E3泛素連接酶Pellino蛋白的研究進(jìn)展

徐 艷，趙保兵

(山東大學(xué)藥學(xué)院，新藥藥理研究所，山東 濟(jì)南 250012)

泛素(ubiquitin)是一種由76個氨基酸組成的小分子蛋白質(zhì)，廣泛存在于真核細(xì)胞中.泛素化是指泛素在一系列酶的催化作用下共價結(jié)合到靶蛋白上的過程.泛素激活酶(E1)依賴三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)與泛素形成不穩(wěn)定的硫酯鍵，然后泛素結(jié)合酶(E2)接受來自E1的泛素，最后泛素連接酶(E3)從E2轉(zhuǎn)移泛素并將其連接到目標(biāo)蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基上.蛋白質(zhì)可發(fā)生單個賴氨酸殘基的單泛素化或者多位點的多聚泛素化，以及泛素賴氨酸殘基(Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63)上的多聚泛素化[1].由于泛素化的多樣性，蛋白質(zhì)泛素化修飾在蛋白質(zhì)降解、蛋白與蛋白的相互作用、蛋白質(zhì)細(xì)胞定位以及信號傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，參與各種生理過程的調(diào)控.

E3具有底物識別特異性，根據(jù)其C末端功能域可分為兩大類：RING 結(jié)構(gòu)域和HECT結(jié)構(gòu)域，此外還有一些靶向N末端含有特定不穩(wěn)定殘基底物蛋白的E3[2].RING結(jié)構(gòu)域 E3 是迄今為止最大和最復(fù)雜的泛素連接酶家族，在新發(fā)現(xiàn)的 RING 結(jié)構(gòu)域E3中，Pellino蛋白是最初在果蠅(Drosophilamelanogaster)中發(fā)現(xiàn)的一種新型pelle相互作用蛋白分子，隨之在其他動物(包括哺乳動物)中也發(fā)現(xiàn)了多個與Pellino相似的序列[3].在哺乳動物中，Pellino家族由3個成員組成：Pellino1、Pellino2和Pellino3(包括兩個剪接變體Pellino3a和Pellino3b)[4].Pellino蛋白與Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)信號通路中的多個蛋白分子相互作用，通過蛋白質(zhì)泛素化參與炎癥、細(xì)胞固有免疫和獲得性免疫的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控.此外，Pellino蛋白與腫瘤發(fā)生發(fā)展和代謝異常等相關(guān).本文總結(jié)了 Pellino蛋白的分子特性、活性調(diào)控和生物學(xué)研究進(jìn)展，同時探討了Pellino蛋白在自身免疫、炎癥、癌癥、心臟疾病及肥胖疾病中的調(diào)控作用.

1 Pellino蛋白的分子特征

1.1 組織分布

Pellino基因在哺乳動物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但在不同組織中表達(dá)水平存在顯著差異.Pellino1在胎盤、肺、肝、腎、脾、胸腺、骨骼肌和腦等組織中表達(dá)，尤其是在外周血白細(xì)胞中高表達(dá)，而在小腸、結(jié)腸和心臟中表達(dá)水平較低[5].Pellino2在胚胎期顯著表達(dá)，而成年后主要在肝臟、睪丸和皮膚中表達(dá)[6].Pellino3主要在腦、心臟和睪丸中表達(dá)[7].這些表達(dá)差異暗示了不同Pellino蛋白的生物學(xué)功能具有組織特異性.

1.2 分子結(jié)構(gòu)

Pellino家族成員在進(jìn)化過程中非常保守，哺乳動物Pellino1和Pellino2具有82%的氨基酸同源性，而Pellino3分別與Pellino1和Pellino2具有70%和71%的氨基酸同源性[8](圖1).Pellino蛋白C端具有一段保守的半胱氨酸和組氨酸殘基序列(Cys-X1-His-X19-Cys-X2-Cys-X30-Cys-X1-His-X25-Cys-X2-Cys)，即RING結(jié)構(gòu)域.經(jīng)典的RING結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合兩個鋅離子，RING結(jié)構(gòu)域E3大致分為單組分RING結(jié)構(gòu)域E3和由多蛋白亞基組成的復(fù)合RING結(jié)構(gòu)域E3.RING結(jié)構(gòu)域賦予Pellino蛋白E3活性，通過各種E2介導(dǎo)靶蛋白分子的Lys48(K48)或者K63多聚泛素化[7,9].例如，Pellino1可與Ubc13/Uev1A結(jié)合以催化K63多聚泛素鏈的形成，與UbcH3結(jié)合以催化K48多聚泛素鏈的形成，而在UbcH5a、UbcH5b或UbcH4存在的情況下，Pellino1主要誘導(dǎo)靶蛋白發(fā)生K48或者K11鏈接多聚泛素鏈[8,10].K48鏈接多聚泛素鏈標(biāo)記靶蛋白以供蛋白酶體降解，而K63鏈接多聚泛素鏈則提高靶蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間的相互作用和信號傳導(dǎo)[11-12].

hPellino表示人類Pellino;FHA表示叉頭相關(guān);Ub和Su分別表示Pellino蛋白中的相應(yīng)氨基酸殘基被泛素化和小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquition-related modifier,SUMO)化;Pellino蛋白磷酸化位點以紅色顯示，其中被白細(xì)胞介素1(interleukin 1,IL-1)受體相關(guān)激酶1(IL-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)和IRAK4唯一磷酸化氨基酸殘基以棕色顯示，被IRAK和TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)磷酸化的氨基酸殘基以淺藍(lán)色顯示；紅色星號表示Pellino1單個磷酸化位點激活E3活性.

