質(zhì)譜技術(shù)在植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用

摘要：植物蛋白質(zhì)組是植物生理特征的動態(tài)反映，在植物生長發(fā)育、組織器官分化、抵御外界干擾等生理病理過程中發(fā)揮著重要作用。綜述了基于質(zhì)譜技術(shù)的植物不同器官、不同發(fā)育階段、響應(yīng)生物及非生物脅迫過程中的蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展，以期對后續(xù)植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供思路設(shè)計和試驗方法上的參考。

關(guān)鍵詞：植物蛋白質(zhì)組;質(zhì)譜;生長發(fā)育;脅迫響應(yīng)

中圖分類號：Q94

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（ 2020） 08-0005-06

D01：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.08.001

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

鑒定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)成為植物科學(xué)的重要研究內(nèi)容。對蛋白質(zhì)氨基酸序列的研究在蛋白質(zhì)、多肽與其編碼基因研究之間搭建了橋梁，更是研究植物蛋白質(zhì)生理功能及其基因調(diào)控間關(guān)系的重要紐帶。對蛋白質(zhì)的研究，使研究者可以更好地了解植物細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與作用機制，更全面地認(rèn)識不同的生物學(xué)過程。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)（Mass Spectrometry，MS）的不斷發(fā)展，質(zhì)譜檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度不斷提高，質(zhì)譜法逐漸取代Edman降解等傳統(tǒng)方法，成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要手段。

1 基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)概念及常用手段

蛋白質(zhì)作為生物體不同生物學(xué)功能的物質(zhì)承擔(dān)者，其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性一直以來都是生物領(lǐng)域的熱點問題。1996年，Wilkins等[1]提出并使用蛋白質(zhì)組學(xué)（ Proteomics） 一詞，它是“protein”及“genome”2個詞的結(jié)合，指的是對某一特定階段的某種細(xì)胞或者組織器官中所有蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測與研究，包括其表達(dá)特征、分布特征、相互作用特征、翻譯后修飾特征等。人類含有20 235個基因，對應(yīng)超過100 000個蛋白質(zhì)，可見蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有高度復(fù)雜性及較大的動態(tài)范圍。不同蛋白質(zhì)間的數(shù)量、分子量及親疏水性上的差別，加大了蛋白質(zhì)組學(xué)的研究難度[2]。蛋白質(zhì)組學(xué)是表征基因功能最好的方式，基因表達(dá)水平的波動可以被蛋白質(zhì)組學(xué)動態(tài)地反映出來。

在植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的策略是自下而上質(zhì)譜鑒定方法的鳥槍法研究策略。自下而上的研究策略將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行酶切，酶切后的肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過將鑒定到的碎片離子進(jìn)行拼接得到的序列信息與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的理論酶切結(jié)果進(jìn)行比較，確定待測蛋白質(zhì)樣品的氨基酸序列。鳥槍法的優(yōu)勢在于肽段易于利用色譜等方法進(jìn)行預(yù)分離，分離后的樣品易溶解在水溶液中，在高溫環(huán)境中氣化而轉(zhuǎn)化為噴霧狀，繼而在外加電場的影響下形成帶電離子傳人質(zhì)譜，在較為簡單的碎裂條件下形成碎片離子而被質(zhì)譜儀檢測到。鳥槍法利用肽段的定性、定量信息來反映蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及表達(dá)量，基于這種思路，多種定量分析方法也被開發(fā)出來，例如ICAT[3]、TMT[4]、iTRAQ[5]、DiLeu[6]等，如圖1所示。

在利用鳥槍法進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢測前，常用一定的方法對復(fù)雜體系的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行預(yù)分離，以達(dá)到更好的鑒定效果。預(yù)分離方法主要分為2類，基于液相的蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)和基于凝膠電泳的分離與純化技術(shù)?；谝合嗟牡鞍踪|(zhì)分離與純化主要是利用不同蛋白質(zhì)分子的物理、化學(xué)性質(zhì)的不同而實現(xiàn)彼此間的分離，如離子交換色譜（ Ion Ex-change Chromatography，IEC）[7]、排阻色譜（Size Ex-clusion Chromatography.SEC）[8]、親和色譜法（Affini-ty Chromatography， AC）[9]等。

