TNF-α 誘導(dǎo)的circMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖

白麗麗,湯華

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，天津市生命科學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，天津市炎癥生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

宮頸癌（cervical cancer，CC）作為最常見的婦科癌癥，具有很高的發(fā)病率和死亡率，在全世界由癌癥導(dǎo)致的死亡病例中位于第四位［1］。每年全球大約有50 萬名女性被確診為宮頸癌，其中因?yàn)閷m頸癌而死亡的人數(shù)更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了30 萬人［2］?？茖W(xué)證據(jù)清楚地表明，宮頸癌是由人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）某些基因型的持續(xù)感染引起的［3］。因此，近年來細(xì)胞學(xué)和/或HPV 篩查計(jì)劃成為預(yù)防宮頸癌的有效措施［4］，外科手術(shù)結(jié)合放療和化療是治療和增加宮頸癌患者生存時(shí)間的主要策略［5］。然而，由于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，宮頸癌患者的預(yù)后常常不如預(yù)期所料［6］。因此，深入研究宮頸癌發(fā)生的分子機(jī)制對(duì)開發(fā)新的癌癥相關(guān)生物標(biāo)志物以及尋找新的治療方法都是至關(guān)重要的。

環(huán)狀RNA（circRNA）是一種非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），也是近年來RNA 領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。CircRNA 不像線性RNA 那樣具有5′端帽結(jié)構(gòu)和3′端多聚體（A）尾，而是形成了具有共價(jià)鍵的封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)［7］。環(huán)狀RNA 不受RNA 核酸外切酶的影響，所以它的表達(dá)更穩(wěn)定［8］。這些特性使得環(huán)狀RNA 在作為新的臨床診斷標(biāo)志物的開發(fā)和應(yīng)用中具有明顯的優(yōu)勢。近來大量研究表明，circRNA 在許多生物過程中發(fā)揮重要作用［9］。在由特定蛋白質(zhì)復(fù)合物和互補(bǔ)RNA 元件調(diào)節(jié)的反向剪接后，circRNA可通過與miRNA 或RNA 結(jié)合蛋白相互作用參與腫瘤進(jìn)展［7，10-11］。越來越多的研究表明，circRNA 可以作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）而發(fā)揮作用。例如：circRNA cTFRC 可以通過充當(dāng)microRNA-107 的海綿，調(diào)節(jié)TFRC 的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展［12］。

研究表明circMAN1A2 在鼻咽癌、口腔癌、甲狀腺癌、卵巢癌和肺癌中表達(dá)上調(diào)，可能作為這些疾病的血清學(xué)標(biāo)志物，但其作用機(jī)制目前仍不明了［13］。在本研究中，通過RNA 高通量測序的方法發(fā)現(xiàn)TNF-α處理后HeLa 細(xì)胞中circMAN1A2 表達(dá)水平升高。過表達(dá)circMAN1A2 可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖能力。表明其在宮頸癌的診斷和治療中可能具有重要的潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 宮頸癌HeLa 和SiHa 細(xì)胞（ATCC，美國），RPMI 1640 液體培養(yǎng)基，DMEM 液體培養(yǎng)基（GIBCO，美國），細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，美國），胎牛血清（FBS;GIBCO，美國），TNF-α（碧云天生物科技有限公司，中國），RNase R（廣州吉賽生物科技有限公司，中國），RNA 分離試劑盒（Active motif，美國），MTT（SIGMA-Aldrich，美國），LipofectamineTM 2000 regent（Invitrogen，美國）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞系HeLa 和SiHa細(xì)胞在含有8%或10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素和100 IU/mL 青霉素的RPMI-1640 或DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細(xì)胞孵育在37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 TNF-α 加藥處理 將HeLa 細(xì)胞接種至兩個(gè)100 mL 細(xì)胞培養(yǎng)瓶。40 h 后取出其中一瓶標(biāo)記為“TNF-α 組”，棄去原培養(yǎng)液，加入8 mL 含60 ng/mL TNF-α 的培養(yǎng)液，另一瓶標(biāo)記為“無處理組”，加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR） 使用SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，中國）進(jìn)行RT-qPCR 以檢測RNA 的表達(dá)水平。β-actin 作為內(nèi)源性對(duì)照。RT-qPCR 的所有引物如表1 所示。