Pellino蛋白N端包含一個FHA結(jié)構(gòu)域，通過識別磷酸化蘇氨酸肽與靶蛋白(如IRAK)結(jié)合.蛋白晶體數(shù)據(jù)顯示，Pellino蛋白的FHA結(jié)構(gòu)域包含一個“翼”狀結(jié)構(gòu)，由位于FHA同源區(qū)域內(nèi)的兩個長插入物組成，這一結(jié)構(gòu)有助于增加底物結(jié)合的親和力和特異性[13].FHA結(jié)構(gòu)域和“翼”狀結(jié)構(gòu)在Pellino家族中是保守的，識別并催化磷酸化靶蛋白的泛素化可能是這一家族蛋白的共有特性.

1.3 蛋白活性調(diào)控

1.3.1 磷酸化

Pellino蛋白的磷酸化在調(diào)節(jié)其靶蛋白結(jié)合能力和E3活性中起重要作用[8,12,14].IRAK1或IRAK4可磷酸化Pellino蛋白，顯著增強(qiáng)其E3活性[9,14].研究表明，Pellino1中7個氨基酸殘基的磷酸化對于Pellino1的激活至關(guān)重要：5個磷酸化位點聚集在FHA結(jié)構(gòu)域(Ser76、Ser78、Thr80、Ser82和Thr86)，并且與FHA結(jié)構(gòu)域的“翼”狀結(jié)構(gòu)相關(guān)；其他2個磷酸化位點位于RING結(jié)構(gòu)域之前的Thr288和Ser293(圖1).這些氨基酸殘基單個磷酸化或者組合磷酸化，可以促進(jìn)Pellino1識別并介導(dǎo)靶蛋白的泛素化[14].多個免疫刺激物，如IL-1、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和TLR配體等，通過蛋白激酶催化Pellino1磷酸化.例如，IRAK1在人胚胎腎細(xì)胞293(human embryonic kidney 293 cell,HEK-293)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中介導(dǎo)IL-1引起的Pellino1磷酸化；TLR7在巨噬細(xì)胞中介導(dǎo)相關(guān)配體誘導(dǎo)的Pellino1磷酸化.另外，核因子κB抑制劑激酶(inhibitor of nuclear factor-κB(NF-κB)kinase, IKK)相關(guān)激酶和TBK1也可以磷酸化Pellino1[15].

1.3.2 泛素化

在哺乳動物細(xì)胞中共表達(dá)Pellino蛋白與IRAK1或IRAK4時，Pellino蛋白不僅能介導(dǎo)IRAK的K63多聚泛素化，其自身也會被泛素化導(dǎo)致蛋白降解[7].Pellino蛋白泛素化可能是一種自身泛素化，但也不排除有其他E3的參與.例如：IRAK1在泛素結(jié)合酶UbcH4存在下可介導(dǎo)Pellino1發(fā)生自泛素化[10]；Pellino2和IRAK1共表達(dá)時，兩者的表達(dá)水平均降低，表明泛素化介導(dǎo)兩者降解[16].目前已報道的Pellino1自泛素化的3個賴氨酸殘基中，K169和K202分別位于“翼”狀結(jié)構(gòu)和FHA結(jié)構(gòu)域，而K266位于C端和FHA結(jié)構(gòu)域之間[14].

1.3.3 SUMO化

SUMO化是近年來新發(fā)現(xiàn)的類似泛素化的蛋白翻譯后修飾.研究表明，在SUMO結(jié)合酶 Ubc9 作用下Pellino1發(fā)生SUMO化，定點突變實驗進(jìn)一步確證了5個潛在的SUMO化位點(K202、K266、K295、K297 和 K303)[17].其中2個賴氨酸殘基(K202和K266)也可以發(fā)生泛素化修飾，提示Pellino1蛋白的SUMO化和泛素化之間可能存在競爭性.Pellino蛋白的磷酸化、泛素化和SUMO化位點具有高度保守性，這也提示不同Pellino蛋白可能受到相似分子機(jī)制的調(diào)控.

1.3.4 轉(zhuǎn)錄調(diào)控

Pellino蛋白的另一個活性調(diào)控機(jī)制是基因表達(dá)調(diào)控.肝再生過程中Pellino1的信使RNA(messenger RNA,mRNA)的水平與微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)的水平呈負(fù)相關(guān)，miR-21過表達(dá)顯著抑制Pellino1表達(dá)，表明Pellino1是miR-21的靶標(biāo)[18].在T細(xì)胞活化過程中，T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)和共刺激分子CD28的作用下上調(diào)Pellino1表達(dá)[19].此外，脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激可誘導(dǎo)Pellino3表達(dá)，而自噬激活通過TLR4信號途徑導(dǎo)致Pellino3泛素化降解[20].