基于凝膠的預(yù)分離方法主要是依據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同或者分子量及等電點的不同，將蛋白質(zhì)在凝膠中分離開來，主要包括十二烷基磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium Dodecvl Sulfate-Polyacryl-amide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE）[10]、雙向凝膠電泳（Two-dimensional Gel Electrophoresis， 2D-Gel）[11]和二維熒光差異凝膠電泳（Two-dimensional Differ-entialGel Electrophoresis，2D-DIGE）[12]?；谀z的分離方法，尤其是2D-Gel作為一項成熟的技術(shù)已經(jīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用超過30年。

2 植物組織或細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

2.1 不同器官的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

根、葉和果實等作為植物體的重要器官，其蛋白質(zhì)組得到了廣泛的研究。植物的根系在植物生物量中占有很大比重，在植物的水及營養(yǎng)吸收、植物在土壤中的固定及植物對地下環(huán)境的感知中發(fā)揮著重要作用。Petricka等[13]利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，分離出6種擬南芥根細(xì)胞，包括根毛細(xì)胞、非根毛表皮細(xì)胞、皮質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞、脈管系統(tǒng)細(xì)胞和小柱細(xì)胞，并對這6種細(xì)胞的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了質(zhì)譜檢測。對鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有超過1/3的蛋白質(zhì)特異性地在單一類型細(xì)胞中表達(dá)，其中238個蛋白質(zhì)僅在根毛中表達(dá)，其功能與細(xì)胞尖端生長、肽基一脯氨酸羥基化、糖基轉(zhuǎn)移和輔酶Q的生物合成相關(guān)。對根毛及非根毛表皮蛋白質(zhì)組及轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，Lan等[14]在含有pEXP7-GFP報告結(jié)構(gòu)的擬南芥植物根部共鑒定到23 034個基因及2 447個高可信蛋白質(zhì)，其中129個蛋白質(zhì)在根毛及非根毛組織中差異表達(dá)。同時，Lan等L141發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與蛋白質(zhì)的豐度并不總是完全對應(yīng)的，這表明細(xì)胞分化過程受到諸多因素調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、蛋白質(zhì)的翻譯后修飾等，這些因素所產(chǎn)生的影響并不均等。

Martin等[15]利用寬粒子選擇監(jiān)控數(shù)據(jù)非依賴型非標(biāo)定量方法（ label-free Wide Selected-Ion Monitor-ing Data-Independent Acquisition， WiSIM-DIA）.建立了包含來自2 338個番茄果實蛋白質(zhì)的11 753條特有肽段庫，對角質(zhì)缺陷2基因型（CUTIN DEFI-CIENT2，CD2）番茄與M82基因野生型番茄進(jìn)行蛋白質(zhì)組定量研究。共鑒定到1 140個番茄蛋白質(zhì)，其中67個蛋白質(zhì)在2種基因型番茄中存在表達(dá)差異，差異表達(dá)的蛋白質(zhì)參與表皮素的生物合成。試驗證實，CD2蛋白質(zhì)影響細(xì)胞壁的合成、花青素的合成、植物生長并參與壓力應(yīng)答。類似地，Mata等[16]利用超速離心、凝膠分離、膠內(nèi)酶解及高pH反相色譜分離等技術(shù)，提取并分離番茄表皮全蛋白質(zhì)，繼而利用Thermofisher Scientific Q Exactive質(zhì)譜儀與AB Sciex Triple-TOF 6600質(zhì)譜儀對其進(jìn)行分析，共鑒定到8 588個蛋白質(zhì)。

葉片組織是綠色植物光合作用的主要場所，受到真菌感染的葉片易發(fā)生壞死，而導(dǎo)致嚴(yán)重的作物損失。Zhang等[17]利用iTRAQ標(biāo)記對交鏈孢菌感染后的茉莉酸不敏感型番茄葉片及野生型葉片進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定到10 367個蛋白質(zhì)，其中有2 670個蛋白質(zhì)存在差異表達(dá)。Aryal等[18]利用排阻色譜法對擬南芥葉片的胞質(zhì)蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離，鑒定到上百個以穩(wěn)定復(fù)合體形態(tài)存在的蛋白質(zhì)。

