豬偽狂犬病病毒JSSQ2013株的分離鑒定及重要功能基因序列分析

孫雅鑫，韓劍鋒，榮先鋒

(北京維牧康動(dòng)保生物科技有限公司，北京101207)

偽狂犬病(Pseudorabies，PR) 是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染引起的多種家畜和野生動(dòng)物以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征的一種急性傳染病。PRV屬于皰疹病毒科(Herpesviridae)、α-皰疹病毒亞科、豬皰疹病毒屬，病毒粒子呈圓形或橢圓形，直徑在110～180 nm之間，呈二十面體對(duì)稱。豬是PRV的唯一自然宿主，各種年齡豬均可感染，主要危害懷孕母豬和哺乳仔豬，主要臨床特征是懷孕母豬繁殖障礙，哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及腹瀉。該病在世界范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害極大，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國將其列為二類動(dòng)物疫病。在歐美國家，通過使用標(biāo)記疫苗和相應(yīng)的鑒別診斷方法很好地控制或根除了該病，我國從匈牙利引進(jìn)了Bartha-K61 gE基因缺失弱毒活疫苗并在豬場(chǎng)中廣泛應(yīng)用，使PR疫情得到較好的控制，在2010年我國許多豬場(chǎng)已達(dá)到了凈化的狀態(tài)[1]。自2011年以來，我國多個(gè)地區(qū)(包括河南、河北、山東、山西等在內(nèi))已免疫PRV基因缺失疫苗的豬場(chǎng)呈現(xiàn)偽狂犬病暴發(fā)式流行，母豬產(chǎn)弱仔、死胎或木乃伊胎，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、死亡，死亡率達(dá)10%～50%，給我國養(yǎng)豬業(yè)再次造成了巨大損失。諸多研究學(xué)者認(rèn)為此次暴發(fā)可能是因?yàn)镻RV某些氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，致使變異株毒力增強(qiáng)，現(xiàn)有Bartha-K61疫苗也不能提供足夠的免疫保護(hù)力[2]，因此,迫切需要對(duì)變異流行毒株的毒力及分子特征進(jìn)行研究，以針對(duì)性地制定有效的防控措施。

本研究通過對(duì)采自江蘇省宿遷市的疑似病死豬病料進(jìn)行PCR檢測(cè)和病毒分離鑒定，對(duì)分離株的gB、gC、gD和gE等重要功能基因進(jìn)行了序列比對(duì)與分子遺傳進(jìn)化分析，確定基因型，并進(jìn)一步通過動(dòng)物試驗(yàn)測(cè)定其致病性，為了解江蘇PRV分子流行特征、豐富我國PRV分子流行病學(xué)資料及新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料 2013年5月，江蘇省宿遷市某規(guī)模化豬場(chǎng)疑似暴發(fā)豬偽狂犬病，剖檢發(fā)病死亡豬，采集肉眼病變明顯的腦、肺和淋巴結(jié)等組織樣品，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存。

1.2 細(xì)胞系與毒株 Vero細(xì)胞系由ATCC引進(jìn)(CCL-81)，本實(shí)驗(yàn)室保存。PRV閩A株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭白兔10只，1.0～1.4 kg，購自上海甲干生物科技有限公司。

1.4 主要試劑與儀器 病毒基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，LA Taq酶(含GC buffer)、DNA marker購自Takara公司，DMEM高糖培養(yǎng)基和胰酶均購自HyClone公司，胎牛血清購自GIBCO公司，PRV gp50單克隆抗體購自美國VMRD公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗鼠IgG H&L二抗購自Abcam公司。超凈臺(tái)、生物安全柜和細(xì)胞培養(yǎng)箱是哈東聯(lián)公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀為北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn)。凝膠成像系統(tǒng)為Alpha公司生產(chǎn)。離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品，電泳儀是北京六一儀器公司產(chǎn)品。

1.5 引物 引物的選擇與設(shè)計(jì)見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 本研究所用引物Tab 1 Primers used in this study

*參考PRV TJ株全基因組(Genbank: KJ789182.1)