2 Pellino蛋白的生物學(xué)功能

Pellino家族成員的序列和結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出高度同源性，各成員具有相似的生物學(xué)功能.Pellino蛋白通過靶蛋白泛素化參與IL-1R/TLR依賴的NF-κB和有絲分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路(圖2)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(nucleotide-binding oligomerization domain 2,NOD2)信號通路以及T細(xì)胞活化等調(diào)控.

2.1 Pellino蛋白調(diào)控炎性反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

2.1.1 Pellino蛋白調(diào)控IL-1R/TLR依賴的NF-κB和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

固有免疫系統(tǒng)利用獨(dú)特的模式識別受體(pathogen recognition receptors,PRRs)識別外源性病原體相關(guān)分子(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs).TLRs是PRRs的關(guān)鍵成員，其識別PAMPs后招募含TIR(Toll/IL-R)結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，包括髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)和干擾素β(interferon β,IFN-β)TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR domain-containing adapter protein inducing IFN-β,TRIF).MyD88是TLRs所有成員(除TLR3外)共有的接頭蛋白，而TRIF主要參與TLR3和TLR4介導(dǎo)的信號通路；TLR3直接招募TRIF，而TLR4以TRIF相關(guān)接頭分子(TRIF-related adapter molecule,TARM)作為支架蛋白間接招募TRIF.IL-1受體(IL-1 receptor,IL-1R)/TLR信號途徑通過激活下游NF-κB、MAPK等信號共同誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)(圖2).

TIRAP.TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白；Peli.Pellino蛋白；IRF7.IFN調(diào)節(jié)因子7；TAK1.轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)活化激酶1;TAB.TAK1結(jié)合蛋白；IAP2.細(xì)胞凋亡蛋白2抑制劑；JNK.Jun N-末端激酶；NEMO.NF-κB 必需調(diào)節(jié)劑；DEAF1.變形表皮自動調(diào)節(jié)因子1；TRAF3.TNF受體相關(guān)因子3；p38.絲裂原活化蛋白激酶；CREB.反應(yīng)元件結(jié)合蛋白；ssRNA.單鏈RNA；IκB.NF-κB 抑制劑；AP1.轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1.

IL-1結(jié)合IL-1R后刺激Pellino1與IRAK4、IRAK1和TRAF6之間的相互作用，激活MyD88依賴的NF-κB信號和IL-8基因表達(dá)[5].TGF-β刺激下，Pellino1與Smad6或者Smad7相互作用，競爭性阻止IL-1β介導(dǎo)的IRAK1-Pellino1-TRAF6復(fù)合物形成，從而抑制IκB降解、NF-κB激活以及促炎因子表達(dá)[21-23].在LPS刺激下，Pellino1介導(dǎo)IRAK1、TBK1、TAK1和TRAF6的K63多聚泛素化，參與TLR2/4/NF-κB信號通路調(diào)控[24-25].敲低Pellino1可抑制炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的表達(dá)以及NF-κB RelA的轉(zhuǎn)錄活性[26].此外，小膠質(zhì)細(xì)胞中Pellino1介導(dǎo)IAP2的K63多聚泛素化可增強(qiáng)其蛋白穩(wěn)定性，激活的IAP2介導(dǎo)TRAF3的K48多聚泛素化導(dǎo)致其降解，從而解除TRAF3對MAPK的負(fù)調(diào)節(jié)[27-28].然而，Pellino1介導(dǎo)的NF-κB和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)僅限于免疫細(xì)胞，在非免疫性細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)相似的調(diào)控作用[29-32].

有研究表明，Pellino1通過介導(dǎo)受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIP1)的K63多聚泛素化，招募TAK1和IKK復(fù)合物，促進(jìn)IKK復(fù)合物的磷酸化激活，最終導(dǎo)致NF-κB的激活和促炎細(xì)胞因子的增加；敲除Pellino1能顯著抑制TLR3/4配體對炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)，并使小鼠對感染性休克具有更強(qiáng)的抵抗力[30].而另一項研究發(fā)現(xiàn)Pellino1缺失對聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,poly(I:C))誘導(dǎo)的RIP1泛素化、IKK和MAPK信號通路激活以及炎性細(xì)胞因子表達(dá)均沒有影響[33].因此，Pellino1是否介導(dǎo)TRIF依賴的NF-κB和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有待進(jìn)一步明確.

在LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中，B細(xì)胞淋巴瘤10(B cell leukemia/lymphoma 10，BCL10)與TLR4結(jié)合，隨后與Pellino2相互作用以激活NF-κB通路，但是Pellino2缺失并不能完全消除BCL10對NF-κB的激活作用，表明Pellino2部分參與BCL10激活NF-κB信號通路[34].另一項研究也發(fā)現(xiàn)，敲低Pellino2不能完全抑制IL-1和LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[11].此外，Pellino2過表達(dá)不能激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，但可增強(qiáng)其下游基因的表達(dá)[6,25].這些研究表明，Pellino2在IL-1R/TLR依賴的NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)控作用有待深入探討.Pellino2是否調(diào)控IL-1R/TLR依賴的MAPK信號通路也存在爭議.Pellino2與TRAF6和TAK1相互作用，介導(dǎo)其泛素化，從而激活MAPK信號通路，導(dǎo)致AP-1和Elk-1(Ets-like protein1)的活化[32].在Pellino2敲低的293細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中，IL-1和LPS介導(dǎo)的JNK和胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)磷酸化減弱[11].然而，在其他研究中發(fā)現(xiàn)，Pellino2缺失并不影響IL-1和LPS介導(dǎo)的MAPK信號通路的激活[16,35].由于序列和結(jié)構(gòu)具有高度同源性，Pellino蛋白成員之間可能存在功能性代償，導(dǎo)致Pellino2缺失細(xì)胞中MAPK信號通路變化不明顯.

