河南省南陽市某豬場一例豬流行性腹瀉的實驗室診斷

金喜新，王宏亮，劉凡，孟偉，賈廣敏，呂婧玉，李杰如

(1.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，鄭州 450008;2.河南省科學(xué)技術(shù)協(xié)會，鄭州 450008)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳染性腸道疾病，臨床上以嘔吐、水樣腹瀉、脫水死亡和哺乳仔豬高致死率為主要特征[1]。各種年齡段的豬只均易感染。1978年，比利時首次分離鑒定出該病毒，命名為 CV777[2]。隨后，匈牙利、德國、泰國、韓國、日本、中國、美國等國家都陸續(xù)報道了本病。PEDV造成的危害非常嚴(yán)重，2010-2011年，我國有100多萬頭豬死于 PEDV[3]，2013年美國暴發(fā)PED疫情，當(dāng)年美國損失了700萬頭仔豬[4]?，F(xiàn)在PED已經(jīng)成為影響?zhàn)B豬產(chǎn)業(yè)的主要疫病之一。目前，在我國豬病毒性腹瀉病例中，感染PEDV的病例最多且最為嚴(yán)重[5]，沒有得到有效的控制，是威脅養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一。豬流行性腹瀉最主要的傳染源是患病豬和帶毒豬，體內(nèi)的病毒會隨著糞便、唾液等排泄物、分泌物大量排出從而污染環(huán)境以及生產(chǎn)用具，被污染的飲水以及飼料等被易感豬攝入到體內(nèi)會引起機(jī)體發(fā)病[6-8]。PEDV經(jīng)常與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(PoRV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)、豬嵴病毒(PKV)等病毒混合感染[9-11]。PEDV為冠狀病毒屬的成員，為單股正鏈 RNA病毒，PEDV的基因組全部長度約為28 kb，主要的結(jié)構(gòu)蛋白為S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白。在PEDV基因遺傳進(jìn)化分析和多樣性分析中，特別以S蛋白、N蛋白、M蛋白研究的最多，M基因具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，所以M基因也常用來對PEDV進(jìn)行鑒定[12-13]。河南省南陽市某規(guī)模化養(yǎng)豬場有能繁母豬500頭，2019年1月，豬只開始發(fā)生腹瀉病，發(fā)病母豬50頭，哺乳仔豬約150頭，且發(fā)病豬只集中在同一或者臨近產(chǎn)房，哺乳仔豬致死率非常高，給豬場造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為查明病因，現(xiàn)場檢查后并采集樣品進(jìn)行實驗室檢驗。

1 材料與方法

1.1 樣品收集 無菌采集發(fā)病哺乳仔豬糞便、唾液以及心臟、脾臟、空腸等。

1.2 常規(guī)檢查

1.2.1 流行病學(xué) 通過現(xiàn)場檢查并詢問場主以了解本次腹瀉流行情況。

1.2.2 臨床觀察 按常規(guī)方法對仔豬和母豬臨床癥狀進(jìn)行觀察，并記錄其精神狀態(tài)、飲食、體溫變化、排泄情況等臨床表現(xiàn)。

1.2.3 病理解剖觀察 用75%酒精擦拭仔豬體表，在超凈工作臺中打開豬胸腔和腹腔，觀察并拍照記錄心、肝、脾、肺、腎、腸道組織、腸系膜淋巴結(jié)和其他一些器官組織的病理學(xué)和形態(tài)學(xué)變化。采集各器官部分組織至4%甲醛溶液中保存，以備后續(xù)研究。

1.2.4 組織病理學(xué)觀察 首先將保存于4%甲醛中空腸組織、盲腸組織、結(jié)腸組織、十二指腸、回腸組織、直腸組織取出，切成1.0x1.0x0.2 cm組織塊，置于包埋盒中，自來水清洗，然后依次進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、展片、貼片、烤片等，最后進(jìn)行HE染色。染色后將組織切片置普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 RT-PCR檢測