2.2 不同細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

隨著植物蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及科學(xué)探索的不斷深入，對植物的蛋白質(zhì)組研究已經(jīng)由細(xì)胞水平轉(zhuǎn)入亞細(xì)胞水平，多種重要細(xì)胞器內(nèi)的蛋白質(zhì)分布特點得到了詳盡描述。葉綠體在細(xì)胞代謝中處于中心地位，不僅為細(xì)胞提供能量和代謝中間產(chǎn)物，還在某些輔酶、輔酶因子及脂類的生物合成最終步驟中發(fā)揮催化作用[18]。借助SDS-PACE電泳技術(shù)，Salvato等[19]將提取的馬鈴薯塊莖線粒體全蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，分離后的蛋白質(zhì)條帶經(jīng)膠內(nèi)酶解后通過LTQ Orbitrap XL進(jìn)行質(zhì)譜檢測。利用4種搜庫軟件，在馬鈴薯塊莖線粒體中共鑒定到1 060個非冗余蛋白質(zhì)，其表達(dá)量的動態(tài)范圍高達(dá)1 800倍，廣泛參與細(xì)胞電子傳遞鏈的組成、三羧酸循環(huán)過程及蛋白質(zhì)運輸結(jié)構(gòu)的組成。此外，這些蛋白質(zhì)中超過50%的蛋白質(zhì)發(fā)生了一種以上翻譯后修飾，最常見的為氧化修飾。

葉綠體作為植物細(xì)胞所特有的能量細(xì)胞器，是一系列代謝途徑的集合，包含多個蛋白質(zhì)復(fù)合體機器，包括光合系統(tǒng)I和光合系統(tǒng)Ⅱ、細(xì)胞色素b6f復(fù)合體和ATP合成酶等[20，21]。此外，葉綠體也是必需氨基酸、脂肪酸和維生素合成的場所。因此，葉綠體蛋白質(zhì)表達(dá)特點一直以來都是植物學(xué)家關(guān)注的熱點問題。Lande等[22]利用Percoll梯度過濾法從鷹嘴豆中分離葉綠體，并用丙酮及尿素提取葉綠體蛋白質(zhì)，SDS-PAGE電泳分離及酶切后進(jìn)行質(zhì)譜檢測，共鑒定到2 451個蛋白質(zhì)，包括27個異構(gòu)體。類似地，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法，Uberegui等[23]以光對葉綠體蛋白質(zhì)的影響為研究對象，檢測到幾種光合作用及碳代謝相關(guān)蛋白質(zhì)以及胞質(zhì)mRNA加工相關(guān)蛋白質(zhì)的豐度變化，提示執(zhí)行蛋白質(zhì)（Executer pro-teins）在光照條件下參與擬南芥的信號傳導(dǎo)，參與調(diào)控葉綠體代謝及植物對環(huán)境變化的響應(yīng)。

高爾基體在植物細(xì)胞壁基質(zhì)多糖合成、蛋白質(zhì)糖基化及囊泡轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮著重要作用，Parsons等[24]利用密度梯度離心及表面電荷分離技術(shù)，從擬南芥中分離出高爾基體膜，利用質(zhì)譜定量技術(shù)共鑒定出371個高爾基體蛋白質(zhì)，其中包含參與細(xì)胞壁合成的重要蛋白質(zhì)。

3 植物脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)分析

3.1 生物脅迫

植物的生物脅迫是指植物在生長發(fā)育過程中，由于其固著生長的特點，容易受到一些生物體來源的環(huán)境脅迫，如病原體感染（包括真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲）[25]、寄生植物干擾、害蟲干擾等，植物通過多種生理、生化、細(xì)胞和分子水平的變化來抵抗這些脅迫效力。宿主植物主要通過2種方式來抵御病原體等生物脅迫，即組成型抵抗和誘導(dǎo)型抵抗。植物組成型抵抗主要依賴于形態(tài)學(xué)特征的改變和次生代謝產(chǎn)物的合成，包括細(xì)胞壁成分（如木質(zhì)素、角質(zhì)和蠟質(zhì)）、氣孔結(jié)構(gòu)、低分子量抗真菌化合物、可以與真菌幾丁質(zhì)結(jié)合的凝集素以及核糖體失活蛋白質(zhì)等[26]。對宿主植物抵抗真菌感染的研究是目前最為深入的，真菌種類包括鐮刀菌（Fusarium）、稻瘟病菌（Pyricularia grisea）、炭疽病病原體（AnthracnosePathogens）、大豆銹病菌（Uromyces Appendiculatus）、甘藍(lán)鏈格孢（Alternaria Brassicicola）及葡萄孢菌（Botr-ytis Cinerea）等。Asano等[27]將鐮孢鐮刀菌和禾本科鐮刀菌接種到擬南芥花與葉片上，通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法并結(jié)合MALDI-TOF/TOF儀器的使用，鑒定到與病原體感染發(fā)病相關(guān)的顯著上調(diào)蛋白質(zhì)，其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）作為上調(diào)蛋白質(zhì)被首次發(fā)現(xiàn)。GST蛋白質(zhì)是防御反應(yīng)蛋白質(zhì)超家族的一員，在生物體對病原體的應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮生理功能。