Pellino3b通過介導(dǎo)IRAK的K63多聚泛素化競爭性抑制K48多聚泛素化，增強(qiáng)IRAK蛋白穩(wěn)定性，從而抑制MyD88、IRAK1和TAK1依賴性NF-κB通路[8,25,36].Pellino3b也可通過介導(dǎo)TBK1的泛素化，抑制由TRIF或TBK1過表達(dá)誘導(dǎo)的NF-κB激活[36].敲除Pellino3導(dǎo)致LPS依賴性炎性細(xì)胞因子IL-1β 的表達(dá)上調(diào)[20].這些研究表明Pellino3負(fù)向調(diào)節(jié)IL-1R/TLR依賴的NF-κB信號通路.此外，也有研究表明Pellino3正向調(diào)節(jié)IL-1R/TLR依賴的MAPK信號通路，Pellino3通過介導(dǎo)TRAF6和TAK1的泛素化，誘導(dǎo)c-Jun、JNK、p38和Elk-1的激活[7,37].在Pellino3敲減細(xì)胞中，IL-1誘導(dǎo)的MAPK信號通路激活被減弱[38].

2.1.2 Pellino蛋白調(diào)控TNF信號通路

TNF既可以激活NF-κB以誘導(dǎo)炎性和抗凋亡蛋白的表達(dá)，也可以觸發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡.TNF與其受體TNFR1結(jié)合后，TNFR1發(fā)生多聚化并與細(xì)胞質(zhì)中TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(TNFR1-associated death domain protein,TRADD)相互作用，招募RIP1、TRAF2或TRAF5以及細(xì)胞凋亡抑制蛋白，形成復(fù)合物Ⅰ.TRAF2和IAP可導(dǎo)致RIP1的K63多聚泛素化以增強(qiáng)其穩(wěn)定性，然后招募 IKK 復(fù)合物和TAK1，最終激活NF-κB和抗凋亡基因的表達(dá).同時，NF-κB也會上調(diào)A20和腫瘤抑制因子CYLD的表達(dá)，對RIP1去泛素化以解除其激活NF-κB 的作用.此外，未泛素化的RIP1可以與TNFR1 分離，與Fas相關(guān)死亡域(Fas-associated death domain protein,FADD)蛋白相互作用，該蛋白反過來招募procaspase-8以形成細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)復(fù)合物Ⅱ.復(fù)合物Ⅱ進(jìn)而觸發(fā)caspase-8的酶切加工和激活，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng).更多細(xì)節(jié)和相關(guān)進(jìn)展可參閱文獻(xiàn)[39].

Pellino1是TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞死亡途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，可以促進(jìn)壞死性凋亡而抑制細(xì)胞凋亡.一方面，Pellino1介導(dǎo)受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1,RIPK1)的K63多聚泛素化，增強(qiáng)其與RIPK3的結(jié)合以促進(jìn)RIPK3和MLKL(mixed lineage kinase domain-like protein)的激活，從而誘導(dǎo)細(xì)胞壞死性凋亡；另一方面，Pellino1的缺失通過上調(diào)c-Myc的表達(dá)和下調(diào)caspase-8抑制分子c-FLIP(cellular FLICE inhibitory protein)的表達(dá)，使細(xì)胞對TNF-α誘導(dǎo)的RIPK1依賴性和RIPK1非依賴性細(xì)胞凋亡更敏感[40].敲減Pellino1也導(dǎo)致TNF刺激下NF-κB RelA(p65)的轉(zhuǎn)錄活性及其下游促炎細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的表達(dá)下調(diào)[26].另一項研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α刺激的293T或?qū)m頸癌HeLa細(xì)胞中，Pellino1可介導(dǎo)RIP3的K48多聚泛素化，導(dǎo)致其降解并抑制細(xì)胞死亡[41].這些研究說明Pellino1在不同的細(xì)胞背景中參與調(diào)控TNF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制存在差異.

Pellino3也可以介導(dǎo)RIP1的泛素化，進(jìn)而激活TNF誘導(dǎo)的復(fù)合物Ⅰ介導(dǎo)的NF-κB信號通路，發(fā)揮促炎抗凋亡作用以促進(jìn)細(xì)胞存活；同時抑制TNF誘導(dǎo)的復(fù)合物Ⅱ形成，抑制caspase-8介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[42].

