混合硫酸鹽還原菌的篩選及其最適生長條件的研究

蒲佳洪 羅學(xué)剛 王經(jīng)明 梁朱明

摘要：通過選擇培養(yǎng)基篩選出混合硫酸鹽還原菌，并研究其最適的生長條件，考察了接種量、溫度、最初pH、Fe2+對其生長的影響。結(jié)果表明，在接種量為10%，溫度為35 0C，初始pH為6.5，培養(yǎng)基內(nèi)Fe2+為200 mg/L時，混合硫酸鹽還原茵生長最好。

關(guān)鍵詞：混合硫酸鹽還原菌;接種量;溫度;初始Fe2+

中圖分類號：X703

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020） 08-0054-04

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439- 8114.2020.08.011

隨著中國核軍工和核電的快速發(fā)展，對鈾資源的需求及對鈾礦的開發(fā)也在不斷增加。在鈾礦開采、核電站設(shè)施運行過程中產(chǎn)生的含鈾廢水和工藝廢水也隨之增多[1]。這些鈾污染水體具有產(chǎn)量大、放射性活度低、半衰期長等特點，會對周圍生態(tài)環(huán)境造成潛在的危害[2，3]。進而這些鈾污染水體通過各種環(huán)境因素進入人體，影響人們的身體健康，因此關(guān)于鈾礦等產(chǎn)生的鈾污染水體受到了越來越多的關(guān)注，有效處理鈾污染水體已成為了一個亟待解決的環(huán)境問題。

處理鈾污染水體的方法主要有化學(xué)沉淀、蒸發(fā)濃縮、吸附、膜分離、氧化還原等[4-6]。傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法處理鈾污染水體存在操作復(fù)雜、成本高、容易造成二次污染等缺點[7]。而利用微生物來處理鈾污染水體已經(jīng)被證明是一種可行的方法，尤其是在處理污染面積大、鈾污染水體中鈾濃度較低時能夠顯著地降低處理成本[8，9]。

迄今為止，對鈾污染水體的處理一般都是對污染水體中的鈾進行吸附或者還原。Barlett等[10]研究發(fā)現(xiàn)添加Fe3+會促進硫酸鹽還原菌（ Sulfate-reduc-ing bacteria，SRB）對U（VI）的還原能力;汪愛河等[11]在缺氧的環(huán)境下，利用零價鐵和SRB混合來處理鈾污染水體，在最佳還原條件下，鈾的去除率高達93.49%;謝水波等[12]探討了S042-、Fe0對硫酸鹽還原菌顆粒吸附U（VI）的影響，表明在S042-濃度低于1 500mg/L時，能促進硫酸鹽還原菌顆粒去除U（VI），并且投加鐵粉會提高去除速率，在20 h內(nèi)，U（VI）的去除率達到100%。以上研究都是對鈾進行還原或吸附來處理鈾污染水體，但吸附還原處理后又產(chǎn)生了其他的污染。

采用微生物硫酸鹽還原菌來去除污染水體中的鈾，但單一的SRB處理方法受環(huán)境條件的影響明顯，如pH要求在5-8、溫度在30-35℃，所以單一的菌種不能處理超出菌種生長條件的鈾污染水體，其應(yīng)用受到限制[13，14]。而混合的SRB能增加其對環(huán)境的耐受性，可以提高微生物的處理效果。而放射性重金屬一般對微生物有一定的抑制作用，因此，本試驗將從某尾礦區(qū)各處污染水體中取樣，篩選出耐鈾的混合硫酸鹽還原菌，并研究該混合菌的最適生長條件，旨在為后續(xù)的處理鈾污染水體提供有效的微生物原材料，研究該混合菌的最適生長條件，為后續(xù)處理鈾污染水體提供便利。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 水樣高濃度的重金屬可以抑制微生物的生長和繁殖，阻礙呼吸作用，使細胞形態(tài)異常，使細胞裂解甚至改變核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，干擾氧化磷酸化，影響細胞滲透壓平衡。所以直接在某尾礦區(qū)水源中取樣，在尾礦區(qū)生長的微生物有一定的耐受能力。分別在尾礦壩的上游水邊、尾礦壩中心水邊和尾礦壩下游水邊設(shè)置3個取樣點，而土壤中含有的微生物比水中多，故在每個取樣點水下5-10 cm處用鏟子取淤泥1 000 g，裝入樣品袋密封，室溫保存。