1.6 病料的處理 用無菌鑷子和剪刀切取約1 g組織，加入適量DMEM進(jìn)行勻漿處理，凍融3次，8000 g離心2 min，取上清液于-80 ℃保存。

1.7 病毒DNA提取及PCR擴(kuò)增 病料檢測(cè)及病毒鑒定：取病料組織經(jīng)勻漿及離心處理后的上清液或純化的病毒，按照病毒基因組DNA提取試劑盒說明書操作方法提取病毒DNA。采用表1中的引物PRV-gG-1/PRV-gG-2與PRV-gE-nF/PRV-gE-n分別擴(kuò)增PRV gG和gE基因。PCR反應(yīng)體系：LA Taq (5 U/μL) 0.25 μL，2×GC Buffer II 12.5 μL，dNTP Mixture (2.5 mM/L each) 4.0 μL，DNA 模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，滅菌超純水5.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火30 sec，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，最后12 ℃保存。PCR結(jié)束后，取3 μL以上PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的片段的擴(kuò)增結(jié)果，基因理論大小gG基因約為277 bp，gE基因約為474 bp。

gB、gC、gD及gE全基因擴(kuò)增：按照病毒基因組DNA提取試劑盒說明書操作方法提取純化病毒上清液的病毒DNA。使用的引物見表1，反應(yīng)體系及條件同上。PCR結(jié)束后，取3 μL以上PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的片段的擴(kuò)增結(jié)果，各基因理論大小分別約為gB基因2869 bp、gC基因1607 bp、gD基因1470 bp、gE基因1942 bp。

1.8 測(cè)序與序列分析 瓊脂糖凝膠電泳后切取目的片段，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收DNA，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為表1中相應(yīng)的引物。獲得的序列首先在NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blast工具進(jìn)行比對(duì)，然后應(yīng)用DNASTAR中的MegAlign軟件將序列與Genbank中已公布的PRV參考株序列(表2)進(jìn)行多序列同源性對(duì)比分析。應(yīng)用MEGA 7.0軟件對(duì)gB、gC、gD和gE基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹，方法為Neighbor-Joining法(Bootstrap值為1000)。

表2 PRV毒株參考序列
Tab 2 PRV Reference sequences from GenBank

毒株Genbank登錄號(hào)分離地分離年份基因型/亞型EaKU315430中國1990經(jīng)典株FaKM189913中國2012經(jīng)典株SCKT809429中國1986經(jīng)典株HNXKM189912中國2012變異株HNBKM189914中國2012變異株HN1201KP722022中國2012變異株HeN1KP098534中國2012變異株JS-2012KP257591中國2012變異株ZJ01KM061380中國2012變異株TJKJ789182中國2012變異株HLJ8KT824771中國2012變異株DL14/08KU360259中國2014變異株BJ/YTKC981239中國2012變異株BeckerJF797219美國NA歐美株KaplanJF797218匈牙利NA歐美株BarthaJF797217匈牙利NA歐美株KolchisKT983811希臘2010歐美株NIA3KU900059英國2016歐美株

1.9 病毒分離與純化 將PCR檢測(cè)為陽性的病料組織上清液用0.22 μm微孔濾器過濾除菌后用DMEM作10倍稀釋，接種于長(zhǎng)滿Vero細(xì)胞單層的6孔板，每孔接種200 μL，共接種3孔，設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中感作1 h后用PBS洗2次，加入含2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞維持液，同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并每天觀察細(xì)胞病變情況。若接毒的細(xì)胞4 d后仍未出現(xiàn)病變，則收毒后再盲傳2代，仍未出現(xiàn)病變即視為陰性。若出現(xiàn)細(xì)胞病變則病變達(dá)80%以上后收毒，將細(xì)胞培養(yǎng)物于-80 ℃反復(fù)凍融2次后4000 g離心5 min，上清分裝至離心管中放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 病毒空斑純化 將盲傳收獲的病毒進(jìn)行空斑純化，純化方法為：將上述盲傳有CPE的病毒液作10倍系列稀釋至10-7，每個(gè)稀釋度取400 μL接種6孔板中的單層致密Vero細(xì)胞，1 h后棄上清，用1∶1的2×DMEM 培養(yǎng)基與融化的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖混合培養(yǎng)液鋪到6孔板中，室溫凝固后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。觀察CPE，當(dāng)空斑長(zhǎng)至合適大小后在顯微鏡下用槍頭挑取空斑溶于500 μL無血清的DMEM中，凍融后用相同的方法作下一輪空斑純化。經(jīng)3輪純化后的病毒接種于Vero細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收取病毒液于-80 ℃保存。