1.3.1 樣品處理 在采集的糞便和唾液的棉拭子試管中加入適量DMEM混合后，轉(zhuǎn)移到高壓滅菌后的EP管中，然后經(jīng)過離心處理，取其上清液分裝到其他管中然后-40 ℃低溫保存。腸道組織和器官組織要取其一小部分剪碎然后在加入液氮的研缽中反復(fù)研磨，研磨結(jié)束后加入適量DMEM混合制成勻漿，然后將組織勻漿轉(zhuǎn)移到滅菌后的EP管中，經(jīng)離心操作后取上清分裝到其他EP管中并-40 ℃低溫保存。

1.3.2 引物的設(shè)計與合成 參照美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)中登錄的 PEDV的M基因保守序列(基因序列號：KM048291.1)、TGEV的N基因保守序列(基因序列號：KX499468.1)、PDCoV的S基因保守序列(基因序列號：MK478383.1)、使用 Primer premier 6.0 軟件設(shè)計出針對以上基因的特異性檢測引物，引物由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。引物相關(guān)信息見表1。

1.3.3 提取RNA與反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 使用Trizol法提取RNA，按照普通提RNA的步驟進(jìn)行操作，提取RNA時注意防止污染。提取的RNA可以直接用于反轉(zhuǎn)錄或者-40 ℃低溫保存。反轉(zhuǎn)錄時按照購買的Vazyme 反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明書步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，我們使用體積為20μL的反應(yīng)體系。我們最終得到cDNA產(chǎn)物，產(chǎn)物可以直接用于PCR反應(yīng)也可以-40 ℃低溫保存。

1.3.4 PCR擴(kuò)增 把已經(jīng)反轉(zhuǎn)錄好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分三組進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，分別為PEDV、TGEV、PDCoV目的片段擴(kuò)增。這三組RT-PCR 反應(yīng)體系總體積都為25 μL，各組按照嚴(yán)格用量加入特定的酶、水和上下游引物，同時每組設(shè)兩個對照，陰性對照都為2 μL滅菌水，陽性對照分別為已知的 PEDV的M基因、TGEV的N基因、PDCoV的S基因各cDNA 2 μL，充分保證了試驗結(jié)果準(zhǔn)確性。程序設(shè)定見表2。然后結(jié)果使用凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)處理下觀察并判定結(jié)果。

表1 RT-PCR 擴(kuò)增引物信息Tab 1 The information of primers used for RT-PCR amplification

表2 PCR擴(kuò)增程序Tab 2 PCR Amplification Program Setting

2 結(jié)果分析

2.1 發(fā)病情況 河南南陽市某豬場母豬發(fā)病50頭、仔豬發(fā)病150頭，母豬發(fā)病無死亡現(xiàn)象，仔豬發(fā)病死亡135頭，并且發(fā)病相對集中。經(jīng)與豬場場主交談，得知該豬場已經(jīng)注射豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒三聯(lián)疫苗。

2.2 臨床觀察結(jié)果 臨床上出現(xiàn)母豬腹瀉、精神沉郁、營養(yǎng)不良，豬舍內(nèi)部臟亂、糞便橫流，仔豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、體溫升高、發(fā)育不良、食欲下降、毛發(fā)凌亂且沾滿糞便和嘔吐液、消瘦、站立不穩(wěn)、病死率高、發(fā)病較為集中。臨床觀察如圖1。

A:嚴(yán)重腹瀉導(dǎo)致肛門紅腫 B:仔豬腹瀉 A:Anal redness caused by severe diarrhea in piglets B:Piglet diarrhea圖1 仔豬臨床癥狀Fig 1 clinical symptoms of piglets

2.3 剖檢結(jié)果 對仔豬進(jìn)行剖檢觀察，發(fā)現(xiàn)胃內(nèi)充滿大量氣體，導(dǎo)致胃脹氣，且胃內(nèi)有黃色粘稠物，腸道普遍出現(xiàn)脹氣，腸道內(nèi)出現(xiàn)黃色液體，空腸脹氣尤為嚴(yán)重，腸壁變薄變透明，缺乏彈性，腸壁和腸系膜有出血情況(圖2)。