炭疽病在世界范圍內(nèi)都有發(fā)生，尤其是在熱帶和亞熱帶濕熱地區(qū)，這些地帶更適合炭疽病病原菌的生長。Fang等[28]利用二維凝膠電泳技術(shù)對感染炭疽病菌24、48和72 h后的草莓葉片蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，并用MALDI-TOF/TOF 4800質(zhì)譜儀對樣品進(jìn)行差異蛋白質(zhì)鑒定，共檢測到49個差異蛋白質(zhì)，廣泛參與代謝過程、光合作用、能量產(chǎn)生過程，具備抗氧化活性;同時，在參與代謝途徑的蛋白質(zhì)水平上觀察到許多變化，包括卡爾文循環(huán)、磷酸戊糖途徑及糖酵解途徑，這些發(fā)現(xiàn)為探究非模式生物中的病原體抵抗機制提供了參考。

大多數(shù)植物病原細(xì)菌是桿狀細(xì)菌，包括假單胞菌屬、黃單胞菌屬、歐文氏菌屬、土壤桿菌屬、棒狀桿菌屬和根瘤菌屬[26]。Parker等[29]以Rio Grande番茄（RG）的2個基因同源品種，即表達(dá)Pto基因而與細(xì)菌不相容的RC-PtoR以及缺失Prf3基因而具有易感表型的RC-prf3，進(jìn)行iTRAQ定量，以探究不同時間點蛋白質(zhì)組的變化對植物抵抗病原體能力的影響。根瘤菌可以通過與豆科植物共生，形成根瘤并固定空氣中的氮氣從而為植物體提供營養(yǎng)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用。Nguyen等[30]采用iTRAQ試劑盒標(biāo)記根瘤菌感染及未感染的大豆根毛和脫落根全蛋白質(zhì)，借助Ni-NTA磁珠進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)富集，磷酸化蛋白質(zhì)組在LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析。在2種大豆根毛及脫落根中共鑒定到1 625個磷酸化肽段上1 659個磷酸化位點，分布在1 126個大豆磷酸化蛋白質(zhì)上。在根瘤菌感染后的大豆根毛及脫落根中，有來自240個磷酸化蛋白質(zhì)的273條磷酸化肽段含量發(fā)生顯著變化，數(shù)據(jù)揭示了大豆根毛磷酸化蛋白質(zhì)組的獨特特征，描述了在根瘤菌感染反應(yīng)中，激酶一底物和磷酸酶一底物相互作用所形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。

3.2 非生物脅迫

與生物脅迫不同，非生物脅迫主要是指來自無機環(huán)境中的干擾因素，如干旱、炎熱、寒冷、營養(yǎng)不足、鹽分過多或者土壤中的有毒金屬等[31]。干旱、鹽分和溫度脅迫是影響自然界植物地理分布、限制農(nóng)業(yè)植物生產(chǎn)力和威脅糧食安全的主要環(huán)境因素。理解植物對非生物脅迫的感知及適應(yīng)機制，對于提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力、維護(hù)環(huán)境的可持續(xù)性至關(guān)重要。寒冷對水稻的生長發(fā)育影響很大，水稻幼苗在低溫條件下出現(xiàn)生長遲緩、葉面卷曲及部分葉片死亡等現(xiàn)象。為了研究水稻對低溫脅迫的抵御機制，Ji等[32]利用三氟乙酸/丙酮提取耐寒型水稻Fujisaka 5及寒冷敏感型水稻9311的全蛋白質(zhì)，全蛋白質(zhì)經(jīng)二維凝膠電泳分離后進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜檢測，鑒定到59個抵御寒冷相關(guān)蛋白質(zhì)并對其功能進(jìn)行了分類。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)在寒冷條件刺激下，膜組成成分及結(jié)構(gòu)發(fā)生了破壞，代謝顯著改變，水稻防御體系激活。