1.2.4 CircMAN1A2 過表達(dá)及敲降 質(zhì)粒均由上海通用生物有限公司合成。

1.2.5 RNase R 耐受性 將HeLa 細(xì)胞接種到100 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，48 h 后提取宮頸癌細(xì)胞總RNA。用12 IU/μL RNaseR 處 理 后，通 過RT-qPCR 檢 測circMAN1A2 和lineMAN1A2 的表達(dá)水平。

表1 各基因引物序列Tab 1 Sequence of each gene primer

1.2.6 核質(zhì)RNA 分離 按照Active motif 說明書步驟進(jìn)行核質(zhì)RNA 分離。

1.2.7 Transwell 遷移/侵襲 轉(zhuǎn)染24 h 后，1×PBS洗滌細(xì)胞，重懸于無血清培養(yǎng)基中并接種到不含/含Matrigel 的transwell 上層小室進(jìn)行遷移（6×104細(xì)胞）/侵襲（8×104細(xì)胞）實(shí)驗(yàn)。下室加入600 μL 含有20%FBS 的細(xì)胞培養(yǎng)基。溫育48 h 或72 h，將遷移/侵襲的細(xì)胞用固定液（75%甲醇-25%冰醋酸）固定并用結(jié)晶紫染色。在100 倍放大倍數(shù)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，并在Nikon TE2000 顯微鏡下對(duì)遷移/侵襲的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.8 MTT 轉(zhuǎn)染 24 h 后，以4000/孔的密度將細(xì)胞接種到96 孔板。分別在24 h、48 h 和72 h 加入10 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h。避光棄去原含MTT 的培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，避光搖晃5 min，使甲瓚充分溶解。測定OD490 波長處的吸光度值。

1.2.9 集落形成 轉(zhuǎn)染24 h 后，以500/孔的密度將細(xì)胞接種到12 孔板。每3 d 更換1 次新鮮培養(yǎng)液，持續(xù)兩周。用結(jié)晶紫染色，然后計(jì)算相對(duì)細(xì)胞集落形成率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有作圖軟件均為GraphPad Prism 6.0。兩組間均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)方法進(jìn)行處理。所有數(shù)據(jù)結(jié)果均代表3 次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。以P ＜0.05 作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α 促 進(jìn)HeLa 細(xì) 胞 中circMAN1A2 表達(dá) TNF-α 處理后的RNA 高通量測序分析共檢測到98 種表達(dá)上調(diào)和63 種表達(dá)下調(diào)的circRNA。其中表達(dá)上調(diào)的circMAN1A2 來源于MAN1A2 母基因，位于1 號(hào)染色體第117402186-117405645 堿基。經(jīng)RT-qPCR 驗(yàn)證得知circMAN1A2 表達(dá)水平確實(shí)升高（P＜0.001，圖1A）。RNase R 耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相比于線性MAN1A2（lineMAN1A2），circMAN1A2更能夠耐受RNase R 消化（P＜0.05，P＜0.001，圖1B）。核質(zhì)RNA 分離實(shí)驗(yàn)表明circMAN1A2 主要定位于細(xì)胞核中（P＜0.001，圖1C）。

圖1 TNF-α 促進(jìn)HeLa 細(xì)胞中circMAN1A2 表達(dá)Fig 1 TNF-α promotes the expression of circMAN1A2 in HeLa cells

2.2 CircMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移能力 為了研究circMAN1A2 對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性行為的影響，構(gòu)建circMAN1A2 過表達(dá)及敲降質(zhì)粒，并用RTqPCR 檢測質(zhì)粒有效性。結(jié)果表明轉(zhuǎn)入circMAN1A2過表達(dá)質(zhì)粒后circMAN1A2 表達(dá)水平升高，line-MAN1A2 表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化；轉(zhuǎn)入circ-MAN1A2 敲降質(zhì)粒后circMAN1A2 表達(dá)水平降低，lineMAN1A2 表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，表明構(gòu)建的質(zhì)粒只影響環(huán)狀RNA 表達(dá)水平而不影響線性RNA表達(dá)（P＜0.01，圖2A）。細(xì)胞遷移是指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某種物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。細(xì)胞遷移是正常細(xì)胞的功能之一，并且與癌癥轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此利用transwell 遷移實(shí)驗(yàn)來研究circMAN1A2 對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)circMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移能力，敲降circMAN1A2 抑制宮頸癌細(xì)胞遷移能力（P＜0.05，P＜0.001，圖2B；P＜0.01，P＜0.001，圖2C）。

