《中華人民共和國獸藥典》[11]中氟苯尼考的高效液相色譜(HPLC)檢測方法,流動相為乙腈、水和冰醋酸 (體積比為 100∶197∶3),紫外檢測波長 224 nm,柱溫 30 ℃,流速 1.0 mL/min,進樣量 10 μL。

    1.4.2 回收率與精密度試驗 精密稱取氟苯尼考25 mg對照品2份,分別置于50 mL容量瓶中,一份加入適量流動相溶液超聲溶解并定容,然后分別用3種釋放介質(zhì)[pH 1.2鹽酸緩沖液、pH 4.3醋酸緩沖液 (含 5 g/L SDS)、pH 6.8 磷酸緩沖液 (含 5 g/L SDS)]稀釋,作為對照品溶液。另一份先加入氟苯尼考微囊化顆粒配方比例的空白輔料,再加入適量流動相溶液超聲溶解并定容,然后分別用3種釋放介質(zhì)溶液稀釋,制得質(zhì)量濃度為40、50、60 μg/mL的氟苯尼考溶液。制得的溶液過0.45 μm針式過濾器,按“1.4.1”的色譜條件上機檢測,每個濃度樣品連續(xù)重復進樣3針,記錄峰面積,計算供試樣品的回收率和相對標準偏差(Relative standard deviation,RSD)。制備氟苯尼考質(zhì)量濃度為 50 μg/mL的平行供試樣品6份,上機檢測,計算樣品的精密度。

    1.4.3 標準曲線的制作 以 pH 1.2 鹽酸緩沖液為介質(zhì),精密稱量氟苯尼考對照品25 mg,用pH 1.2鹽酸緩沖液稀釋,配制成氟苯尼考質(zhì)量濃度為500 mg/L的儲備液。將儲備液用pH 1.2鹽酸緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為 5、10、20、50、100、200 mg/L 的溶液,過0.45 μm針式過濾器后,按照“1.4.1”的色譜條件上機檢測。參照氟苯尼考在pH 1.2鹽酸緩沖液介質(zhì)中標準曲線的制定方案,制作pH 4.3醋酸緩沖液 (含 5 g/L SDS)介質(zhì)以及 pH 6.8 磷酸緩沖液 (含5 g/L SDS)介質(zhì)的標準曲線。

    1.4.4 穩(wěn)定性試驗 將氟苯尼考質(zhì)量濃度為 500 mg/L的儲備液分別用3種釋放介質(zhì)溶液稀釋,制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的供試品溶液。室溫放置0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 后,取 2 mL 溶液過 0.45 μm針式過濾器后上機檢測,計算放置不同時間供試樣品中氟苯尼考的含量,評價氟苯尼考溶液室溫放置的穩(wěn)定性。

    1.5 氟苯尼考緩釋顆粒藥物含量檢測

    精密稱取制備的氟苯尼考緩釋顆粒0.25 g,置于100 mL碘量瓶中,精密加入50 mL提取溶液(乙腈、水、冰醋酸體積比為 200∶97∶3),超聲溶解后過濾,精密取濾液5 mL于50 mL容量瓶中,用流動相(乙腈、水、冰醋酸體積比為100∶197∶3)定容并搖勻,過0.45 μm針式過濾器,按“1.4.1”的色譜條件進樣分析,利用單點法計算緩釋顆粒中氟苯尼考的實際含量。

    1.6 氟苯尼考緩釋顆粒體外釋放度的檢測

    釋放度檢測方法以《中華人民共和國獸藥典》[11]306-308中的溶出度測定第一法(籃法)為依據(jù)。精密稱取氟苯尼考緩釋顆粒與氟苯尼考粉各0.5 g,置于轉(zhuǎn)籃中。加900 mL相應的溶出介質(zhì)于溶出杯中,在 (37.0±0.5)℃、100 r/min 條件下進行溶出試驗。分別于 0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 h 的時間點取樣1 mL(同時向溶出杯中補加相同溫度的釋放介質(zhì)溶液 1 mL)。經(jīng) 0.45 μm 針式過濾器過濾后,按“1.4.1”的色譜條件進樣分析,根據(jù)“1.4.3”制得的的標準曲線回歸方程計算氟苯尼考濃度,按公式(1)計算樣品在不同時間點的累計釋藥百分率,繪制樣品的累計釋放百分率?時間曲線。