1.11 病毒鑒定

1.11.1 PCR鑒定 采用2.2項(xiàng)的方法對(duì)純化PRV病毒進(jìn)行PCR鑒定，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.11.2 IFA鑒定 取純化PRV病毒作10倍系列稀釋后接種于長(zhǎng)滿Vero單層細(xì)胞的24孔板，每個(gè)稀釋度接種3個(gè)孔，每孔200 μL，同時(shí)設(shè)立PRV閩A株陽性對(duì)照和Vero陰性空白對(duì)照。在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，每孔加入200 μL 4%甲醛固定液室溫固定30 min；PBS洗滌2次，每孔加入200 μL 0.1%Triton x-100穿透15 min；PBS洗滌2次，每孔加入200 μL PRV gp50單克隆抗體(用1%BSA作1∶1000稀釋)，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3次，每孔加入200 μL的羊抗小鼠IgG H&L (FITC)標(biāo)記二抗，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3次，置熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.12 TCID50測(cè)定 將純化PRV用DMEM做10倍系列稀釋，從10-1稀釋到10-9，取10-2～10-9稀釋度樣品分別接種長(zhǎng)滿Vero細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每稀釋度接種6孔，每孔100 μL。每個(gè)樣品做3次重復(fù)。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4 d后記錄CPE情況。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID50病毒含量。

1.13 一步生長(zhǎng)曲線繪制 在24孔板中接種Vero細(xì)胞培養(yǎng)至單層致密細(xì)胞，以1.0 MOI的PRV接種Vero細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)取上清液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)作3個(gè)重復(fù)，上清凍融后4000 g離心5 min，測(cè)定病毒TCID50，繪制純化病毒的一步生長(zhǎng)曲線。

1.14 動(dòng)物毒力試驗(yàn)

1.14.1 對(duì)新西蘭白兔的毒力試驗(yàn) 將10只新西蘭白兔隨機(jī)分為2組(攻毒組和對(duì)照組)，每組5只，攻毒組每只接種103TCID50的純化PRV，對(duì)照組接種DMEM，接種方式均為皮下注射，接種劑量均為1 mL/只，隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。

1.14.2 對(duì)仔豬的毒力試驗(yàn) 將10頭15日齡健康仔豬(PRV抗原、抗體陰性)隨機(jī)分成2組(攻毒組和對(duì)照組)，每組5頭，攻毒組通過滴鼻途徑攻毒106.0TCID50/mL的PRV JSSQ2013 2 mL，對(duì)照組滴鼻2 mL DMEM。同等飼養(yǎng)條件下隔離飼養(yǎng)，每天定時(shí)測(cè)量仔豬體溫、觀察臨床表現(xiàn)和死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料PCR檢測(cè) 采集疑似PRV感染發(fā)病死亡豬的腦、肺、淋巴結(jié)組織樣品，無菌處理樣品，提取病毒DNA，用PRV-gG-1/PRV-gG-2和PRV-gE-nF/PRV-gE-nR分別針對(duì)gG和gE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，所有樣品能擴(kuò)增到單一、明亮的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小均相符，分別為277 bp和474 bp(圖1)?；厥漳康臈l帶進(jìn)行測(cè)序，序列blast比對(duì)分析證實(shí)所有擴(kuò)增序列均為PRV序列。

M:DL2000 marker；1,6:腦；2,7:肺； 3,8:淋巴結(jié); 4,9:陽性對(duì)照；5,10:陰性對(duì)照。圖1 病料PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1

