檸檬酸鈉還原法提取納米金的改良與優(yōu)化＊

金壽瑞,王東敏,馬 婧,張?zhí)m蘭，班雨婷

（西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

近年來，納米材料在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域取得了令人矚目的成績[1]，也因其獨(dú)特的理化特性受到了醫(yī)療界的青睞[2]。納米金是一種直徑在1～100nm之間的金屬材料，其不僅具有鈉納米材料的基本屬性，還具有抗氧化性及殺菌、滅菌、抗腐蝕、促進(jìn)新陳代謝等生物活性。納米金的性質(zhì)主要取決于金顆粒的大小及其表面特性[3]，納米金的毒性與納米金粒徑關(guān)系密切，Anna等人[4]的研究顯示：10～20nm范圍內(nèi)的納米金對(duì)人體細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，因此，制備大小均勻、粒徑可控的納米金尤為重要。目前制備納米金的方法包括化學(xué)法和物理法兩大類，化學(xué)制備方法主要有氧化還原法、電化學(xué)法、紫外光分解法等[5-6]。物理方法主要有真空蒸鍍法、電分散法、激光消融法等；本實(shí)驗(yàn)是在經(jīng)典的檸檬酸鈉還原法[7-10]基礎(chǔ)上通過改變加熱方式、保護(hù)劑種類、還原劑用量，旨在制備出粒徑為10～20nm且分散性良好的納米金。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超純水機(jī) （上海和泰儀器有限公司）；水浴鍋（上海博迅生物儀器有限公司）；電爐（220v-AC,0～1000W,天津心雨儀器儀表有限公司）；磁力攪拌器（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；4℃冰箱 （海爾醫(yī)用4℃冰箱）；透射電鏡 （日本精工）；UV1100/75型紫外-可見分光光度計(jì)（上?，F(xiàn)科）；恒溫干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋(三強(qiáng)醫(yī)療器械)，酸度計(jì)（塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司），電子天平（BP221S）。氯金酸（分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸鈉；單檸酸；PVP；王水（分析純，均購自成都市科龍化工試劑廠）。配置濃度為1%的氯金酸溶液、0.1%的PVP溶液、1%的檸檬酸鈉、1%的單檸酸溶液，均放置于4℃冰箱中避光備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)室的室溫為22.5℃，當(dāng)?shù)胤悬c(diǎn)為98℃，制備方法為檸檬酸鈉還原法并分別從加熱方式、保護(hù)劑、檸檬酸鈉用量等方面進(jìn)行部分改良，實(shí)驗(yàn)過程中所涉及到的試劑全部做避光處理。詳細(xì)步驟如下：

1.2.1 加熱方式

取100mL的錐形瓶和250mL錐形瓶各一個(gè)，分別編號(hào)1和2。1號(hào)瓶中加入超純水50mL,2號(hào)瓶中則加入超純水200mL,用移液管分別取1%氯金酸0.5mL和2mL于1號(hào)和2號(hào)瓶中，使氯金酸溶液終濃度為0.01%。1號(hào)瓶放入水浴鍋中加熱5min（水浴鍋溫度設(shè)為當(dāng)?shù)胤悬c(diǎn)溫度），2號(hào)瓶則放在電爐上加熱5min（電爐調(diào)至500W,使瓶中液體沸騰），加熱后迅速取下分別各加入 1%檸檬酸鈉溶液 4.0和16.0mL，均放在磁力攪拌器上攪拌3min(攪拌器調(diào)制600W)，然后再次分別用上述加熱方法加熱20 min,加熱后再用磁力攪拌器上攪拌3min,后面以此法加熱3min，攪拌20min重復(fù)4遍。上述操作過程中密切觀察溶液顏色變化，第一次加熱期間無顏色變化，當(dāng)加入1%檸檬酸鈉溶液并攪拌后1號(hào)瓶中液體顏色變?yōu)榈纤{(lán)色，2號(hào)瓶中液體顏色則變?yōu)楹谧纤{(lán)色，繼續(xù)加熱攪拌后兩瓶溶液顏色均逐漸變淡，最終1號(hào)瓶液體顏色變?yōu)榍辶撩鞒旱拈偌t色，2號(hào)瓶中液體顏色變?yōu)橥噶辽钭纤{(lán)色，最后將兩瓶冷卻至室溫，1號(hào)和2號(hào)瓶分別加入1%單寧酸0.1和0.4mL 搖勻保存。