干旱是植物生長抑制和作物減產(chǎn)的主要制約因素，全球氣候變化使得科學(xué)家對干旱問題的關(guān)注程度日益增加[33，34]。在干旱脅迫下，葉片氣孔閉合，二氧化碳的固定減少，導(dǎo)致通過卡爾文循環(huán)的NADP+再生減少。隨著光合系統(tǒng)活性和光合運輸能力的變化，更多的電子泄露并與氧氣反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)量增加[35]?；钚匝跛竭^高將會引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化以及酶活降低，核酸發(fā)生氧化損傷，最終引起細(xì)胞死亡。基于此，Tamburino等[36]以番茄葉綠體為研究對象，構(gòu)建干旱模型及干旱一恢復(fù)模型，通過綜合利用熒光差異二維凝膠電泳技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)，對葉綠體中參與干旱脅迫抵御過程的蛋白質(zhì)進(jìn)行了探究。試驗發(fā)現(xiàn)干旱脅迫條件下，番茄植物出現(xiàn)發(fā)育不良，脯氨酸、脫落酸水平升高，晚期胚胎基因轉(zhuǎn)錄水平升高。水分缺失對葉綠體蛋白質(zhì)影響很大，主要影響能量相關(guān)蛋白質(zhì)。

土壤重金屬污染是土壤無機物污染中危害較大的種類之一。重金屬污染來源有2種途徑，自然途徑及人為途徑。自然途徑主要是指成土母質(zhì)及成土過程中對土壤重金屬含量的影響;人為因素則包括工業(yè)、交通、農(nóng)業(yè)等帶來的重金屬污染。聚集在土壤中的重金屬由于無法被微生物分解而被植物吸收，進(jìn)入植物體內(nèi)，進(jìn)而通過飲食進(jìn)入人體。重金屬在人體內(nèi)以有害濃度蓄積，威脅人類健康。研究重金屬脅迫下植物的蛋白質(zhì)水平變化，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境保護(hù)具有重要指導(dǎo)意義。舉例來說，鎘是一種非必需重金屬，高濃度的鎘會引發(fā)植物代謝活動紊亂，如呼吸和蒸騰抑制、碳水化合物代謝紊亂等，對植物的生長發(fā)育造成影響[37]。此外，鎘在人體內(nèi)的蓄積會導(dǎo)致主要器官的慢性損傷[38]。針對鎘污染的嚴(yán)重后果，Xu等[39]利用含不同濃度CdCl2的培養(yǎng)液培養(yǎng)蘿卜幼苗，結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法、強陽離子交換法及實時定量PCR技術(shù)，對蘿卜根部組織全蛋白質(zhì)進(jìn)行了表達(dá)差異描述。對這些差異蛋白質(zhì)的功能注釋顯示，它們主要參與碳水化合物和能量代謝過程、脅迫防御過程及信號傳導(dǎo)途徑。實時定量PCR結(jié)果很好地證實了蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和高可信度。同時，一些與碳水化合物代謝、活性氧清除、細(xì)胞轉(zhuǎn)運及信號傳導(dǎo)相關(guān)的候選靶標(biāo)蛋白質(zhì)也被鑒定出參與蘿卜鎘脅迫響應(yīng)的調(diào)控，如乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、酰基輔酶A合成酶、草酰輔酶A脫羧酶和磷脂酶Dal等。Du等[40]利用不同濃度的PbCl2處理龍須菜，提取全蛋白質(zhì)并進(jìn)行二維凝膠電泳分離，將存在表達(dá)差異的蛋白質(zhì)切下酶解后進(jìn)行MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜檢測。質(zhì)譜結(jié)果顯示，不同處理濃度下蛋白質(zhì)的表達(dá)量變化幅度不同，其中有14個鉛脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)被檢測到，功能分析顯示其廣泛參與多種細(xì)胞功能，包括光合作用、能量和蛋白質(zhì)代謝、碳水化合物運輸和代謝、信號傳導(dǎo)及抗氧化。超氧化物歧化酶、過氧化物酶、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶和熱休克蛋白70在鉛刺激下表達(dá)上調(diào)。對其他重金屬，如鋅[41]、汞[42]等也有詳盡的研究。