2.2 病毒分離與純化 將經(jīng)過除菌處理的腦組織懸液樣品，10倍稀釋后接種Vero細(xì)胞，接種24 h后，可觀察到細(xì)胞呈現(xiàn)圓縮并發(fā)亮、聚集、拉網(wǎng)等典型的細(xì)胞病變而對(duì)照組細(xì)胞沒有病變(圖2)。接種48 h后收毒，4000 g離心5 min，取上清作10倍系列稀釋進(jìn)行空斑純化，經(jīng)3輪空斑純化后獲得純化的病毒株。

A：接種腦組織懸液的細(xì)胞；B：正常細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D2 病毒分離細(xì)胞病變觀察Fig.2

2.3 PRV分離株鑒定

2.3.1 PCR鑒定 使用病毒DNA提取試劑盒提取上述純化的分離株的病毒DNA，同樣使用PRV-gG-1/PRV-gG-2和PRV-gE-nF/PRV-gE-nR引物分別針對(duì)gG和gE基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果顯示，分離株能擴(kuò)增到單一、明亮的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小均相符(圖3)。PCR產(chǎn)物測(cè)序的序列blast比對(duì)分析結(jié)果也顯示為PRV序列。

2.3.2 IFA鑒定結(jié)果 為了進(jìn)一步鑒定PRV分離株，采用PRV gp50單克隆抗體進(jìn)行IFA鑒定，結(jié)果顯示該分離株和陽性對(duì)照均可觀察到明顯的特異的綠色熒光，而陰性對(duì)照無熒光(圖4)，進(jìn)一步證明該分離株為PRV。如上所述，經(jīng)PCR和IFA鑒定證實(shí)，分離到一株P(guān)RV，命名為PRV JSSQ2013株。

M: DL2000 marker；1,4:PRV分離株； 2,5:陽性對(duì)照；5,10: 陰性對(duì)照。圖3 PRV分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.3

A:分離株；B:陽性對(duì)照；C: 陰性對(duì)照。圖4 PRV分離株IFA鑒定結(jié)果Fig.4

2.4 TCID50測(cè)定及生長(zhǎng)曲線 對(duì)純化的PRV JSSQ2013株收獲的培養(yǎng)上清進(jìn)行滴度測(cè)定，結(jié)果顯示病毒滴度平均為107.8TCID50/mL。以1.0 MOI的病毒接種24孔板培養(yǎng)的Vero細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)取上清液測(cè)定TCID50，繪制病毒一步生長(zhǎng)曲線，結(jié)果見圖5，在感染20 h后病毒滴度即達(dá)到最高，為108.6TCID50/mL，表明PRV JSSQ2013株在Vero細(xì)胞上的復(fù)制能力非常強(qiáng)。

A:分離株；B:陽性對(duì)照；C: 陰性對(duì)照。圖5 PRV JSSQ2013分離株一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定Fig.5

2.5 gB、gC、gD和gE基因序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化分析 將PRV JSSQ2013株的重要功能基因gB、gC、gD和gE基因序列與18株國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行序列同源性分析。結(jié)果顯示(表3)，PRV JSSQ2013株的gB、gC、gD和gE基因與所有參考株的核苷酸序列同源性分別為97.5%～99.6%、94.1%～99.6%、97.9%～99.6%和97.2%～99.7%，氨基酸序列同源性分別為95.5%～99.0%、91.5%～99.7%、96.2%～99.2%和95.1%～99.3%；與我國近幾年分離的PRV變異株序列相比核苷酸序列同源性分別為99.5%～99.6%、99.5%～99.6%、99.5%～99.6%和98.7%～99.7%，氨基酸序列同源性分別為98.9%～99.0%、99.5%～99.7%、99.0%～99.2%和98.1%～99.3%，均高于其與經(jīng)典毒株(Ea、Fa和SC株)和歐美毒株(Becker、Kaplan、Bartha、Kolchis和NIA3)的同源性。

表3 PRV JSSQ2013株與參考毒株gB、gC、gD和gE全基因核苷酸及推導(dǎo)氨基酸序列同源性比對(duì)Tab 3 Homology comparison of nucleotide and deduced amino acid sequences of gB, gC, gD and gE genes between PRV JSSQ2013 and reference strains