2.1.3 Pellino2調(diào)控炎性小體信號通路

炎性小體是一種由NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein,NLRP)、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)和半胱天冬酶-1前體(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1,pro-caspase-1)組成的胞漿多蛋白復(fù)合物，能被多種病原相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子模式激活.NLRP3炎性小體將接頭蛋白ASC和caspase-1募集到寡聚復(fù)合物中，導(dǎo)致pro-caspase-1自動蛋白水解加工成活性形式，將pro-IL-1β和pro-IL-18切割為成熟的分泌形式，引發(fā)炎性反應(yīng)和細(xì)胞焦亡.研究證實 Pellino2的FHA和RING結(jié)構(gòu)域通過促進(jìn)NLRP3的K63泛素化來促進(jìn)NLRP3激活，介導(dǎo)LPS刺激下成熟IL-1β蛋白的產(chǎn)生；Pellino2缺陷小鼠的骨髓細(xì)胞在TLR啟動、NLRP3 刺激和細(xì)菌攻擊時，NLRP3的激活受損，對LPS刺激也有很強(qiáng)的耐受性；此外，Pellino2 還可通過泛素化IRAK1解除IRAK1對NLRP3的抑制作用[35].

2.2 Pellino蛋白參與免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)

2.2.1 Pellino蛋白調(diào)控IFN-Ⅰ的表達(dá)

IRF是調(diào)控IFN基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用.小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中Pellino1缺失不影響TLR3/4誘導(dǎo)的IKKε激活和IFN-β表達(dá)，提示Pellino1不參與調(diào)控TRIF依賴的IRF3激活和隨后的IFN-β表達(dá)[30].然而，在病毒雙鏈RNA的刺激下，Pellino1敲除小鼠的骨髓細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中IFN-β表達(dá)下調(diào)，IRF3與IFN-β基因啟動子的相互作用受損，表明Pellino1對病毒感染等因素刺激下的IFN-β基因表達(dá)具有重要調(diào)控作用[33].進(jìn)一步研究證實Pellino1與轉(zhuǎn)錄因子DEAF1同源物存在相互作用，兩者促進(jìn)IRF3與IFN-β啟動子的結(jié)合，促進(jìn)IFN-β的轉(zhuǎn)錄[43].研究發(fā)現(xiàn)Pellino2 缺陷的樹突狀細(xì)胞經(jīng)TLR9 激活后，小鼠IFN-Ⅰ的產(chǎn)生受損[44].

Pellino3通過兩種途徑參與IFN-Ⅰ的表達(dá)調(diào)控：1)介導(dǎo)TRAF6的泛素化，抑制其結(jié)合并磷酸化激活I(lǐng)RF7，導(dǎo)致IFN-Ⅰ表達(dá)下調(diào)[4]；2)巨噬細(xì)胞中LPS激活TLR4后，TRIF依賴的信號級聯(lián)將TRAF3、TANK、TBK1組裝成復(fù)合體，進(jìn)而磷酸化IRF3，磷酸化的IRF3易位到細(xì)胞核中，與其反應(yīng)元件結(jié)合并激活I(lǐng)FN-β和IP-10基因的轉(zhuǎn)錄.當(dāng)巨噬細(xì)胞中加入氧化型低密度脂蛋白后，上調(diào)的Pellino3通過介導(dǎo)TANK的單泛素化，抑制TANK依賴性TBK1招募以及下游信號傳導(dǎo)，從而抑制IFN-β表達(dá)[45].

2.2.2 Pellino1調(diào)控T細(xì)胞活化

T細(xì)胞活化需要兩個信號刺激，即TCR和共刺激信號分子(如CD28).T細(xì)胞中TCR和CD28的共刺激信號招募IKK復(fù)合物，催化IκB蛋白的磷酸化，導(dǎo)致其降解以及NF-κB家族Rel亞基的釋放，游離c-Rel 易位至細(xì)胞核中增強(qiáng)CD28效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄(如IL-2)，從而驅(qū)動T細(xì)胞的活化和增殖[38].

Pellino1在B細(xì)胞和T細(xì)胞中高表達(dá)，其敲除導(dǎo)致T細(xì)胞過度活化，并使T 細(xì)胞難以被調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和TGF-β抑制[19].Pellino1作為T細(xì)胞活化的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子可緩解自身免疫，Pellino1敲除小鼠可自發(fā)地發(fā)生以多器官炎癥和自身抗體產(chǎn)生為特征的自身免疫疾病[19].TCR和CD28的共刺激信號增強(qiáng)Pellino1表達(dá)，后者通過介導(dǎo)c-Rel K48泛素化導(dǎo)致其降解，抑制細(xì)胞因子(如IL-2)表達(dá)，最終導(dǎo)致一種與外周T細(xì)胞耐受相關(guān)的效應(yīng)稱“T細(xì)胞無能”[19].此外，有研究發(fā)現(xiàn)Pellino1通過介導(dǎo)c-Rel的泛素化調(diào)控濾泡輔助性T(T follicular helper,Tfh)細(xì)胞的生成和功能.miR-155通過靶向抑制Pellino1的表達(dá)，進(jìn)而抑制NF-κB家族轉(zhuǎn)錄因子c-Rel的降解，抑制Tfh細(xì)胞增殖和CD4+T細(xì)胞上的CD40配體表達(dá)[46].