1.2.2 保護(hù)劑

取3個(gè)規(guī)格為100mL的錐形瓶，分別編號(hào)為1,2,3。分別取1%氯金酸0.5mL加入錐形瓶，使氯金酸溶液終濃度為0.01%。同時(shí)將3只錐形瓶于水浴鍋中加熱5min（水溫設(shè)為沸點(diǎn)溫度），加熱后取出，分別迅速加入3.4mL1%檸檬酸鈉并用磁力攪拌器攪拌3min(攪拌器調(diào)制600W)，然后再取下用水浴鍋加熱20min,加熱后再攪拌3min,后續(xù)加熱3min，攪拌20min重復(fù)4遍。操作過程中觀察，第一次加熱期間瓶中液體均無顏色變化，當(dāng)加入1%檸檬酸鈉溶液并攪拌后瓶中液體顏色均變?yōu)榈纤{(lán)色，繼續(xù)加熱攪拌后溶液顏色均逐漸變淡，最終為清亮明澈的橘紅色。最后取出冷卻至室溫，在2和3號(hào)錐形瓶中分別加入0.1mL1%單寧酸,0.1mL1%PVP作為保護(hù)劑。1號(hào)錐形瓶則不加任何試劑，因?yàn)闄幟仕徕c本身就具有保護(hù)劑的作用。

1.2.3 檸檬酸納用量

取6支100mL的錐形瓶，分別編號(hào)。各錐形瓶同時(shí)加入50mL超純水和0.5mL1%氯金酸,將6只錐形瓶放入水浴鍋中加熱5min（水浴鍋溫度設(shè)為沸點(diǎn)溫度），取出分別迅速加入1%檸檬酸鈉3,3.2,3.4,3.6,3.8 和 4.0mL 并 用 磁 力 攪 拌 器 攪 拌 3min(600W)，然后取下用水浴鍋加熱20min,加熱后攪拌3min,后續(xù)則加熱20min，攪拌3min重復(fù)4遍，上述全過程中觀察，第一次加熱期間5min瓶中液體均無顏色變化，當(dāng)加入1%檸檬酸鈉溶液并攪拌后瓶中液體顏色均變?yōu)榈纤{(lán)色，繼續(xù)加熱攪拌后溶液顏色均逐漸變淡，最終為清亮明澈的橘紅色。最后在這6個(gè)錐形瓶內(nèi)分別同時(shí)分別加入1%單寧酸0,1mL作為保護(hù)劑。

上述所有制備的納米金溶膠均采用目測法對(duì)其顏色進(jìn)行描述、紫外-分光光度計(jì)測量吸光譜、透射電鏡進(jìn)行外觀、粒徑及分散程度的特征鑒定并分析上述方法差異。

1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表征

1.3.1 目測法

將上述制備好的納米金溶膠避光保存至室溫后分別裝進(jìn)同規(guī)格的透明試管中，按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)試管編號(hào)。在外界環(huán)境相同的情況下，分別對(duì)各組納米金溶膠進(jìn)行目測觀察。針對(duì)同組不同編號(hào)的納米金溶膠的顏色差異比對(duì)分析，從而得出納米金溶膠的色差與實(shí)驗(yàn)方法之間的聯(lián)系。

1.3.2 紫外-分光光度計(jì)分析法

對(duì)所制備出的各組納米金溶膠進(jìn)行400～600nm全波長紫外-分光光度計(jì)測量吸光譜，對(duì)同組中納米金溶膠的波峰高度、紅移、藍(lán)移現(xiàn)象分析比較。

1.3.3 透射電鏡

將所制得的納米金溶膠制樣在烤燈下烤干，通過透射電鏡對(duì)其進(jìn)行外觀、粒徑及分散程度的特征鑒定并分各組納米金溶膠的差異。

2 結(jié)果

2.1 加熱方式的比較

加熱的溫度對(duì)于納米金的制備起關(guān)鍵作用，電爐加熱制得的納米金溶液為紫紅色，而水浴鍋加熱的納米金顏色為橘紅色（圖1目測圖）。明顯電爐加熱比水浴鍋加熱制備出的納米金顏色深且偏紫；從（圖1吸光圖）可知水浴鍋加熱制備的納米金的吸收峰比電爐加熱制備的納米金的吸收峰低，多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明納米金的吸收峰與加熱溫度的高低成正比；透射電鏡圖顯示電爐加熱制備出的納米金的粒徑比用水浴鍋加熱制備出的納米金的平均粒徑小，電爐加熱制備的納米金粒徑在13±2nm，水浴鍋加熱制備的納米金粒徑在18±2nm（如圖 1所示）。