4 植物發(fā)育過程中的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

植物的發(fā)育伴隨著基因與蛋白質(zhì)表達(dá)的改變，不同于基因組，蛋白質(zhì)組可以實時地反映植物體發(fā)育不同階段的特點。對植物發(fā)育過程中蛋白質(zhì)組的研究，可以更深入地了解植物生長發(fā)育的機制及其調(diào)控方式，對于農(nóng)業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)具有重要指導(dǎo)意義。Nambu等[43]對不同發(fā)育時間段接種的中慢生型百脈根根瘤菌全蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量分析，以探究根瘤菌與宿主建立固氮共生關(guān)系過程中的代謝調(diào)節(jié)機制。研究者對537個節(jié)結(jié)成熟過程中的蛋白質(zhì)表達(dá)量變化進(jìn)行了質(zhì)譜量化分析，發(fā)現(xiàn)碳和氨基酸代謝存在顯著變化。此外，中慢生型百脈根根瘤菌在節(jié)結(jié)形成初期進(jìn)入缺氮生長狀態(tài)，而在中期進(jìn)入富氮生長狀態(tài)，并在此階段吸收了氨。類似地，Marond-edze等[44]對不同發(fā)育階段的棗椰樹果實進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析，深入描述了在水果成熟過程中的蛋白質(zhì)豐度變化及發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)。

蓖麻作為一種重要的生物燃料作物，具有重要的應(yīng)用價值。Shah等[45]對蓖麻植物的4個發(fā)育階段的全蛋白質(zhì)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，分別鑒定到了626、613 .449和356個蛋白質(zhì)，共計882個非冗余蛋白質(zhì)，并鑒定到2種蓖麻毒素亞型，表明蓖麻毒素的表達(dá)并不局限在種子中，可能發(fā)揮防御作用。

5 展望

近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，植物蛋白質(zhì)組學(xué)的研究更為深入，尤其是經(jīng)典的模式生物，如擬南芥、大豆、水稻等，從基因水平到蛋白質(zhì)水平都得到詳盡的描述。然而，對于其他植物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究仍然停留在較低水平，如玉米、苜蓿、小麥等，雖然有相關(guān)文獻(xiàn)對其部分蛋白質(zhì)組學(xué)特征進(jìn)行報道，但仍然缺失對大部分蛋白質(zhì)的有效鑒定。此外，植物蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，如乙?；?、磷酸化、糖基化、甲基化等在植物的生長發(fā)育及抵御脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用，雖然已經(jīng)建立起基于質(zhì)譜技術(shù)的植物蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究方法，但依然缺少有效的分離、富集手段，以提高修飾蛋白質(zhì)的定性和定量研究的效率及準(zhǔn)確度。盡管如此，質(zhì)譜技術(shù)仍然是植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有力工具，在后續(xù)研究中扮演不可或缺的角色。

參考文獻(xiàn)：

[1] WILKINSM R，SANCHEZ J C，COOLEYAA，et al. Progress withproteome projects： Why all proteins expressed by a genome shouldbe identified and how to do it[J].Biotechnology&genetic engineer-ing reviews， 1996. 13： 19-50.

[2] PANDEY A， MANN M.Proteomics to study genes and genomes IJl.Nature， 2000 .405（ 6788）： 837-846.

[3] SCHMIDT F，DONAHOE S，HACENS K，et al.Complementaryanalvsis of the mycobacterium tuberculosis proteome hy two-dimen-sional electrophoresis and isotope-coded affinity tag technology[J].Molecular&cellular proteomics， 2004，3（1）：24-42.

[4] DAYON L， HAINARD A，LICKER V， et al_ Relative quantificationof proteins in human cerebrospinal fluids by MS/MS using 6-plexisobaric tags[J]. Anahtical chemistrV， 2008. 80（8）：2921-2931.

[5] ROSS P L，HUANG Y N，MARCHESE J N，et al.Multiplexed pro-tein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactiveisobaric tagging reagents[J]. Molecular&cellular proteomics，2005，3（12）： 1154-1169.

[6] FROST D C，GREER T，LI L.High-resolution enahled 12-plexDiLeu isobaric tags for quantitative proteomics[J].Analvtical chem-istry， 2015 .87（3）：1646-1654.

[7] GARCIA-CALVO M，PETERSON E P，RASPER D M，et al.Purifi-cation and catalytic properties of human caspase family members[J].Cell death and differentiation， 1999，6（4）：362-369.

[8] ARYAL U K，XIONG Y，MCBRIDE Z，et al.A proteomic strategyfor global analysis of plant protein complexes[J]. The plant cell，2014.26（ 10）： 3867-3882.

[9] HAGE D S，ANGUIZOLA J A，BI C， et al. Pharmaceutical and bio-medical applications of affinitv chromatography： Recent trends anddevelopments E J] . Journal of pharmaceutical and biomedical analy-sis . 2012 . 69 ： 93-105.