1.1.2 培養(yǎng)基因為硫酸鹽還原菌屬于厭氧菌，需要用特殊的選擇培養(yǎng)基篩選。本試驗采用以乳酸鈉為碳源改良的Starkey培養(yǎng)基，各成分（g/L）如下：K2HP04 0.5，NH4CI l.0，Na2S04 0.5，65%乳酸鈉5.0，CaCl2 0.076， MgS04. 7H20 2.0，（ NH4） 2Fe（ S04）2. 7H2O0.5，抗敗血酸0.1，酵母浸膏1.0。

1.1.3 儀器 臺式數(shù)顯pH計，常州三豐儀器科技有限公司;生化培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;電子天平，奧豪斯儀器有限公司;可見光分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 篩選混合的硫酸鹽還原菌將取回的淤泥與改良的Starkey培養(yǎng)基按1：1的體積比放人100 mL醫(yī)用厭氧瓶中，再向瓶內(nèi)通入氮氣5 min，保證瓶內(nèi)無氧氣，蓋上瓶蓋，再用橡皮塞封口，把醫(yī)用厭氧瓶放于35℃恒溫生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間觀察其顏色、氣味等，篩選出混合的硫酸鹽還原菌，單一的菌種限制因素多，有的菌種要特定的pH、溫度等。采用混合的硫酸鹽還原菌提高其適應(yīng)范圍，且單一的菌種對還原礦化效果沒有混合菌好。

1.2.2 混合SRB最適生長條件 分別研究4個因素對混合SRB生長的影響。

1）接種量。接種量是指向培養(yǎng)基中加入混合菌的體積和培養(yǎng)基體積的比例。接種量的多少會影響混合菌的新陳代謝和生長繁殖，采用較大的接種量可以縮短混合菌生長達到最高峰的時間;接種量過少延滯生長的時間變長。所以接種量的多少能影響混合菌的生長[15]。分別以5%、10%、15%的接種量將篩選出來的混合菌接種到已配好的培養(yǎng)基中，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔8h利用可見光分光光度計測定該混合菌OD。

2）初始pH。pH影響膜的通透性及膜表面電荷的性質(zhì)，從而對物質(zhì)的吸收產(chǎn)生影響。微生物生長需要合適的pH，且H+離子濃度會影響硫酸鹽還原酶系的構(gòu)象和生物學(xué)活性。有研究顯示，硫酸鹽還原菌的活性最高一般處于6.0-7.5，處理硫酸鹽的效果最好[16]。一般來說，鈾尾礦壩浸出的鈾污染水體均呈酸性，需要通過馴化來提高該混合菌對酸的耐受性。本試驗將混合菌接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為3.0-7.5，每0.5 一個梯度，每隔8h利用可見光分光光度計測定該混合菌OD，重復(fù)5次，取平均值，得出每個pH條件下的最大OD。

3）溫度。溫度會影響混合菌內(nèi)酶的活性，溫度變化影響酶促反應(yīng)速率，最終影響混合菌的生長代謝。有研究表明SRB最佳生長溫度約為30℃[17]。但硫酸鹽還原的速率一般在溫度為35℃時達到最大，但反應(yīng)過程不僅受溫度影響，還受其他因素影響，所以本試驗設(shè)置溫度梯度為10、20、25、35℃，將培養(yǎng)基放在4個不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔8h用可見光分光光度計測定其OD。

4） Fe2+質(zhì)量濃度。二價鐵離子是細胞色素C3的重要組成部分，細胞色素C3能作為電子載體參與低電位的氧化還原反應(yīng)，不同硫酸鹽還原菌的純化氫酶所催化的放氫反應(yīng)僅在有細胞色素C3存在時才能以較高的速率進行。二價鐵離子的存在會影響細胞產(chǎn)生細胞色素C3的數(shù)量，而細胞色素C3在整個電子傳遞過程中參與轉(zhuǎn)移蛋白，所以二價鐵離子對整個電子傳遞鏈有間接的促進作用。考察培養(yǎng)基內(nèi)含有不同F(xiàn)e2+質(zhì)量濃度對混合菌生長過程的影響，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中Fe2+的初始質(zhì)量濃度為0、50、100、200、400mg/L，培養(yǎng)溫度為35℃，每隔8h用可見光分光光度計測定其OD，重復(fù)5次，取平均值，得到每個Fe2+質(zhì)量濃度下最大的OD。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選混合硫酸鹽還原菌（SRB）

