藍(lán)舌病毒結(jié)構(gòu)與組裝機(jī)制研究進(jìn)展

易華山，趙 瑤，馬鮮平,2，王芝英,2，張德志,2，李前勇,3，左福元,3

(1.西南大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶 402460；3.重慶市肉牛工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

藍(lán)舌病(Blue tongue, BT)是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的、以昆蟲(庫蠓)為傳播媒介的反芻動物的一種非接觸性傳染病，其易感動物為綿羊、山羊、牛和鹿及野生反芻動物，是OIE劃定為A類、我國列為一類的重要動物疫病[1]。藍(lán)舌病毒(Bluetongue virus，BTV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae))環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的雙股RNA (dsRNA)病毒，BTV粒子呈圓形、二十面體對稱，無囊膜，10條分節(jié)段的dsRNA包含19 219個核苷酸，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP2、VP5、VP7、VP3、VP1、VP4和VP6)和5種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3、NS3a和NS4)[1-2]。BTV完整病毒粒子(～550S)外層衣殼由VP2和VP5組成，VP7與VP3構(gòu)成內(nèi)層衣殼，包裹著病毒的10條分節(jié)段的dsRNA和三種具有酶催化活性的VP1、VP4和VP6蛋白組成病毒核心顆粒(470S)[3]。亞核心顆粒是缺失外層衣殼和VP7蛋白層的中間結(jié)構(gòu)，VP3是亞核心顆粒唯一主要結(jié)構(gòu)蛋白，是顆粒裝配的支架；裝配好的亞核心結(jié)構(gòu)必須包被VP7三聚體才能形成成熟的核心顆粒，然后核心顆粒進(jìn)一步被外層蛋白外衣殼層修飾形成成熟的病毒粒子[1,3]。BTV(～550S)感染首先是吸附易感宿主細(xì)胞后較大的VP2蛋白(110 kDa)與某種細(xì)胞表面糖蛋白結(jié)合并促進(jìn)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的病毒內(nèi)吞作用，而具有膜融合作用的VP5蛋白(60 kDa)將470S核心顆粒從細(xì)胞內(nèi)吞體內(nèi)釋放，隨著外層VP2和VP5蛋白的解體，啟動BTV基因組RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白的合成與病毒的組裝[1,3]。

1 BTV顆粒主要的蛋白

1.1 BTV外衣殼VP2和VP5蛋白

利用低溫電子顯微鏡(Cryo-EM)和圖像分析表明，BTV外殼有60個類三角蛋白復(fù)合體(triskelion-like)的VP2纖突(spikes)，圍繞120個膜穿透蛋白VP5的球形三聚體(圖1A)[3-4]。Zhang Xing等[5]以(3.5 ?)近原子分辨率定義了VP2和VP5蛋白的詳細(xì)結(jié)構(gòu)(圖1B，圖2)，以揭示每種蛋白在BTV進(jìn)入細(xì)胞過程中的作用。BTV病毒結(jié)合宿主細(xì)胞表面唾液酸受體的VP2單體分為四個不同的區(qū)域，即中心蛋白質(zhì)(hub)，發(fā)夾(hairpin)，金字塔形體(body)和高度柔性的外部頂點(diǎn)(tip)，VP2也是宿主中和抗體結(jié)合位點(diǎn)[5]。Hub結(jié)構(gòu)域有一個10股血凝素樣β折疊桶，驅(qū)動單體相互作用的三聚體以及具有唾液酸受體結(jié)合的口袋(pocket)[5]。在hub和body結(jié)構(gòu)域的交界面，發(fā)現(xiàn)了典型的鋅指基序CCCH的四面體，負(fù)責(zé)早期內(nèi)吞體(endosome)中pH觸發(fā)的VP2蛋白構(gòu)象的變化[3,5]。Hassan、Forzan等研究表明，膜穿透/融合蛋白VP5三聚體具有高度致密的球狀折疊結(jié)構(gòu)，以α螺旋和位于中心的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)促進(jìn)VP5三聚體的形成，類似于人類免疫缺陷病毒(HIV)gp41膜病毒融合蛋白。每個VP5單體都有三個不同的結(jié)構(gòu)域組成，一個位于核心表面下方裂隙中的柔性匕首結(jié)構(gòu)域(a hidden dagger domains)、一個富含螺旋的伸展結(jié)構(gòu)域(unfurling domains)和一個帶有膜相互作用元件的錨定結(jié)構(gòu)域(anchoring domains)(圖2)[3]。VP5蛋白在病毒粒子中以三聚體形式存在(圖2B)，其中匕首結(jié)構(gòu)域中兩個螺旋結(jié)構(gòu) (α1 and α2)與相鄰的內(nèi)層衣殼VP7蛋白的三聚體發(fā)生相互作用(圖2C)[3]。當(dāng)BTV暴露于早期內(nèi)吞體(Early endosome，pH 6.0～6.5)低pH環(huán)境下,VP5 N端匕首結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化而使其M1-S41基序及WHXL脂質(zhì)作用、W411-L414基序與內(nèi)吞體膜發(fā)生膜融合作用。隨著VP2蛋白的完全拆卸、降解， VP5蛋白的匕首(dagger domain)蛋白和伸展結(jié)構(gòu)域(unfurling domains)可實現(xiàn)顯著重折疊[1,5-6]。VP5蛋白錨定結(jié)構(gòu)域中的β-折疊片(β-meander motif)基序含有組氨酸簇，可感知晚期內(nèi)吞體pH(Late endosome，pH 5.5)以釋放四個假定的膜相互作用蛋白而從晚期內(nèi)吞體內(nèi)釋放，實現(xiàn)具有轉(zhuǎn)錄活性的病毒顆粒進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[3]。研究表明，VP5可利用一種晚期的內(nèi)吞體特異性脂質(zhì)來實現(xiàn)膜的滲透，這一過程類似于某些囊膜病毒，如流感病毒的HA2蛋白，通過晚期內(nèi)吞體而進(jìn)入細(xì)胞，并利用組氨酸殘基作為pH傳感器，隨后在感應(yīng)晚期內(nèi)吞pH后發(fā)生顯著構(gòu)象變化[7-9]。

