RP-HPLC法測(cè)定甘氨酸原料藥有關(guān)物質(zhì)研究

趙士敏 許 崗 施細(xì)文 王 敏

（湖南福來格生物技術(shù)有限公司，湖南 長沙 410000）

甘氨酸（Glycine，縮寫Gly）又名氨基乙酸，甘氨酸是內(nèi)源性抗氧化劑還原性谷胱甘肽的組成氨基酸，機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重應(yīng)激時(shí)常用外源補(bǔ)充，有時(shí)也稱為半必需氨基酸[1]。甘氨酸在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2]。在醫(yī)藥行業(yè)中可以用作氨基酸制劑、抗胃酸沖劑以及其他賦形劑[3]。甘氨酸的工業(yè)生產(chǎn)方法主要有3 種，天然蛋白質(zhì)水解法、氯乙酸氨解法和Strecker 法。目前國內(nèi)普遍采用氯乙酸氨解法，國外則以Strecker 法為主。甘氨酸的原料藥中可能會(huì)產(chǎn)生甘氨酸酐、亞氨基二乙酸、2-氯乙酸、雙甘氨肽、三甘氨肽等雜質(zhì)，但是國內(nèi)尚未有關(guān)于測(cè)定甘氨酸原料藥中這些雜質(zhì)的報(bào)道。為了有效控制甘氨酸原料藥的質(zhì)量，保證用藥安全，該實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定甘氨酸原料藥中的上述5 種雜質(zhì)，為原料藥的質(zhì)量控制提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20AT 高效液相色譜儀；梅特勒320pH 酸度計(jì)；奧豪斯EX225DZH 十萬分之一天平；抽濾裝置、微孔濾膜（硝化纖維型，φ50 cm，孔徑0.22 μm）；上海一恒科學(xué)儀器有限公司[4]。

甘氨酸3 批：由湖南寶利士生物技術(shù)有限公司提供，甘氨酸酐（含量≥98%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)），亞氨基二乙酸（含量≥98%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，），2-氯乙酸（含量≥98%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)），雙甘肽（含量≥98%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)），三甘氨肽（含量≥98%，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)），以上標(biāo)準(zhǔn)物均有Sigma 公司提供。庚烷磺酸鈉、磷酸（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，超純水：由DZG-303A 艾科超純水機(jī)制得，乙腈（HPLC 級(jí)）：Merck 公司[5]。

1.2 溶液的配制

流動(dòng)相溶液：稱取庚烷磺酸鈉2.24 g，加水975 mL 溶解后，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.2，過濾后，再加入25 mL 乙腈，超聲。

稀釋劑溶液：同流動(dòng)相溶液。

對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：稱取各組分雜質(zhì)對(duì)照品約25 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度。（溶液濃度為500 μg/mL）。

各組分對(duì)照二級(jí)儲(chǔ)備液：精密量取各組分對(duì)照品貯備液0.5 mL，置10 mL 量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度。（溶液濃度為25 μg/mL）。

對(duì)照品溶液：稱取甘氨酸25 mg 和各組分對(duì)照品二級(jí)貯備液1.0 mL，置于同一50 mL 量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度。

各組分對(duì)照溶液：精密稱取雜質(zhì)甘氨酸酐、亞氨基二乙酸、2-氯乙酸、雙甘氨肽、三甘氨肽對(duì)照品各約10 mg，分別至5 個(gè)50 mL 容量瓶中，加溶劑溶解后稀釋至刻度，搖勻，分別作為各組分的對(duì)照溶液。（溶液濃度為0.5 mg/mL）。

供試品溶液：稱取該品約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加稀釋劑溶解并稀釋至刻度。

80%限度加標(biāo)供試品溶液：精密稱取甘氨酸25.0 mg，加入50 mL 容量瓶中，加入各組分對(duì)照品二級(jí)貯備液0.8 mL，加稀釋劑稀釋至刻度，平行制備3 份。

100%限度加標(biāo)供試品溶液：精密稱取甘氨酸25.0 mg，加入50 mL 容量瓶中，加入各組分對(duì)照品二級(jí)貯備液1.0 mL，加稀釋劑稀釋至刻度，平行制備3 份。

120%限度加標(biāo)供試品溶液：精密稱取甘氨酸25.0 mg，加入50 mL 容量瓶中，加入各組分對(duì)照品二級(jí)貯備液1.2 mL，加稀釋劑稀釋至刻度，平行制備3 份。

1.3 分析方法

色譜柱CenturySIL C18-AQ（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相（含2.24 g/L 庚烷磺酸鈉，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.2）-乙腈（97.5 ∶2.5），檢測(cè)波長為200 nm，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25 ℃。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性與儀器精密度

將對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 針，考察各峰間的分離度、理論塔板數(shù)、拖尾因子、各峰保留時(shí)間的RSD、各峰峰面積的RSD。結(jié)果表明，在該條件下各峰間的分離度≥1.5，理論塔板數(shù)≥2 000，拖尾因子≤2.0。各峰保留時(shí)間RSD ≤1%，主峰面積RSD ≤2%，雜質(zhì)峰面積RSD ≤10%。結(jié)果見表1，色譜圖如圖1 所示。