    式中,Q表示氟苯尼考的累計釋放百分率,Cn表示第n個采樣時間點的樣品中氟苯尼考的質(zhì)量濃度;V表示釋放介質(zhì)溶液的總體積;Vi表示第i個采樣時間點的取樣體積;Ci表示第n個采樣時間點所取樣品氟苯尼考的質(zhì)量濃度;m表示顆粒總質(zhì)量,DL表示顆粒中氟苯尼考的總質(zhì)量分數(shù)。

    1.7 釋放模型擬合

    利用 Origin Pro 8.0 按照 Zero-order、Firstorder和Higuchi方程分別對緩釋顆粒在不同pH釋放介質(zhì)條件下的釋放曲線進行擬合,以各模型擬合方程的r值確定最佳擬合模型。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 專屬性試驗

    氟苯尼考專屬性試驗結(jié)果(圖1)顯示,氟苯尼考出峰時間為7.1 min,空白溶液在該方法下沒有出現(xiàn)干擾峰,專屬性良好,符合《中華人民共和國獸藥典》[11]規(guī)定。

    2.2 檢測限和定量限

    以信噪比≥3的氟苯尼考濃度為檢測限,以信噪比≥10的氟苯尼考濃度為定量限。精密移取一定量的氟苯尼考對照品溶液,用流動相溶液逐級稀釋,按“1.4.1”的色譜條件進樣分析。結(jié)果顯示,氟苯尼考的檢測限為 0.05 μg/mL,定量限為 0.10 μg/mL。

    2.3 標準曲線的繪制

    以氟苯尼考的峰面積(S)為橫坐標,質(zhì)量濃度(C)為縱坐標,通過最小二乘法對數(shù)據(jù)進行線性回歸,繪制標準曲線。氟苯尼考在pH 1.2鹽酸緩沖液中的回歸方程為C=0.070 4S?4.381 1 (R2=0.999 3),在pH 4.3醋酸緩沖液中的回歸方程為C=0.070 1S?3.556 5 (R2=0.999 0),在 pH 6.8 磷酸緩沖液中的回歸方程為C=0.698 0S?2.740 7 (R2=0.999 0)。結(jié)果顯示,氟苯尼考在5~200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好 (R2≥0.999 0)。

    圖1 50 μg/mL氟苯尼考溶液在不同釋放介質(zhì)溶液中的高效液相色譜圖Fig. 1 High performance liquid chromatograms of 50 μg/mL florfenicol solution in different release medium solutions

    2.4 回收率與精密度試驗

    根據(jù)《藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則》[11]374-377關于溶出度方法學的要求,在規(guī)定范圍內(nèi),測定50 μg/mL(相當于100%濃度水平)氟苯尼考6份供試樣品的結(jié)果,并進行精密度評價。以對照品加入量與所取供試品中待測定成分質(zhì)量比1.2∶1、1∶1、0.8∶1 左右作為回收率高、中、低濃度,本試驗所取的氟苯尼考待測成分量約為50 μg/mL,因此選擇質(zhì)量濃度為40、50、60 μg/mL的氟苯尼考溶液進行考察。

    氟苯尼考在3種介質(zhì)中的添加回收率結(jié)果(表1)和精密度結(jié)果 (表 2)顯示:低 (40 μg/mL)、中 (50 μg/mL)與高質(zhì)量濃度(60 μg/mL)的藥物添加回收率分別為 98.33%~100.91%、99.35%~101.13%、98.29%~101.03%,RSD 為 0.13%~0.86%、0.37%~0.67%、0.27%~0.93%,精密度的RSD為0.41%~0.84%。回收率以及精密度的RSD均小于1.50%,符合《中華人民共和國獸藥典》[11]中《藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則》規(guī)定。

    2.5 穩(wěn)定性試驗

    精密移取50 μg/mL的氟苯尼考對照品溶液在0、1、2、3、4、5、6、7、8 h 的時間點進樣,以氟苯尼考的峰面積計算,結(jié)果(表3)顯示,氟苯尼考不同時間點在PH 1.2鹽酸緩沖液、PH 4.3醋酸緩沖液和PH 6.8磷酸緩沖液中RSD分別是1.86%、1.44%和1.80%,表明氟苯尼考溶液在這3種不同pH介質(zhì)中8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好,符合《中華人民共和國獸藥典》[11]規(guī)定。

    表1 添加制備氟苯尼考緩釋顆??瞻纵o料的藥物回收率Table 1 Recovery rates of blank excipients for preparation of florfenicol sustained-release granules n=3