從圖1可以看出，經(jīng)過7d的培養(yǎng)，接種尾礦壩中心水源邊上的淤泥和尾礦下游的厭氧瓶內(nèi)全部呈現(xiàn)黑色，上游顏色未變。尾礦壩中心水源邊上的厭氧瓶內(nèi)黑色更深，還有濃烈的臭雞蛋氣味產(chǎn)生，得到的硫酸鹽還原菌更多。這是因為在無氧條件下，硫酸鹽還原菌還原培養(yǎng)基內(nèi)的硫酸根離子產(chǎn)生H2S，初步斷定尾礦壩中心水源邊上的淤泥中含有大量的硫酸鹽還原菌。本試驗并沒有對得到的混合硫酸鹽還原菌進一步分離純化，是因為有的菌種要特定的pH、溫度等。采用混合的硫酸鹽還原菌提高其適應(yīng)范圍，且單一的菌種對還原礦化效果沒有混合菌好。從厭氧瓶中取25mL菌液置于250mL厭氧瓶中進行擴大培養(yǎng)，7d后得到擴大培養(yǎng)的混合硫酸鹽還原菌。

2.2 混合SRB的最適生長條件研究

2.2.1 接種量對混合SRB生長的影響 從圖2可以看出，5%的接種量會使混合SRB延滯生長36 h，在36-72 h，每隔8 h OD625nm增加0.01-0.02，至72h細菌數(shù)量OD625 nm達最大，為0.22;而10%和15%的接種量都使混合菌的數(shù)量在48h達到最大值，OD625nm分別為0.40和0.42，0-48 h代表細菌數(shù)量的OD625nm增加都在0.04-0.10，增幅在20%-30%，比較明顯。因此，后續(xù)試驗采用接種量為10%進行。2.2.2初始pH對混合SRB生長的影響從圖3可以看出，pH在3.0-4.0時，混合菌生長受到抑制，OD625nm都在0.03左右，基本沒有生長，強酸性環(huán)境下氫離子與細胞膜上酶的相互作用受到影響，從而抑制了混合菌的生長;在pH為4.5時，開始有一定的生長，OD625nm達到0.13;pH為4.5-6.5時，混合菌的數(shù)量呈上升趨勢，至pH為6.5時，OD625—從0.13上升到0.36，達到最大，pH每上升0.5，OD625nm增加35%-50%;pH在6.5-7.5，混合菌的數(shù)量有一定的減少。因此，pH為6.5是該混合硫酸鹽還原菌的最適pH。

2.2.3 溫度對混合SRB生長的影響 由圖4可以看出，在溫度為10、20℃時，OD625nm在0.05左右，混合SRB幾乎沒有生長，溫度太低，生長代謝幾乎停止，活性受到很大的抑制;溫度在25℃時，混合菌在0-40 h基本沒有生長，OD625nm保持在0.05，之后緩慢生長，在80 h時，OD625nm。達到0.18左右;在溫度為35℃時，生長48 h細菌OD625nm達到最高峰，為0.36，之后由于競爭關(guān)系，混合菌的數(shù)量減少，在80 h時OD625nm減少至0.24。在溫度為35℃時，混合菌48 h就達到了生長的最高峰，而在溫度為25℃時要到80 h時才具有一定的生長，且混合菌數(shù)量均比25℃時多。因此，溫度在35℃時為該混合SRB的最適生長溫度。

2.2.4初始Fe2+質(zhì)量濃度對混合SRB生長的影響 由圖5可以看出，初始Fe“質(zhì)量濃度為0-200mg/L，隨著濃度的增加，混合SRB數(shù)量增加，F(xiàn)e2+質(zhì)量濃度為0時，OD625nm為0.24，F(xiàn)e2+質(zhì)量濃度為50 mg/L時，OD625nm為0.40，F(xiàn)e2+質(zhì)量濃度為100 mg/L時，OD625nm為0.42，F(xiàn)e2質(zhì)量濃度為200 mg/L時，OD625nm為0.44，說明在0-200 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)e2+促進混合菌的生長;在質(zhì)量濃度為400mg/L時，混合菌的數(shù)量明顯減少，OD625nm下降到0.28，說明在初始Fe“質(zhì)量濃度大于200mg/L后，F(xiàn)e2+對混合菌生長的促進效果不明顯。因此，在配制培養(yǎng)基時，F(xiàn)e2+質(zhì)量濃度應(yīng)控制在200mg/L。

