武陵山區(qū)淋病奈瑟菌對(duì)7種抗菌藥物的耐藥情況及分子生物學(xué)特征分析*

向 波，向 輝，周衛(wèi)華，劉龍亞，印道春，龍文志，張建軍，符自清△

吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院(湘西土家族苗族自治州人民醫(yī)院)：1.檢驗(yàn)科；2.腫瘤科；3.產(chǎn)前診斷中心；4.泌尿一科；5.皮膚科，湖南湘西 416000；6.湖南省湘西土家族苗族自治州鳳凰縣民族中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南湘西 416200；7.湖南省張家界市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南張家界 427000

自20世紀(jì)30年代以來，人們已成功使用百浪多息治療淋病，抗菌藥物治療淋病已有近百年歷史。然而，淋病奈瑟菌(NG)是一種對(duì)抗菌藥物具有強(qiáng)大抵抗力的特殊細(xì)菌，其借助耐藥基因水平轉(zhuǎn)移和耐藥質(zhì)粒傳播等方式，先后對(duì)磺胺類、氨基糖苷類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類等多種抗菌藥物產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性[1]。目前，NG是WHO重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的病毒細(xì)菌之一。頭孢曲松(CRO)是最后一種可以單獨(dú)用于治療淋病的一線抗菌藥物。因此，頭孢菌素耐藥NG的出現(xiàn)和播散給淋病的治療帶來了極大的威脅[2-4]。國(guó)際上已經(jīng)將多重耐藥NG的傳播視作能影響全球公眾健康的重大公共衛(wèi)生事件[5]。目前，WHO估計(jì)全球有7 830萬成人患有淋病，中國(guó)每年新增11萬例；并且低收入國(guó)家尚缺乏有效管控淋病的資源和措施[6-7]。

武陵山區(qū)為國(guó)家集中連片特困山區(qū)，醫(yī)療資源有限，淋病的防控需求更大。因此，本研究檢測(cè)了武陵山區(qū)NG菌株對(duì)7種抗菌藥物的敏感性，篩查了CRO耐藥的NG，并對(duì)CRO低敏感和耐藥菌株采用多抗原序列分型法(NG-MAST)進(jìn)行分型，構(gòu)建了POR和TBPB基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，從分子生物信息學(xué)角度探討耐藥菌株的流行病學(xué)特征?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年4月1日至2019年3月31日武陵山區(qū)(吉首、張家界、鳳凰、龍山、永順、花垣和懷化)各地區(qū)醫(yī)院就診的122例NG培養(yǎng)陽性的淋病患者為研究對(duì)象。其中男97例，女25例；年齡13～66歲，中位年齡35.1歲。

1.2方法 標(biāo)本采集方法參照文獻(xiàn)[8]。轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的GC瓊脂、血紅蛋白、1%生長(zhǎng)添加劑、粘菌素、萬古霉素、制霉菌素和甲氧芐氨嘧啶。

1.2.1菌種鑒定與保存 分離培養(yǎng)基使用改良Thayer-Martin瓊脂平板(美國(guó)BD公司)。并使用革蘭染色和Vitek NH卡(梅里埃公司)進(jìn)行菌種鑒定，所有菌株在-75 ℃保存于20%的脫脂牛奶中。

1.2.2抗菌藥物與藥敏試驗(yàn) CRO、頭孢泊肟(CPD)和頭孢克肟(CFM)濃度為0.015～4.000 μg/mL，阿奇霉素(AZM)濃度為0.06～4.00 μg/mL(Sigma Aldrich公司，瓊脂稀釋法)。環(huán)丙沙星(CIP)5 μg、四環(huán)素(TCY)30 μg、壯觀霉素(SH)100 μg(OXOID公司，K-B法)。質(zhì)控菌株ATCC 49226。用瓊脂稀釋法檢測(cè)3種頭孢菌素及AZM對(duì)所有菌株的最低抑菌濃度(MIC)[8]。K-B法檢測(cè)其余3種抗菌藥物敏感性。所有CRO低敏感性及耐藥菌株均送吉首大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科復(fù)檢。