2.2.3 Pellino3調(diào)控NOD2信號通路

Pellino3是NOD2信號通路的重要調(diào)控因子，通過介導(dǎo)激酶RIP2的泛素化參與腸道炎癥反應(yīng)[47]：細(xì)菌侵入腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生肽聚糖衍生肽(如胞壁酰二肽)，觸發(fā)NOD2 的寡聚化，活化的NOD2招募蛋白激酶RIP2.Pellino3通過FHA結(jié)構(gòu)域與RIP2相互作用并介導(dǎo)其K63多聚泛素化，促使TAK1和IKK復(fù)合物的共同招募，激活I(lǐng)KK和下游NF-κB 信號通路.TAK1還可以激活MAPK信號通路(p38、JNK和ERK)，從而激活A(yù)P-1等轉(zhuǎn)錄因子，與NF-κB協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子和殺菌肽的表達(dá).

2.3 Pellino蛋白參與其他信號通路調(diào)控

DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand break,DSB)和重組修復(fù)對于維持基因組完整性至關(guān)重要.DSB觸發(fā)DNA損傷反應(yīng)信號，激活DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期檢測點機(jī)制.多項研究證實Pellino1參與DNA損傷修復(fù)信號通路的調(diào)控：DNA損傷傳感蛋白激酶ATM(ataxia-telangiectasia mutated gene)招募并磷酸化Pellino1到DSB位點，磷酸化組蛋白H2AX促使Pellino1與NBS1(Nijmegen breakage syndrome 1)相互作用并介導(dǎo)其發(fā)生K63泛素化，導(dǎo)致ATM的進(jìn)一步激活，從而加強(qiáng)DNA末端切除和重組修復(fù)；DNA損傷后也激活p53信號通路及其靶基因p21的轉(zhuǎn)錄，形成細(xì)胞周期G1檢查點，以減少受損DNA的復(fù)制和積累[48].另一項研究發(fā)現(xiàn)，Pellino1通過FHA結(jié)構(gòu)域與磷酸化的p53相互作用介導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄活化[49].Pellino1也可以通過與p53抑制蛋白Mdmx相互作用介導(dǎo)其泛素化，從而抑制其細(xì)胞核易位，解除其對p53的抑制作用[50].

此外，Pellino1也參與G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控.骨架蛋白β-arrestin-1被證實是一個新的糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)互作蛋白，敲低后促進(jìn)Pellino1表達(dá)；Pellino1與GR相互作用并介導(dǎo)其泛素化降解，改變糖皮質(zhì)激素信號傳導(dǎo)[51].

3 Pellino蛋白與疾病

3.1 Pellino蛋白與炎癥及免疫疾病

Pellino1是TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)的重要調(diào)控因子，與炎癥及免疫疾病密切相關(guān).鼻病毒(rhinovirus,RV)是慢性阻塞性肺疾病惡化的主要原因，其感染的支氣管上皮細(xì)胞中Pellino1表達(dá)增加，導(dǎo)致致炎因子表達(dá)失調(diào)，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)[52].敲除Pellino1可抑制RV誘導(dǎo)的固有免疫細(xì)胞因子如C-X-C基序趨化因子配體8(C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8)的產(chǎn)生，減輕呼吸道病毒引起的氣道炎癥.該過程受到TLR3的調(diào)控，不依賴于IRAK1，因此不影響抗病毒的IFN表達(dá)[29].在慢性細(xì)菌性支氣管炎中，Pellino1也呈現(xiàn)高表達(dá)[53-54].

Pellino1介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中趨化因子和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并促進(jìn)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，抑制Pellino1對神經(jīng)炎癥[55-56]、腦損傷[57]以及酪氨酸血癥相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病[58]具有治療作用.同時，Pellino1還促進(jìn)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中的抗病毒先天免疫反應(yīng)，負(fù)調(diào)控T細(xì)胞中IFN-γ的表達(dá).Pellino1的缺失誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞中IFN-β的表達(dá)，對致命的西尼羅河病毒感染具有更強(qiáng)的抵抗力[59-60].此外，在自身免疫性腦脊髓炎和蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后的早期腦損傷中也發(fā)現(xiàn)Pellino1的高表達(dá)[61-62].SAH刺激TLR4信號，表達(dá)上調(diào)的Pellino1介導(dǎo)凋亡抑制蛋白cIAP1/2的激活，正向調(diào)節(jié)MyD88依賴性的MAPK信號通路，從而激活促凋亡信號[63].Pellino1通過介導(dǎo)CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein,C/EBPβ)泛素化降解，降低C/EBPβ的蛋白水平和 CD36 的表達(dá)，從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對淀粉樣蛋白-β的吞噬能力，表明靶向Pellino1用于治療小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病很有前景[64].

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)的標(biāo)志是B細(xì)胞不受控制地產(chǎn)生對核抗原(如雙鏈DNA和染色質(zhì))具有特異性的自身抗體，導(dǎo)致免疫復(fù)合物的形成和沉積，從而造成組織損傷.研究發(fā)現(xiàn)Pellino1水平與SLE的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，敲除Pellino1會導(dǎo)致B細(xì)胞增殖及自身抗體的產(chǎn)生，加重SLE病情[65-66].Pellino1與NF-κB誘導(dǎo)激酶(NF-κB inducing kinase,NIK)作用并介導(dǎo)NIK的K48泛素化和降解，從而負(fù)調(diào)節(jié)非經(jīng)典NF-κB信號傳導(dǎo)，抑制漿細(xì)胞及抗體的產(chǎn)生，減緩SLE的發(fā)病進(jìn)程[67-68].