表1 系統(tǒng)適用性與儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2 定量限

取各成分對(duì)照品溶液，用稀釋劑不斷稀釋，精密量取20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，直至峰信噪比（S/N）≥10，計(jì)算各成分定量限和定量限濃度。配制6 份定量限溶液，精密量取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計(jì)算各成分峰面積RSD 和保留時(shí)間RSD。

結(jié)果表明：信噪比（S/N）≥10，6 份定量限溶液中各峰的保留時(shí)間RSD ≤1.0%，峰面積RSD ≤10%。定量限測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 定量限測(cè)定結(jié)果

2.3 檢測(cè)限

取定量限項(xiàng)下的定量限溶液，用稀釋劑稀釋，精密量取20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，當(dāng)信噪比（S/N）≥3，計(jì)算各成分檢測(cè)限和檢測(cè)限濃度。

檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果見表3。

圖1 液相色譜圖

表3 檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果

2.4 線性與范圍

精密量取對(duì)照品二級(jí)貯備液（25 μg/mL）0.3 mL、0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL 和1.2 mL，分別置50 mL 量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

對(duì)上述溶液的濃度（x）與相應(yīng)的峰面積（y）作線性回歸，計(jì)算回歸方程及其相關(guān)系數(shù)R、斜率K、截距。

結(jié)果表明各組分在00.6 μg/mL～0.6 μg/mL 濃度范圍內(nèi)（相當(dāng)于測(cè)定濃度0%～0.12%，相當(dāng)于含量0%～0.12%，相當(dāng)于限度濃度0%～120%），峰面積與濃度呈線性關(guān)系（R ＞0.998）?；貧w方程與線性范圍見表4。

表4 各雜質(zhì)回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.5 準(zhǔn)確度

按照“1.3”介紹的方法，分別取供試品溶液、80%限度加標(biāo)供試品溶液、100%限度加標(biāo)供試品溶液、120%限度加標(biāo)供試品溶液，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以外標(biāo)法測(cè)定并計(jì)算含量，雜質(zhì)甘氨酸酐、亞氨基二乙酸、2-氯乙酸、雙甘氨肽、三甘氨肽9 次測(cè)定的平均回收率分別為100.23%、98.58%、98.68%、99.69%、99.97%，RSD 值分別為1.20%、0.33%、0.86%、1.15%、0.82%。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度均良好。

2.6 耐用性

分別調(diào)節(jié)流速為0.8 mL/min 與1.2 mL/min、柱溫20 ℃與30 ℃、pH=2.1 與pH=2.3、流動(dòng)相比例緩沖液∶乙腈=98.5 ∶1.5 和緩沖液：乙腈=96.5 ∶3.5 時(shí)，進(jìn)樣對(duì)照品溶液，結(jié)果表明，在上述各條件下進(jìn)行試驗(yàn)，甘氨酸色譜峰與各雜質(zhì)分離度均大于1.5，該方法耐用性良好[6]。

2.7 溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液于25 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中，按照“1.3”介紹的方法，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 進(jìn)樣分析，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，各雜質(zhì)在8 h 放置時(shí)間內(nèi)，含量相對(duì)穩(wěn)定。因此，供試品溶液配制完成后可在8 h 內(nèi)測(cè)定。

2.8 供試品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取該品3 批，按照“1.2”介紹的供試品溶液的配制方法，按照“1.3”介紹的方法進(jìn)行測(cè)定，雜質(zhì)甘氨酸酐、亞氨基二乙酸、2-氯乙酸、雙甘氨肽、三甘氨肽以外的標(biāo)法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)含量，其他單個(gè)最大雜質(zhì)與總雜質(zhì)以面積歸一化法測(cè)定，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，3 批甘氨酸有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果均符合要求。

表5 甘氨酸有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

3 討論

該研究對(duì)甘氨酸中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，篩選了不同類別的色譜柱及流動(dòng)相條件，最終以CenturySIL C18-AQ 作為分析柱時(shí)，色譜峰出峰快，分析周期短，基線平穩(wěn)，且分離度各項(xiàng)指標(biāo)滿足要求，色譜柱廉價(jià)、節(jié)約成本。由于甘氨酸及各雜質(zhì)均為兩性化合物，分子極性較大，在C18 固定相中的保留較弱，在方法開發(fā)的過程中，加入了離子對(duì)試劑庚烷磺酸鈉，其庚烷基與色譜柱的固定相吸附結(jié)合，暴露出磺酸基負(fù)離子，吸附流動(dòng)相中的陽離子被分析物，增強(qiáng)陽離子化合物的保留。該試驗(yàn)中通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 值，實(shí)現(xiàn)了甘氨酸和各雜質(zhì)的有效分離。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，隨著柱溫的升高，各成分出峰時(shí)間縮短，柱溫為20 ℃、25 ℃、30 ℃時(shí)，各色譜峰之間均能滿足分離的要求，綜合考慮選定柱溫為25 ℃。隨著流速的增加，各成分出峰時(shí)間縮短，各色譜峰之間滿足分離的要求，選定流速為1.0 mL/min。該方法簡便、準(zhǔn)確，能夠?yàn)楦拾彼岬馁|(zhì)量控制提供依據(jù)。