1.2.3結(jié)果判讀 MICCRO≤0.125 μg/mL為敏感，0.060～0.125 μg/mL為低敏感性，其余為耐藥；MICCPD≤0.500 μg/mL為敏感，其余為耐藥；MICCFM≤0.125 μg/mL為敏感，其余為耐藥。CIP的抑菌圈直徑≥41 mm為敏感，28～40 mm為中介，≤27 mm為耐藥；TCY的抑菌圈直徑≥38 mm為敏感，31～37 mm為中介，≤30 mm為耐藥；SH的抑菌圈直徑>18 mm為敏感，15～17 mm為中介，<14 mm為耐藥。MICAZM≤0.25 μg/mL為敏感，>0.25 μg/mL為耐藥。瓊脂稀釋法的折點(diǎn)參考?xì)W洲藥敏試驗(yàn)委員會(huì)(EUCAST)公布的數(shù)據(jù)(www.eucast.org)，由于EUCAST無CPD數(shù)據(jù)，故參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI) M100-S28進(jìn)行判斷。K-B法的折點(diǎn)也參照CLSI M100-S28進(jìn)行判斷。

1.2.4POR基因和TBPB基因系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 提取MICCRO≥0.060 μg/mL NG菌株的基因組DNA(上海生工試劑)，PCR引物及擴(kuò)增條件參考NG-MAST進(jìn)行基因分型，采用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1NG菌株的耐藥率 CRO藥率最低(1.64%)，CIP耐藥率最高(84.43%)。非頭孢菌素類藥物耐藥率高于頭孢菌素類。3種頭孢菌素的耐藥率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.330，P=0.026)，CFM和CPD耐藥率高于CRO(P<0.05)，見表1。

2.2NG菌株對(duì)相關(guān)抗菌藥物的MIC值 2株CRO耐藥菌株，其中1株屬于高水平CRO耐藥，MICCRO為1.000 μg/mL。31株為CRO低敏感性菌株。26株AZM耐藥菌株，MICAZM≥0.500 μg/mL，見表2。

表1 122株NG菌株對(duì)7種抗菌藥物敏感性[n(%)]

注：不同抗菌藥物的耐藥率進(jìn)行比較時(shí)，將中介數(shù)據(jù)歸為耐藥。

表2 NG菌株對(duì)相關(guān)抗菌藥物MIC值的檢測(cè)情況(n)

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2.3CRO低敏感性及耐藥NG菌株分子生物學(xué)信息 33株NG菌株有31種POR等位基因型，分為2個(gè)群，其中POR632單獨(dú)構(gòu)成一群，其余30種構(gòu)成另一個(gè)大群，見圖1。TBPB基因有15個(gè)等位基因型，優(yōu)勢(shì)基因型是ST4、ST5、ST16、ST26、ST29、ST33、ST112、ST137型。2株耐藥NG菌株NG-MAST型分別為ST2987和ST14155。

注：▲為MICCRO=1.000 μg/mL；■為MICCRO=0.250 μg/mL。

圖133株MICCRO≥0.060 μg/mL的NG菌株P(guān)OR基因和TBPB基因系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

廣譜頭孢菌素是淋病治療的最后防線[2]。日本、西班牙、澳大利亞和法國(guó)均報(bào)道了CRO耐藥NG菌株，CRO耐藥NG菌株極有可能已經(jīng)播散于世界各地[9-13]。因此，臨床將面臨難以治療的多重耐藥NG菌株。本研究結(jié)果顯示，共檢測(cè)出1株CRO高水平耐藥菌株，MICCRO為1.000 μg/mL，另發(fā)現(xiàn)1株MICCRO為0.250 μg/mL的耐藥菌株。NG-MAST分型研究顯示，這兩株耐藥菌株分別為ST2987型和ST14155型；POR和TBPB基因型分別為ST632和ST137，ST8178和ST110。這兩株菌株的POR和TBPB基因型在系統(tǒng)發(fā)育樹中均分別屬不同大群，遺傳距離也相差較遠(yuǎn)。二者分子生物學(xué)信息差距較大，同時(shí)結(jié)合前述基因型和藥敏表型的差異，可以推測(cè)這兩株菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且流行病學(xué)來源不同。鑒于此，由于ST2987獨(dú)特的基因分型和高水平CRO耐藥性，該菌株可能攜帶某種對(duì)CRO高水平耐藥的基因。然而，國(guó)內(nèi)有關(guān)CRO高水平耐藥NG菌株的報(bào)道較少，這可能與淋病監(jiān)控網(wǎng)絡(luò)不健全以及檢測(cè)力度欠缺有關(guān)。