將PRV JSSQ2013株gB、gC、gD和gE 全基因序列與18株P(guān)RV參考毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析(圖6)。結(jié)果均顯示，18株P(guān)RV均可依據(jù)gB、gC、gD和gE基因序列劃分為中國型(Genotype II)和歐美型 (Genotype I)，中國型進(jìn)一步可劃分為變異株亞型 (Variant subtype) 和經(jīng)典株亞型 (Classical subtype)。本次分離得到的PRV JSSQ2013株與我國近幾年新分離的PRV變異毒株遺傳進(jìn)化距離最近，屬同一分支，因此該分離株屬于PRV變異株。

2.6 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 新西蘭白兔致病性試驗(yàn) 為了初步評(píng)價(jià)PRV JSSQ2013株的致病性，選擇易感動(dòng)物新西蘭白兔進(jìn)行試驗(yàn)。攻毒組的5只兔子在接種病毒24 h后開始出現(xiàn)厭食、興奮、啃咬或用爪撓接種部位等典型癥狀，進(jìn)而表現(xiàn)為呼吸急促、四肢麻痹、尖叫、鼻腔出血，最后抽搐而死，呈現(xiàn)“角弓反張”姿勢(shì)，至48 h 5只兔子全部死亡。對(duì)照組5只兔子精神狀態(tài)與食欲均正常，無異常表現(xiàn)。結(jié)果表明，PRV JSSQ2013株在新西蘭白兔上毒力很強(qiáng)。

2.6.2 仔豬攻毒試驗(yàn) 為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)PRV JSSQ2013株的毒力，選擇本體動(dòng)物15日齡仔豬進(jìn)行攻毒。攻毒組的5頭仔豬攻毒后第1天，體溫出現(xiàn)明顯升高，第三天達(dá)到最高(圖7)；第1天開始出現(xiàn)典型的PR癥狀，包括精神沉郁、厭食、咳嗽、腹瀉。第3天出現(xiàn)呼吸困難、呈犬坐姿勢(shì)，隨后表現(xiàn)狂躁、不斷做劃水動(dòng)作，頻繁用頭頂撞柱欄現(xiàn)象，后期全身顫抖及倒地出現(xiàn)劃水運(yùn)動(dòng)。第5天全部死亡(病死率100%)?？瞻讓?duì)照組體溫、臨床癥狀無任何異常。結(jié)果表明，PRV JSSQ2013株在本體動(dòng)物15日齡仔豬上毒力也很強(qiáng)，因此，該分離株為強(qiáng)毒株。

A：gB基因；B：gC基因；C：gD基因；D：gE基因圖6 PRV gB、gC、gD及gE基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建Fig.6

圖7 PRV JSSQ2013接種仔豬后體溫變化情況Fig.7

3 討論與結(jié)論

豬偽狂犬病在世界范圍內(nèi)廣泛分布和流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。自2011年以來，我國多個(gè)地區(qū)包括江蘇、浙江、吉林、黑龍江、福建等省份在已免疫PRV基因缺失疫苗的豬場(chǎng)暴發(fā)了PR病例，研究者分離到了PRV 強(qiáng)毒株并進(jìn)行了基因變異分析，證實(shí)大多數(shù)毒株在重要功能基因存在變異突變[4-7]。研究者對(duì)變異PRV毒株進(jìn)行了豬體免疫保護(hù)攻毒試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常規(guī)疫苗免疫不能對(duì)變異PRV強(qiáng)毒株提供完全保護(hù)，推測(cè)可能由于變異PRV毒株的突變導(dǎo)致了病毒抗原發(fā)生變異或/和對(duì)宿主的致病力增強(qiáng)[8-9]。