目前對Pellino2在炎癥及免疫疾病中的研究十分有限.在以嚴(yán)重肺部炎癥或損傷為特征的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)模型中，Pellino2蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)，miR-802通過下調(diào)Pellino2表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷起到保護(hù)作用，提示miR-802/Pellino2信號軸可作為治療ARDS的潛在藥物靶標(biāo)[69].此外，有研究表明，Pellino2受HOXA13(Homeo-box gene A13)調(diào)控，可能介導(dǎo)女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥伴腎陰虛疾病的發(fā)生[70].

Pellino3 在克羅恩病患者的結(jié)腸中低表達(dá)，敲除Pellino3可加重小鼠結(jié)腸炎模型.Pellino3通過泛素化RIP2介導(dǎo)NOD2誘導(dǎo)的NF-κB和MAPK信號通路激活，在結(jié)腸炎中發(fā)揮保護(hù)作用[46].肥胖引起的慢性炎癥會增加潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病和結(jié)直腸癌的風(fēng)險.一項飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠結(jié)腸基因組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，Pellino3與肥胖誘導(dǎo)的結(jié)腸病變相關(guān)，是肥胖相關(guān)結(jié)腸疾病早期的潛在生物標(biāo)志物[71].

3.2 Pellino蛋白與心臟疾病

近年來，研究發(fā)現(xiàn)Pellino1在心臟功能維持和應(yīng)激中發(fā)揮重要調(diào)控作用：1)心肌梗死(myocardial infarction,MI)造成局部缺氧，導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Pellino1表達(dá)增強(qiáng)；Pellino1通過介導(dǎo)RIP1和 TRAF6泛素化、激活NF-κB及其下游炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致心肌中炎癥細(xì)胞浸潤；敲除Pellino1可改善MI引起的心臟功能障礙，包括疤痕大小和膠原蛋白沉積等，表明Pellino1在MI的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，靶向Pellino1可改善MI后的心臟功能障礙和重塑[72].2)心臟成纖維細(xì)胞的活化是導(dǎo)致心臟纖維化進(jìn)程中心力衰竭的關(guān)鍵事件.在超負(fù)荷壓力下的大鼠心臟以及暴露于機(jī)械拉伸的大鼠心臟成纖維細(xì)胞中，Pellino1的表達(dá)增強(qiáng)；Pellino1介導(dǎo)TRAF6和RIP1的泛素化，激活NF-κB、p38和AP-1，從而增強(qiáng)NF-κB和AP-1與TGF-β1基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)，引發(fā)心臟成纖維細(xì)胞的激活和增殖[73].3)肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器，被TLR激活可導(dǎo)致心臟微血管損傷.Pellino1在糖尿病小鼠的心臟內(nèi)皮細(xì)胞和晚期糖基化終末產(chǎn)物處理的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞中均顯著上調(diào)，通過RING結(jié)構(gòu)域與熱休克蛋白Hsp90結(jié)合以激活I(lǐng)RE1α，導(dǎo)致心臟微血管損傷；小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞中敲除Pellino1可改善糖尿病誘導(dǎo)的心臟微血管通透性，促進(jìn)微血管再生，抑制細(xì)胞凋亡，并減少有害的心臟重塑[74].以上研究提示，Pellino1蛋白的表達(dá)異?？赡軈⑴c心臟疾病的發(fā)生發(fā)展.

3.3 Pellino蛋白與肥胖

Pellino1介導(dǎo)肥胖誘導(dǎo)的葡萄糖耐受.IRF5是巨噬細(xì)胞M1型極化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞參與肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗[75]：與正常個體相比，肥胖人群脂肪組織中巨噬細(xì)胞內(nèi)的IRF5轉(zhuǎn)錄活性和Pellino1表達(dá)增強(qiáng)，這些變化與胰島素抵抗相關(guān).Pellino1與IRF5相互作用并介導(dǎo)其K63泛素化，導(dǎo)致IRF5的細(xì)胞核易位和轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型極化.敲除Pellino1將導(dǎo)致M1型巨噬細(xì)胞極化受損，可以改善高脂飲食小鼠的葡萄糖耐受不良狀況[76].最新一項研究也證實，TGF-β1上調(diào)Pellino1的表達(dá)，促進(jìn)IRF5細(xì)胞核易位，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型極化，加重急性肺損傷[77].

Pellino3在肥胖個體的脂肪組織和高脂飲食并顯示胰島素耐受的小鼠脂肪組織中呈低表達(dá)，其缺失引發(fā)更嚴(yán)重的炎癥和胰島素耐受[78]：脂肪組織中M1型巨噬細(xì)胞在各種刺激(LPS、棕櫚酸酯和缺氧)下激活TRAF6，通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)炎癥發(fā)生.同時作為E3，TRAF6介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)發(fā)生K63多聚泛素化以增強(qiáng)其蛋白穩(wěn)定性，促進(jìn)IL-1β的表達(dá)，從而引發(fā)胰島素耐受.Pellino3介導(dǎo)TARF6發(fā)生泛素化，抑制其與HIF-1α的相互作用，導(dǎo)致HIF-1α泛素化水平下調(diào)和蛋白降解，最終抑制IL-1β的表達(dá)并減輕胰島素耐受.高脂肪飲食誘導(dǎo)的Pellino3缺陷小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的炎癥、肝臟脂肪變性、IL-1β表達(dá)上調(diào)及胰島素抵抗.