    2.6 氟苯尼考緩釋顆粒藥物含量

    氟苯尼考緩釋顆粒藥物含量測定結(jié)果(表4)顯示,該提取方法能夠完全提取制備的氟苯尼考緩釋顆粒中的藥物,緩釋顆粒中的藥物含量(w)分別99.19%、100.01%、97.45%、100.72%,符合《中華人民共和國獸藥典》[11]中對待測成分含量和回收率限度的要求(95%~105%),且RSD均小于2.00%,表明氟苯尼考緩釋顆粒中藥物分布較均勻。

    2.7 氟苯尼考緩釋顆粒體外釋放試驗

    以時間為橫坐標,累計釋放百分比為縱坐標,繪制在pH 1.2鹽酸緩沖液、pH 4.3醋酸緩沖液、pH 6.8磷酸緩沖液各溶出介質(zhì)中,氟苯尼考緩釋顆粒和氟苯尼考粉在 0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 h的時間點的釋放曲線(圖2)。

    氟苯尼考緩釋顆粒與氟苯尼考粉的體外釋放曲線如圖2所示,氟苯尼考粉在0.25 h時釋放量已經(jīng)接近90%,0.5 h后已經(jīng)完全釋放。氟苯尼考緩釋顆粒在pH 1.2鹽酸緩沖介質(zhì)(模擬胃液)中,1 h前不釋放,1 h后少量釋放,8 h釋放量僅為 6.13%;氟苯尼考緩釋顆粒在pH 4.3、6.8的緩沖介質(zhì)(模擬腸液)中緩慢釋放,0.5 h釋放量為35.42%和34.30%,2 h的釋放量為80.16%和79.38%,5 h的釋放量為98.99%和96.70%。此條件下制得的氟苯尼考緩釋顆粒表現(xiàn)出良好的耐酸性以及在模擬腸液的環(huán)境下良好的釋放性,達到了藥物緩釋的目的。

    表3 氟苯尼考在不同釋放介質(zhì)溶液中的穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 3 Results of the stability test of florfenicol in different release medium solutions

    表4 氟苯尼考緩釋顆粒中藥物含量的測定結(jié)果Table 4 Determination of drug content in fluorfenicol sustained-release granules %

    圖2 氟苯尼考緩釋顆粒和氟苯尼考粉在不同釋放介質(zhì)溶液中的累計釋放量曲線Fig. 2 Cumulative release curves of florfenicol sustainedrelease granules and florfenicol powder in different release medium solutions

    2.8 氟苯尼考緩釋顆粒體外釋放特性擬合方程

    用Origin Pro 8.0對氟苯尼考緩釋顆粒在不同時間點(t)的累計釋放百分率(M)進行方程擬合。結(jié)果(表5)顯示氟苯尼考緩釋顆粒在pH 1.2鹽酸緩沖液中R2均低于0.80,在pH 4.3醋酸緩沖液和pH 6.8磷酸緩沖液的條件下,藥物釋放曲線均與Firstorder方程擬合度較好,擬合方程分別為ln(1?M)=?0.771 85t?0.046 22(R2=0.998 96)和 ln(1?M)=?0.763 80t?0.030 72(R2=0.999 32)

    表5 氟苯尼考緩釋顆粒體外累積釋放方程擬合Table 5 Fitting of cumulative release equations of florfenicol sustained-release granules

    3 討論與結(jié)論

    本研究選用合適的輔料充分混合和乳化,通過離心噴霧干燥技術(shù)制得了一種高度分散的氟苯尼考緩釋顆粒。氟苯尼考制劑配方中含有不能全部溶解于水或有機溶劑的輔料,為了完全提取緩釋顆粒中的氟苯尼考,確保測定結(jié)果的準確性,本研究提高了提取液中有機相的比例。通過高效液相色譜法檢測,不同批次制備的氟苯尼考緩釋顆粒中氟苯尼考實際含量在標示含量中占的比例均在95%~102%之間,符合藥典要求,RSD小于2.00%,表明氟苯尼考緩釋顆粒中藥物分布較均勻,制備氟苯尼考緩釋顆粒的工藝可達到要求。