由于新流行的PRV變異毒株毒力增強(qiáng)，且常規(guī)疫苗不能提供完全保護(hù)，導(dǎo)致PRV感染情況變得嚴(yán)峻。林文耀等在2018年對(duì)我國24個(gè)省市358個(gè)規(guī)模化豬場(chǎng)不同豬群的血清流行病學(xué)進(jìn)行了全面調(diào)查與系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示PRV野毒抗體陽性豬場(chǎng)比例為72.63%，總血清樣品平均陽性率為30.85%；其中江蘇省野毒抗體陽性豬場(chǎng)比例為83.33%，總血清樣品平均陽性率為18.60%[10]。佘志成等于2017年5月至2019年1月對(duì)江蘇地區(qū)59個(gè)規(guī)模場(chǎng)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，gE抗體陽性率為36%[11]；袁朗等于2016年對(duì)江蘇省部分豬場(chǎng)進(jìn)行PRV病原學(xué)監(jiān)測(cè)與變異性分析，結(jié)果顯示11株分離株中10株為變異毒株[12]。因此得知，相比全國平均水平，江蘇地區(qū)豬偽狂犬病感染壓力較大，因此,本研究可進(jìn)一步了解江蘇PRV分子流行特征、豐富我國PRV分子流行病學(xué)資料。

PRV gB、gC與gD 基因編碼的糖蛋白是PRV最主要的保護(hù)性抗原，能刺激動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體和病毒特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，gE 基因是PRV的主要毒力基因。對(duì)PRV 流行毒株gB、gC、gD及gE 基因進(jìn)行序列分析及遺傳進(jìn)化分析能在一定程度上反映病毒變異情況。通過gB、gC、gD及gE基因的遺傳進(jìn)化樹分析顯示，分離株P(guān)RV JSSQ2013與2011年以前的經(jīng)典株關(guān)系較遠(yuǎn)，不在同一分支上，而與幾年在豬群中廣泛流行的PRV 變異株親緣關(guān)系較近，在同一分支上，且與PRV 變異株的分子變異特征一致，即gC 基因在第63～69位存在1 個(gè)AAASTPA連續(xù)7個(gè)氨基酸插入，在gE基因氨基酸序列第48和496位附近各有一個(gè)天冬氨酸的插入，在部分氨基酸位點(diǎn)出現(xiàn)突變[5,13]。以上結(jié)果表明分離株P(guān)RV JSSQ2013具有典型的PRV變異毒株特點(diǎn)。

豬是PRV的唯一自然宿主，家兔是其易感動(dòng)物，常用于評(píng)價(jià)PRV的致病性和毒力。李彩虹等對(duì)四川南充變異分離株BZ 株進(jìn)行了家兔致病性試驗(yàn)，結(jié)果表明24 h后開始出現(xiàn)癥狀，72 h后家兔全部死亡[14]。馬晶晶等對(duì)河北變異分離株HB-11株研究表明，接種家兔36 h后開始出現(xiàn)典型PR癥狀，48 h后家兔四肢出現(xiàn)麻痹而死亡；以106TCID50/mL的劑量接種仔豬后在第9、11天分別死亡一頭豬[13]。李振偉等對(duì)河南變異分離株HN2012研究表明，接種家兔48 h后產(chǎn)生PR癥狀，隨后死亡，60 h內(nèi)全部死亡[15]。曾顯成等對(duì)福建變異分離株MQ18研究表明，接種家兔后48 h開始發(fā)病，約60 h全部死亡[16]。王鳳求等對(duì)廣東變異分離株GD-1406在15日齡仔豬上的毒力進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示攻毒106TCID50/mL的仔豬在第五天全部死亡[17]。本研究結(jié)果顯示，PRV JSSQ2013接種兔子24 h后出現(xiàn)PR癥狀，48 h內(nèi)全部死亡，接種仔豬第五天后全部死亡，與前期報(bào)道一致，證實(shí)PRV JSSQ2013株致病力強(qiáng)，為變異強(qiáng)毒株，可為研發(fā)PRV變異毒株有效的疫苗提供材料。

本研究成功分離到1株P(guān)RV變異株JSSQ2013，該毒株具有較強(qiáng)的細(xì)胞感染能力，可在Vero細(xì)胞上有效增殖，且在新西蘭兔和仔豬上可引起典型的PRV感染癥狀且死亡，為PRV變異強(qiáng)毒株。本研究為PRV的分子流行特征及新型疫苗開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。