2.4 組織病理觀察結(jié)果 取剖檢仔豬空腸、盲腸、回腸、結(jié)腸、十二指腸組織做病理切片，在顯微鏡下觀察結(jié)果并與正常腸道切片鏡檢圖對照(對照組來自河南省動物性食品重點實驗室)，發(fā)現(xiàn)各腸道出現(xiàn)不同程度病變，空腸出現(xiàn)明顯病變，表現(xiàn)為腸絨毛萎縮、脫落?；啬c腸道細(xì)胞堿性粒子增多。切片觀察及對照如圖3。

A:空腸出現(xiàn)腸絨毛萎縮(100×)B:健康仔豬空腸對照(100×)C：回腸細(xì)胞堿性染色顆粒增多(200×)D：健康仔豬回腸對照(200×) A:Intestinal villi atrophy in the Jejunum(100×)B:Negtive control of A(100×) C：Increase of alkaline particles in colon(200×)D:Negtive control of C(200×)圖3 腸道病理變化Fig 3 Intestinal pathological changes

2.5 RT-PCR鑒定結(jié)果 采集豬的糞便、唾液、空腸、脾臟、心臟樣品，運用RT-PCR方法同時進(jìn)行PEDV、PDCoV、TGEV三種病原檢測，結(jié)果顯示僅有脾臟和空腸PEDV檢出陽性，而其他組織既沒檢出PEDV，也沒有檢出PDCoV和TGEV。結(jié)果如圖4所示。

M:DL2000 DNA marker；N1:PDCoV陰性對照； 1:空腸組織；2:唾液；3:脾臟；4:糞液；5:心臟； P1:PDCoV陽性對照；N2:PEDV陰性對照； P2:PEDV陽性對照；N3:TGEV陰性對照；P3:TGEV陽性對照 M:DL2000 DNA marker；N1:PDCoVnegative control； 1: Jejunum tissue;2: saliva;3: spleen; 4:fecal liquid;5: heart；P1:PDCoVpositive control; N2:PEDVnegative control；P2:PEDVpositive control； N3:TGEVnegative control；P3:TGEVpositive control圖4 豬RT-PCR檢測結(jié)果Fig 4 pig RT-PCR sample test results

3 討論與結(jié)論

有研究顯示，自2010年以來，全球范圍內(nèi)爆發(fā)的大面積仔豬腹瀉給養(yǎng)豬行業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，給養(yǎng)豬行業(yè)帶來重創(chuàng)[14-16]，然而其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全了解。許多研究表明，目前引起仔豬腹瀉的病毒主要是PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV這四種[17-19]，而且豬流行性腹瀉是引起大多數(shù)豬腹瀉的主要疾病。趙勝杰等研究表明，PEDV在河南省內(nèi)具有一定的流行性。

經(jīng)過前期的流行病學(xué)調(diào)查，得知該豬場已經(jīng)注射過PEDV的疫苗，但是，經(jīng)過綜合診斷，本次發(fā)病仍是由于PEDV感染造成的，這可能是PEDV已經(jīng)發(fā)生了變異導(dǎo)致之前注射的傳統(tǒng)CV777疫苗不能產(chǎn)生保護(hù)作用，推測本場本次感染PEDV毒株與經(jīng)典疫苗毒株有差異，提示我們要針對新變異的毒株研制出新的疫苗。但是在當(dāng)下，建議豬場制定綜合治療和特異性治療措施，標(biāo)本兼治，及時控制疾病，減少經(jīng)濟(jì)損失。

目前，感染PEDV、TGEV、PDCoV的豬在臨床上所表現(xiàn)癥狀極為相似，都表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、食欲不振、精神萎靡等癥狀，臨床癥狀很難將其區(qū)分開來。而且這幾種病對腸道的感染造成的病變也極為相似，在組織病理學(xué)方面也很難將其區(qū)分。故只能采取的是其他更有效的診斷方法進(jìn)行診斷，比如血清學(xué)方法、PCR等特異性實驗室診斷方法。本次采用的是RT-PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。該技術(shù)是比較快捷和方便的，也有相當(dāng)高的準(zhǔn)確性。通過RT-PCR技術(shù)方法我們最終確定本次豬場腹瀉病是由于感染PEDV造成。

通過本次試驗研究，建議PED預(yù)防免疫的主要工作是加大PEDV疫苗的研發(fā)力度，研制出新型的疫苗用來防控PEDV變異毒株的感染。