[10] KUMAR A. SRIVASTAVA N C . SINGH V P， et al. Electrophoret-ic analysis of indian isolates of Mycoplasma agalactiae and Myco-plasma bovii by SDS-PAC.E and immunoblotting [Jl. Veterinarymedicine international. 2014 . 2014 ： 892421.

[11] ISLAM N. LONSDALE M. UPADHYAYA N M. et al. Protein ex-traction from mature rice leaves for two-dimensional gel electro-phoresis and its application in proteome analysis [Jl. Proteomics ，2004.4（ 7） ： 1903-1908.

[12] MAROUGA R， DAVID S. HAWKINS E. The development of theDIGE system ： 2D fluorescence difference gel analysis technolo-gy [J]. Analytical and bioanalytical chemistry. 2005. 382 （3） ：669-678.

[13] PETRICKA J J. SCHAUER M A， MEGRAW M， et al. The proteinexpression landscape of the Arabidopsis root[ J] . Proceedings of thenational academy of sciences of the United States of America.2012 ， 109（18 ） ： 6811-6818.

[14] LAN P， LI W. LIN W D ， et al. Mapping gene activity of Arabidopsisroot hairs [ J l. Cenome biology ， 2013 ， 14（ 6） ： 67.

[15] MARTIN L B， SHERWOOD R W. NICKLAY J J. et al. Applica-tion of wide selected-ion monitoring data-independent acquisitionto identify tomato fruit proteins regulated by the CUTIN DEFI-CIENT2 transcription factor [J]. Proteomics. 2016， 16 （ 15-16） ：2081-2094.

[16] MATA C I， FABRE B .HERTOG M L， et al. In-depth characteriza- tion of the tomato fruit pericarp proteome [Jl. Proteomics. 2017， 1-2 ： 1600406.

[17] ZHANG M. KOH J， LIU L. et al. Critical role of COIl-dependentjasmonate pathway in AAL toxin induced PCD in tomato revealed by comparative proteomics[ J] . Scientific reports . 2016 ， 6 ： 28451.

[18] RAO R S， SALVATO F. THAL B， et al. The proteome of higherplant mitochondria[J l. Mitochondrion . 2017 . 33 ： 22-37.

[19] SALVATO F. HAVELUND J F. CHEN M. et al. The potato tuhermitochondrial proteome [Jl. Plant physiology. 2014， 164 （2） ：637-653.

[20] ZIMORSKI V. KU C . MARTIN W F. et al. Endosymbiotic theoryfor organelle origins [Jl. Current opinion in microbiology， 2014，22 ： 38-48.

[21] YADAV K N. SEMCHONOK D A. NOSEK L. et al. Supercomplex-es of plant photosystem I with cytochrome b6f， light-harvestingcomplex II and NDH [ J] . Biochimica et biophysica acta bioenerget-ics.2017 . 1858（ I ） ： 12-20.

[22] LANDE N V. SUBBA P. BARUA P. et al. Dissecting the chloro-plast proteome of chickpea （Cicer arietirzum L.） provides new in-sights into classical and non-classical functions [ J] . Journal of pro-teomics .2017， 165 ： 11-20.

[23] UBEREGUI E . HALL M. LORENZ0 0. et al. An Arabidopsis solu-ble chloroplast proteomic analysis reveals the participation of theexecuter pathway in response to increased light conditions EJl.Journal of experimental botany. 2015 . 66（ 7） ： 2067-2077.

[24] PARSONS H T. CHRISTIANSEN K. KNIERIM B. et al. Isolationand proteomic characterization of the ArabidopsiJ C.olgi defines functional and novel components involved in plant cell wall biosyn-thesis[J ] .Plant physiology ， 2012 . 159（ 1 ） ： 12-26.

[25] ZHOU L， CHEN F. PAN H . et al. Identifying virulence-associatedgenes using transcriptomic and proteomic association analyses ofthe plant parasitic nematode Bursaphelenchus mucronatu.s [J]. In-ternational journal of molecular sciences . 2016 . 17 （ 9） ： 1492.

[26] FANC X. CHEN J， DAI L. et al. Proteomic dissection of plant re-sponses to various pathogens [Jl. Proteomics. 2015. 15 （9） ：1525-1543.

[27] ASANO T， KIMURA M. NISHIUCHI T. The defense response inArabidopsis thaliana against Fusarium sporotrichioides [J]. Pro-teorue science .2012. 10（ 1 ） ： 61.

[28] FANC X P. CHEN W Y. XIN Y. et al. Proteomic analysis of straw-berry leaves infected with Colletotrichum fragariae [ J ] . Journal ofproteomics ， 2012 ， 75 （ 13 ） ： 4074-4090.