圖1 兩種不同加熱方式制備出的納米金結(jié)果圖

2.2 保護(hù)劑種類的比較

保護(hù)劑的種類不同對(duì)納米金溶膠的顏色無影響（圖2左上目測圖）；三組納米金膠體紫外可見分光光度計(jì)吸光值顯示，分別用單寧酸或PVP作為保護(hù)劑相對(duì)用檸檬酸鈉作為保護(hù)劑提取的納米金，吸收峰值出現(xiàn)明顯的藍(lán)移現(xiàn)象（圖2右上吸光圖）；透射電鏡結(jié)果顯示三組納米金粒徑均勻，在15～17nm之間（圖2電鏡圖）。

圖2 不同保護(hù)劑制得的納米金結(jié)果圖

2.3 檸檬酸量的比較

當(dāng)檸檬酸鈉的用量控制在3.0～4.0mL之內(nèi)時(shí)，納米金膠體的顏色不會(huì)隨檸檬酸鈉用量的改變而改變 （圖3目測圖）；6組納米金膠體的紫外可見吸收光譜最大吸收峰峰位均為520nm且各組的最大吸光度值不同，最大的吸光度值為0.126，此組檸檬酸鈉用量為3.4mL（圖3吸光圖）。不同劑量檸檬酸鈉制備的納米金透射電鏡顯示6組粒徑在16～20nm之間（圖3電鏡圖），納米金透射電鏡粒徑與檸檬酸鈉劑量的回歸統(tǒng)計(jì)分析P=0.475,還不能認(rèn)為當(dāng)檸檬酸鈉劑量控制在3～4mL之間時(shí)對(duì)納米金的粒徑有影響。

圖3 不同劑量（ml）檸檬酸鈉制備出的納米金結(jié)果圖

3 討論

實(shí)驗(yàn)表明，制備器具的清潔是納米金制備成功的關(guān)鍵[10]。任何細(xì)微的雜質(zhì)都會(huì)影響納米金的粒徑大小。因此，制備納米金的所有玻璃儀器要在制備反應(yīng)前經(jīng)過嚴(yán)格的清洗程序。需經(jīng)王水充分浸泡30min后，再用高純水沖洗3遍，放入干燥箱中干燥30min后，備用。制備納米金所需溶液均現(xiàn)配現(xiàn)用。

研究表明溫度越高生成的納米金顆粒的粒徑越小，速度越快，數(shù)量也越多且均一性較好[11]由于加熱方式的不同導(dǎo)致溫度的不同，納米金顆粒的生成速度也不同。電爐加熱升溫快且溫度高，而水浴鍋加熱則升溫慢溫度低并且水浴鍋所能達(dá)到最高溫度還受當(dāng)?shù)睾０蔚挠绊憽Ｒ虼?，電爐加熱所制得的納米金溶膠相對(duì)水浴鍋制得的濃度高、顏色深、粒徑小、且吸收峰高。