3.4 Pellino蛋白與腫瘤發(fā)生發(fā)展

Pellino1在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中扮演著促癌因子的角色.在淋巴瘤中，Pellino1表達(dá)水平與致癌基因MYC、BCL6、BCL2和MUM1(multiple myeloma oncogene 1)等表達(dá)呈正相關(guān)，也與彌散性大B細(xì)胞淋巴瘤的惡性程度和不良預(yù)后密切相關(guān)[79].機(jī)制研究表明Pellino1直接與BCL6相互作用并介導(dǎo)其發(fā)生K63多聚泛素化，從而穩(wěn)定BCL6促進(jìn)淋巴瘤發(fā)生[80].Pellino1在肺癌中也呈異常高表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物順鉑和紫杉醇產(chǎn)生耐受；Pellino1過表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞凋亡抑制分子cIAP2的表達(dá)，并直接結(jié)合和介導(dǎo)cIAP2發(fā)生K63多聚泛素化，增強(qiáng)其蛋白穩(wěn)定性，促進(jìn)肺癌的發(fā)生[81].此外，Pellino1通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)和ERK信號通路促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和存活；介導(dǎo)Snail和Slug的K63多聚泛素化而穩(wěn)定這些蛋白分子，調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)，增強(qiáng)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[82].抵抗霉素可通過抑制Pellino1并誘導(dǎo)Snail和Slug的降解減輕三陰性乳腺癌的EMT[83].Pellino1通過激活乳頭狀甲狀腺癌中的PI3K/Akt通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移[84].

p53是重要的腫瘤抑制因子，其抑制分子Mdmx與p53蛋白相互作用抑制其轉(zhuǎn)錄活性.體外和體內(nèi)研究均證實Pellino1結(jié)合并介導(dǎo)Mdmx的泛素化，促進(jìn)Mdmx的細(xì)胞質(zhì)定位，進(jìn)而導(dǎo)致p53激活.敲除Pellino1誘導(dǎo)Mdmx的核易位并抑制p53活性，且加速致癌因子Myc誘導(dǎo)的小鼠腫瘤發(fā)生[50].染色體非整倍性是癌細(xì)胞的重要特征，而在正常細(xì)胞中存在有絲分裂紡錘體檢查點機(jī)制以確保細(xì)胞分裂過程中染色體正確分離.Pellino1與BubR1(有絲分裂紡錘體檢查點的關(guān)鍵組成部分)相互作用，通過泛素化誘導(dǎo)其降解，抑制有絲分裂紡錘體檢查點的正常功能，從而有助于腫瘤染色體非整倍體的發(fā)生和發(fā)展[85].這些研究表明Pellino1可能是癌癥的潛在治療靶點.然而，也有研究發(fā)現(xiàn)Pellino1通過腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞極化抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展：M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子以減少炎癥反應(yīng)，具有抗腫瘤作用；Pellino1介導(dǎo)IRAK1的K63多聚泛素化而增加其蛋白穩(wěn)定性，促使IRAK1磷酸化激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transduction and activator of transcription 1,STAT1)，從而抑制IL-10誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2c型極化，抑制體內(nèi)腫瘤生長[86].

Pellino2在胃癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，通過增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長因子C的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[87].然而，其具體的分子調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步探討.

Pellino3也參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控.Pellino3在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中異常高表達(dá)，且與不良預(yù)后正相關(guān)，敲減Pellino3在體內(nèi)和體外均抑制NSCLC的增殖、遷移和侵襲[88].而在卵巢癌中，Pellino3的mRNA水平在卵巢癌患者血清中呈低表達(dá)，可作為生物標(biāo)志物用于區(qū)分卵巢癌、良性腫塊和正常對照[89].

綜上，Pellino蛋白通過靶蛋白泛素化參與NF-κB、MAPK、TNF和NOD2信號通路調(diào)控，介導(dǎo)自身免疫、炎癥、癌癥、心臟疾病及肥胖等疾病的發(fā)生發(fā)展(表1).

表1 Pellino蛋白通過靶蛋白泛素化介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和疾病發(fā)生發(fā)展

4 展 望

自Pellino蛋白被發(fā)現(xiàn)以來，人們對這個進(jìn)化保守的E3的生物學(xué)功能認(rèn)識還十分不足.基于Pellino蛋白的廣泛表達(dá)，其生物學(xué)功能可能不局限于炎癥和免疫調(diào)節(jié).Pellino蛋白在免疫相關(guān)疾病中異常表達(dá)，雖然調(diào)控其表達(dá)的分子機(jī)制尚不明確，但是目前研究已表明Pellino蛋白是多種疾病的潛在藥物靶標(biāo).

由于各成員的序列和結(jié)構(gòu)具有高度同源性，且目前已發(fā)現(xiàn)Pellino蛋白在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子調(diào)控機(jī)制上有許多交叉，各成員之間如何調(diào)配以介導(dǎo)靶蛋白的泛素化及相關(guān)信號通路的調(diào)控，成員之間是否存在功能性代償，這些問題還有待深入探討.基因編輯技術(shù)和小鼠組織特異性敲除技術(shù)的發(fā)展，將大大推動Pellino蛋白的生物學(xué)功能研究.