3 討論

3.1 接種量

當(dāng)接種量過低時，生長物質(zhì)彌散到細胞外，致使細胞內(nèi)的生長物質(zhì)濃度過低，此時細胞不能增殖，抑制細胞生長，細胞變圓不能貼壁，甚至引起細胞死亡[18]副。這是在接種量為5%時，混合SRB生長受到延滯的原因;當(dāng)接種量過高時，每個細胞周圍培養(yǎng)液的容積降低，由于彌散率的降低，細胞內(nèi)生物質(zhì)的濃度增加，容易使排除物或代謝產(chǎn)物達到飽和，能量也很快耗盡，因此也會阻礙細胞的生長繁殖[18]。而在接種量為10%和15%時，混合SRB的生長曲線基本相同，初步判定這是該混合硫酸鹽還原菌的適宜接種量。

3.2 初始pH

pH在3.0-4.5時，屬于強酸性環(huán)境，大量的H+離子會影響細胞膜的通透性和膜上電荷的變化，抑制了混合SRB的生長。pH在4.5-6.5時，混合SRB有一定的適宜條件，開始呈對數(shù)生長，在pH為6.5時混合SRB的數(shù)量達到最大值。而在pH大于6.5時，由于細胞競爭，培養(yǎng)基內(nèi)生長物質(zhì)減少、代謝產(chǎn)物的積累等原因，使細胞數(shù)量有一定的減少。所以選取pH 6.5為}昆合硫酸鹽還原菌的最適pH。

3.3 溫度

當(dāng)外界溫度分別為10和20℃時，由于溫度過低，減少了混合菌的代謝作用[19]。在56 h時開始緩慢生長。溫度在25℃時，混合菌前40 h基本沒有生長，OD625nm保持在0.05，之后緩慢生長，在80 h時OD625nm達到0.18左右。微生物生長的最適溫度由溫度對細胞內(nèi)無數(shù)個酶反應(yīng)的影響綜合決定[20]，在0-40 h有部分的酶反應(yīng)在進行，但混合SRB數(shù)量并沒有增加。40-80 h代謝產(chǎn)物的積累可能使其他酶反應(yīng)也開始進行，所以該混合菌有一定的生長。當(dāng)溫度在35℃時，該混合菌的生長曲線符合微生物的一般生長曲線，在48 h時達到了最高點，而后有一些減少。因此，選取35℃為混合硫酸鹽還原菌的最適溫度。

3.4 初始Fe2+質(zhì)量濃度

二價鐵離子主要通過影響細胞呼吸傳遞鏈的電位變化來影響微生物的生長[21]。初始Fe2+質(zhì)量濃度在0、50、100 mg/L時，OD625nm都沒有達到最高，說明初始Fe2+質(zhì)量濃度不夠，細胞色素C3的數(shù)量過少，影響了硫酸鹽還原菌氫化酶催化的放氫反應(yīng)，該混合菌的生長并沒有達到最佳的條件。當(dāng)初始Fe2+質(zhì)量濃度在200mg/L時，OD625nm達到最大，為0.44，最適合該硫酸鹽還原菌的生長。當(dāng)初始Fe2+質(zhì)量濃度在400mg/L時，OD625nm降到0.28，是因為過量的金屬離子會抑制混合菌的生長[22]。

4 小結(jié)

1）試驗結(jié)果顯示，只有接種尾礦壩中心水源邊上的淤泥里含有大量的硫酸鹽還原菌。

2）通過試驗得出該混合硫酸鹽還原菌的最適生長條件為接種量10%，pH為6.5，溫度為35℃，初始Fe2+質(zhì)量濃度為200mg/L。

3）后續(xù)研究利用混合硫酸鹽還原菌氧化還原去除鈾污染水體中的鈾，需對篩選得到的混合菌進行馴化，以提高混合菌對環(huán)境的耐受性和對鈾的去除效果。

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基金項目：國家國防基礎(chǔ)科研計劃項目（ JCKY2016404C002）

作者簡介：蒲佳洪（1993-），男，四川巴中人，在讀碩士研究生，研究方向為污染環(huán)境生物效應(yīng)與生態(tài)修復(fù)，（電話）13320908460（電子信箱）327452675@qq.com;通信作者，羅學(xué)剛（1957-），男，教授，博士，主要從事生物質(zhì)資源利用和污染環(huán)境控制與生物修復(fù)的教學(xué)和科研工作，（電子信箱）lxg@swust.edu.cn。