相關(guān)研究表示納米金的吸收峰會(huì)隨其粒徑的增大而發(fā)生紅移；且吸收峰的波長越長則合成的納米金粒徑越大[12]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，該組納米金的透射電鏡圖數(shù)據(jù)與紫外可見光吸光數(shù)據(jù)相矛盾。如果紫外可見光吸光數(shù)據(jù)正確，則此3組的納米金透射粒徑大小必定為PVP和單檸酸均小于檸檬酸鈉。反之若此3組的透射電鏡圖正確，則紫外可見光吸光圖中3組納米金的吸收峰相近或是單寧酸和PVP作為保護(hù)劑值得的納米金相對(duì)于檸檬酸鈉自身作為保護(hù)劑值得的納米金吸收峰出現(xiàn)輕微的紅移現(xiàn)象。由理論來推論，納米金的形成可分為兩個(gè)階段：第一個(gè)階段是納米金的形成過程，第二個(gè)階段是納米金的成長過程[13]。在這3組實(shí)驗(yàn)中保護(hù)劑分別是單寧酸、PVP、檸檬酸鈉，前二者中每組均有兩種保護(hù)劑同時(shí)起到保護(hù)作用，而檸檬酸鈉本生雖可作為保護(hù)劑但其在該實(shí)驗(yàn)中的主要作用則是作為制備納米金的一種試劑。在納米金形成的整個(gè)過程中因?yàn)闄幟仕徕c量是一定的，它在第一階段隨反應(yīng)的進(jìn)行而消耗，但第二階段是就沒有足量的檸檬酸鈉來作為保護(hù)劑控制納米金的形狀及粒徑。而利用單寧酸或PVP來作為保護(hù)劑制備的納米金，雖然在第一階段檸檬酸鈉已消耗殆盡但在第二階段又有新的足量的保護(hù)劑（單寧酸或PVP）加入。新加入的保護(hù)劑的親水性集團(tuán)保證了納米金顆粒良好的分散性，不僅可以阻止納米金顆粒的長大及團(tuán)聚而且還使納米金顆粒有較好的穩(wěn)定性，由PVP或單寧酸為保護(hù)劑制得的納米金顆粒粒徑相對(duì)檸檬酸鈉作為保護(hù)劑制得的納米金小[14]。由此理論推論可知該組實(shí)驗(yàn)的紫外可見光吸光數(shù)據(jù)是正確的，透射電鏡圖中納米金的粒徑應(yīng)為圖2（右2＞左2≥右3）。 圖2（右2）數(shù)據(jù)的錯(cuò)誤可能與納米金溶膠避光保存不良有光。由圖2（左2、右3）的對(duì)比可看出用PVP作為保護(hù)劑制得的納米金比用單寧酸作為保護(hù)劑值得的納米金均一性，穩(wěn)定性更好且納米金外貌近球形。

由于氯金酸的計(jì)量增加會(huì)造成制備出的納米金溶膠出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，減少則會(huì)是金濃度降低。因此本組實(shí)驗(yàn)采用保持氯金酸的計(jì)量不變而逐梯度增加檸檬酸鈉的計(jì)量。從該組納米金的紫外可見吸收特征得知（圖3吸光圖），當(dāng)檸檬酸納計(jì)量在3.0～4.0mL范圍內(nèi)時(shí)，所得納米金溶膠的最大吸收峰均為520nm，納米金的透射電鏡（圖3電鏡圖）顯示該組納米金的粒徑在15～20nm范圍內(nèi)。相關(guān)研究表示納米金的吸收峰會(huì)隨其粒徑的增大而發(fā)生紅移；且吸收峰的波長越長則合成的納米金粒徑越大[11]。此結(jié)論并在納米金透射電鏡圖片中也得以證實(shí)。但不同劑量檸檬酸鈉制備出的納米金粒徑與不同劑量檸檬酸鈉的回歸統(tǒng)計(jì)分析P=0.475,還不能認(rèn)為當(dāng)檸檬酸鈉劑量控制在3～4mL之間時(shí)對(duì)納米金的粒徑有影響，這是由于樣本量太少造成的，可以在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中增加樣本量來證明檸檬酸鈉劑量與納米金粒徑之間的相關(guān)關(guān)系。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過在檸檬酸鈉還原法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，探索了不同因素對(duì)納米金制備質(zhì)量的影響，得出如下結(jié)論。溫度越高生成的納米金顆粒溶膠的粒徑越小，速度越快，濃度越大。以PVP或單寧酸作為保護(hù)劑制備出的納米金粒徑均比以檸檬酸鈉為保護(hù)劑制備出的納米金粒徑小。用單寧酸制備產(chǎn)量高，但是用PVP制出的納米金分散性、均一性、穩(wěn)定性更好。檸檬酸鈉用量為3.4mL時(shí)制備出的納米金溶膠濃度最大,而膠體金粒徑與檸檬酸用量相關(guān)性不顯著。當(dāng)檸檬酸鈉用量控制在 3.0～4.0mL時(shí)，制備出的納米金粒徑均在18±2nm之間。