圖2 CircMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移Fig 2 CircMAN1A2 promotes the migration of cervical cancer cell

2.3 CircMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞侵襲能力 癌細(xì)胞侵襲是指腫瘤細(xì)胞向局部侵犯或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力。癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的特征之一，也是影響患者預(yù)后的主要因素。因此利用transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)來研究circMAN1A2 對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：過表達(dá)circMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞侵襲能力，敲降circMAN1A2 抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲能力（P＜0.01，圖3A；P＜0.01，P＜0.001，圖3B）。

圖3 CircMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞侵襲Fig 3 CircMAN1A2 promotes the invasion of cervical cancer cell

2.4 CircMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞活性 細(xì)胞活性是指細(xì)胞的生理狀態(tài)和功能?；罴?xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為不溶性甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。因此利用MTT實(shí)驗(yàn)來研究circMAN1A2 對(duì)腫瘤細(xì)胞活性的影響。過表達(dá)circMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞活性，敲降circMAN1A2 抑制宮頸癌細(xì)胞活性（P＜0.01，P＜0.001，圖4A；P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，圖4B）。

圖4 CircMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞活性Fig 4 CircMAN1A2 promotes the viability of cervical cancer cell

2.5 CircMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞體外增殖能力 單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)增殖6 代以上，其后代形成一個(gè)細(xì)胞群體，稱為集落。因此集落形成實(shí)驗(yàn)是檢測細(xì)胞增殖能力的有效方法之一。過表達(dá)circMAN1A2促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞體外增殖能力，敲降circMAN1A2抑制宮頸癌細(xì)胞體外增殖能力（P＜0.001，圖5A；P＜0.001，圖5B）。

圖5 CircMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞體外增殖能力Fig 5 CircMAN1A2 promotes the proliferation of cervical cancer cells in vitro

3 討論

研究表明，宮頸癌是由HPV 某些基因型的持續(xù)感染引起的。而炎性細(xì)胞因子TNF-α 誘導(dǎo)的核因子-κB 活化是炎癥導(dǎo)致癌癥的常見機(jī)制。研究表明TNF-α 誘導(dǎo)的慢性炎癥能夠增加細(xì)胞的易感性并導(dǎo)致惡性腫瘤的進(jìn)展［14-15］。在慢性炎癥轉(zhuǎn)化為癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)現(xiàn)了很多miRNA，如miR-10a、miR-320a、miR-495 等與結(jié)腸癌或胃癌的進(jìn)展有關(guān)［16-18］。筆者實(shí)驗(yàn)室之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些miRNA 受核因子-κB 轉(zhuǎn)錄調(diào)控，其中miR-23a 和miR-429 分別通過靶向核因子-κB 抑制蛋白激酶（IKK）α 和IKKβ 形成了反饋調(diào)節(jié)環(huán)［19-20］。但是，與慢性炎癥轉(zhuǎn)化為癌癥相關(guān)的circRNA 的研究卻幾乎沒有。因此，對(duì)這類circRNA 的研究將為宮頸癌的診斷和治療提供新的臨床依據(jù)。

近年來，大量研究表明，circRNA 與多種人類疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在幾種人類癌癥中充當(dāng)必需的調(diào)節(jié)劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多circRNA 在宮頸癌中異常表達(dá)。例如，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，hsa_circRNA_101996 在宮頸癌組織中高表達(dá)，較高水平的hsa_circRNA_101996 與宮頸癌患者的預(yù)后不良有關(guān)，機(jī)制上，hsa_circRNA_101996通過miR-8075/TPX2 途徑抑制了宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［21］。此外，hsa_circ_0000263 可通過影響miR-150-5p 調(diào)節(jié)MDM4 的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移能力［22］。過表達(dá)的circ_0067934 可以通過miR-545/EIF3C 軸促進(jìn)宮頸癌進(jìn)展［23］。

本文研究結(jié)果表明，炎性細(xì)胞因子TNF-α 促進(jìn)circMAN1A2 的表達(dá)，過表達(dá)circMAN1A2 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。提示circMAN1A2 可能參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，并且可能為宮頸癌的診斷治療和預(yù)后提供新的思路。