[29] PARKER J. KOH J.YOO M J， et al. Quantitative proteomics of to-mato defense against Pseudomonas syringae infection [Jl. Pro-teomics， 2013 . 13（ 12-13 ） ： 1934-1946.

[30] NGUYEN T H. BRECHENMACHER L. ALDRICH J T. et al.Quantitative phosphoproteomic analysis of soybean root hairs inoc- ulated with Bradyrhizobium japonicum [J]. Molecular & cellularproteomics . 2012. 11（ 11 ） ： 1140-1155.

[31] ZHU J K. Abiotic stress signaling and responses in plants[Jl. Cell，2016 . 167（ 2） ： 313-324.

[32] JI L， ZHOU P. ZHU Y. et al. Proteomic analysis of rice seedlingsunder cold stress [ J ] . The protein journal， 2017 . 36（ 4） ： 299-307.

[33] GHATAK A. CHATURVEDI P， NAGLER M. et al. Comprehen-sive tissue-specific proteome analysis of drought stress responsesin Pennisetum glaucu.m （L.） R. Br. （Pearl millet） [J].Journal of proteomics.2016. 143 ： 122-135.

[34] PAUL S， GAYEN D. DATTA S K. et al. Dissecting root proteomeof transgenic rice cultivars unravels metabolic alterations and accu-mulation of novel stress responsive proteins under drought stress[Jl.Plant science ： An intemational journal of experimental plant biolo-gy，2015.234： 133-143.

[35] BIEHLER K. FOCK H. Evidence for the contrihution of the me-hler-peroxidase reaction in dissipating excess electrons indrought-stressed wheat [Jl. Plant physiology， 1996， 112 （1） ： 265-272.

[36] TAMBURINO R. VITALE M. RUCGIERO A， et al. Chloroplastproteome response to drought stress and recovery in tomato （Sola-nu.m lycopersicum L. ） [Jl. BMC plant biology ， 2017. 17（ 1 ） ： 40.

[37] DALCORSO C， MANARA A. FURINI A. An overview of heavymetal challenge in plants ： From roots to shoots [J] . Metallomics ： In-tegrated biometal science . 2013 ， 5（9） ： 1 117-1132.

[38] D'ALESSANDRO A. TAAMALLI M， GEVI F. et al. Cadmiumstress responses in Brassica juncea ： Hints from proteomics and me-tabolomics [J]. Journal of proteome research， 2013. 12 （11） ：4979-4997.

[39] XU L.WANG Y.ZHANG F . et al. Dissecting root proteome chang-es reveals new insight into cadmium stress response in radish（Raphan LtS sativt.t.s L. ） [Jl. Plant & cell physiology. 2017 ， 58 （ 1 1） ：1901-1913.

[40] DU H， LIANG H H. JIANG Y. et al. Proteome responses of Cracilaria lemaneiformis exposed to lead stress [ J ] .Marine pollu-tion bulletin ， 2018 ， 135 ： 311-317.

[41] BARKLA B J. VERA-ESTRELLA R. MIRANDA-VERGARA M C . et al. Quantitative proteomics of heavy metal exposure in Arabi-dopsis thaliana reveals alterations in one-carbon metabolism en-zymes upon exposure to zinc [ J ] . Journal of proteomics. 2014. 111 ：128-138.

[42] BAIG M A， AHMAD J. BAGHERI R. et al. Proteomic and eco-physiological responses of soybean （ Clycine max L.） root nodulesto Pb and Hg stress[Jl. BMC plant hiology， 2018 ， 18（ I ） ： 283.

[43] NAMBU M. TATSUKAMI Y. MORISAKA H. et al. Quantitativetime-course proteome analysis of Mesorhizobium loti during nodulematuration[ J ] . Journal of proteomics . 2015 . 125 ： 112-120.

[44] MARONDEDZE C. Date fruit proteomics during development andripening stages [J]. Methods in molecular biology. 2017， 1638：381-398.

[45 ] SHAH M. TEIXEIRA F M. SOARES E L. et al. Time-course pro-teome analysis of developing extrafloral nectaries of Ricinus com-munis [ J ] . Proteomics . 2016 ， 16（4） ： 629-633.

作者簡介：閆昕（1993-），女，河北保定人，在讀碩士研究生，研究方向為蛋白質(zhì)組學(xué)，（電話）13752017761（電子信箱）664527679@qq.com。