    影響豬消化道pH的因素很多,正常胃腸道的pH在恒定范圍內(nèi)[12],豬胃部pH變化范圍為1.0~3.5,小腸和大腸pH變化范圍為4.0~7.0[13]。為更好地模擬胃腸道的酸堿環(huán)境,選擇pH 1.2鹽酸緩沖液、pH 4.3醋酸緩沖液和pH 6.8磷酸緩沖液作為體外溶出試驗的釋放介質(zhì)。氟苯尼考在水中的溶解度很低,為滿足漏槽條件,更好地模擬胃腸道環(huán)境,需在釋放介質(zhì)溶液中添加一定量的表面活性劑。本釋放度試驗中,因胃液只有少量的胃蛋白酶,模擬胃液的pH 1.2鹽酸緩沖液在沒有添加表面活性劑的情況下已滿足漏槽條件,因此不需加表面活性劑;在pH 4.3醋酸緩沖液和pH 6.8磷酸緩沖液中均需要加入表面活性物質(zhì)以滿足漏槽條件和更好地模擬腸道環(huán)境。常用的表面活性劑有SDS和吐溫?80,經(jīng)過一系列摸索,發(fā)現(xiàn)即使高濃度的吐溫?80也無法滿足漏槽條件,因此本試驗選擇SDS作為表面活性劑。考慮到SDS有可能損害色譜柱,以及在低溫狀態(tài)下析出堵塞高效液相色譜儀管路。因此對溶出樣品在上機檢測前要先進行凈化,4 ℃高速離心10 min,使SDS沉淀析出,棄沉淀物,得到澄清上清液,過0.45 μm孔徑的濾膜后上機檢測。經(jīng)過一系列探索,發(fā)現(xiàn)5 g/L的SDS添加量滿足漏槽條件,被本釋放度試驗采用。pH 1.2鹽酸緩沖液作為模擬胃液的溶劑,豬體內(nèi)腸道酸堿性條件及生物活性條件[14]模擬分別選擇均添加了5 g/L SDS的pH 4.3醋酸緩沖液和pH 6.8磷酸緩沖液。

    為評價研制的氟苯尼考緩釋顆粒在體外的釋放特征,將氟苯尼考緩釋顆粒置于pH 1.2鹽酸緩沖液、pH 4.3醋酸緩沖液和pH 6.8磷酸緩沖液的環(huán)境下考察其體外的釋放特征。結(jié)果顯示,氟苯尼考緩釋顆粒在模擬胃液環(huán)境(pH 1.2鹽酸緩沖液)中1 h內(nèi)不釋放,保證其在通過胃部的時候不受胃酸影響,避免在胃部因酸環(huán)境破壞微囊導致提前釋放,無法達到緩釋作用;在模擬腸液的環(huán)境(pH 4.3、6.8緩沖液)中,氟苯尼考緩釋顆粒緩慢且完全釋放,0.5 h釋放量為35.42%和34.30%,沒有出現(xiàn)突釋情況,2 h 釋放量為 80.16% 和 79.38%,5 h 釋放量為98.99%和96.70%,延緩藥物釋放的同時能促進完全釋放。相比于微球制劑,氟苯尼考緩釋顆粒的釋放時間更符合食物在豬消化道滯留的時間[15-16];相比于氟苯尼考腸溶緩釋包衣微粒制劑[17],緩釋顆粒的釋放量更為完全。由各模型擬合結(jié)果可知氟苯尼考緩釋顆粒的體外釋放符合First-order模型。

    本試驗所用到的離心噴霧干燥制粒技術(shù)中的噴霧干燥過程中水分蒸發(fā)迅速,僅需數(shù)秒就能完成干燥,快速制備出緩釋、穩(wěn)定的氟苯尼考產(chǎn)品。工藝過程較簡化,操作控制方便,節(jié)省了時間和工藝成本。此工藝制備的氟苯尼考緩釋顆粒具有良好的過胃耐酸性能,保證藥物不受胃酸影響的同時可使藥物在腸道中緩慢且完全釋放,延長藥物有效血藥濃度維持時間,提供持續(xù)穩(wěn)定的抑菌作用。在多次臨床給藥應用中,該氟苯尼考緩釋顆??煽s小峰谷濃度差,維持平穩(wěn)的有效血藥濃度,達到長效的效果。因此可減少臨床給藥次數(shù),進而減少藥物在生產(chǎn)上的用量,達到減少使用抗生素、避免產(chǎn)生胚胎毒性和免疫抑制的目的,為后續(xù)的臨床試驗研究和臨床使用藥物提供參考依據(jù)。

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