本研究藥敏結(jié)果顯示，武陵山區(qū)NG菌株對(duì)頭孢菌素類耐藥率明顯高于歐美國(guó)家[14]。且本研究分離的122株NG菌株對(duì)3種第三代頭孢菌素類抗菌藥物(CRO、CPD和CFM)耐藥率為1.64%～9.84%，耐藥率較高，可能與多數(shù)患者可自行購(gòu)買口服頭孢菌素等抗菌藥物有關(guān)，導(dǎo)致耐藥NG菌株產(chǎn)生。2012年，歐洲淋病治療指南指出，已經(jīng)不再將CFM列為一線用藥[15]。目前，唯一可靠的“經(jīng)驗(yàn)性”治療是注射CRO，而口服800 mg CFM的治療方案，同時(shí)需要藥敏試驗(yàn)結(jié)果的支持[10]。因此，本地區(qū)不應(yīng)再將CPD和CFM作為治療淋病的一線藥物。

AZM亦是治療淋病的一線藥物。本研究結(jié)果顯示，本地區(qū)NG菌株對(duì)AZM耐藥率達(dá)21.31%，超過WHO制定的治療NG抗菌藥物監(jiān)測(cè)計(jì)劃(GASP)數(shù)據(jù)上限值4倍(中國(guó)，0.1%～5.0%)，接近日本和我國(guó)香港地區(qū)報(bào)道的數(shù)據(jù)(6%～30%)，與南京地區(qū)(32.3%)的耐藥率有較大差別[14,16]。鑒于本地區(qū)NG對(duì)AZM和CRO均有較高耐藥率，建議本地醫(yī)療機(jī)構(gòu)采納國(guó)際認(rèn)可的“二聯(lián)療法”(1.5 g AZM口服與250 mg CRO肌肉注射或靜脈滴注[14])，以預(yù)防“超級(jí)耐藥NG”菌株產(chǎn)生和傳播。

此外，CIP、TCY和SH耐藥率分別為84.43%、 60.66%和14.75%，與國(guó)外有關(guān)研究結(jié)果類似[17]。上述藥物可以用于治療特殊人群，如頭孢菌素類過敏患者、孕婦、哺乳期女性、兒童、有出血傾向的老年患者以及腎功能異?；颊叩?。

武陵山區(qū)有超過1 100萬的少數(shù)民族，存在貧困人口分布廣、醫(yī)療資源有限、漏診率高以及抗菌藥物使用不合理等問題。由于本地區(qū)經(jīng)濟(jì)和衛(wèi)生條件較為落后，NG菌株頭孢菌素類耐藥情況尚需進(jìn)一步研究。嚴(yán)密監(jiān)控頭孢菌素耐藥的NG菌株播散，應(yīng)是本地區(qū)今后衛(wèi)生工作重心之一?？傊?，本地區(qū)NG耐藥防控形勢(shì)嚴(yán)峻，普遍開展藥敏試驗(yàn)和深入研究耐藥機(jī)制是加強(qiáng)淋病管控的重要手段[10,18]。

致謝：

衷心感謝南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院何軍主任對(duì)本課題的指導(dǎo)，感謝湖南省懷化市第一人民醫(yī)院張勇醫(yī)生，龍山縣人民醫(yī)院朱萍主任，花垣縣人民醫(yī)院向陽主任和吉首大學(xué)附屬第二醫(yī)院陳滔主任在病例收集和細(xì)菌培養(yǎng)中付出的辛勤勞動(dòng)。