圖1 低溫電鏡技術(shù)重建BTV病毒

圖2 BTV病毒VP5結(jié)構(gòu)域示意圖

1.2 病毒核心顆粒及其組成部分

1.2.1 BTV VP7與VP3蛋白結(jié)構(gòu) 不同于病毒完整粒子(550S)，對純化的BTV病毒通過蛋白水解可產(chǎn)生非常穩(wěn)定的由VP7、VP3、VP1、VP4、VP6及病毒基因組組成的核心粒子(470S)[3]。研究表明，BTV二十面體核心顆粒的三維(3D)結(jié)構(gòu)顯示三角剖分?jǐn)?shù)為13(T=13)，由260個VP7(38 kDa)三聚體形成，似六元環(huán)排列在132個通道上，五個環(huán)結(jié)構(gòu)排列在頂點(diǎn)；五個準(zhǔn)等價三聚體形成明顯的原體單元，每個三聚體由兩個不同的結(jié)構(gòu)域組成，“上段”(反向β-sandwich)和“下段”(主要是α-螺旋)[3,10]。一種單體的頂部區(qū)域靠近相鄰單體的下部區(qū)域，可使單體之間具有廣泛的相互作用。VP7下部結(jié)構(gòu)域連接到由VP3蛋白(103 kDa)60個二聚體形成的病毒內(nèi)層衣殼，VP3結(jié)構(gòu)層具有T=2對稱性； 每個二聚體由“A”和“B”型構(gòu)象組成，每個構(gòu)象具有三個結(jié)構(gòu)域，剛性“殼”，“頂端”和“二聚化”結(jié)構(gòu)域[3]。 病毒內(nèi)層衣殼的VP3層由12個十聚體通過“二聚化”結(jié)構(gòu)域的互連形成，每個十聚體由五重的“A”型分子與周圍5個頂點(diǎn)的五重“B”型VP3分子組成[10-13]。在三重軸的VP3層中也有一些孔隙，但在完整的核心粒子中，這些孔隙被VP7三聚體完全填塞；在存在Mg2+和NTP的情況下，VP3和VP7在五重軸周圍向外移動，這可能是由于聚合酶復(fù)合物的激活，從而允許VP3層中存在的孔打開而使病毒mRNAs進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行病毒蛋白的合成及病毒基因組的復(fù)制[14]。迄今為止，包括酵母病毒L-A在內(nèi)，大多數(shù)分節(jié)段dsRNA基因組的病毒都含有120個VP3亞基T = 2基本亞單位，這種結(jié)構(gòu)可能是為了基本的生物學(xué)功能而保留的，比如在不同的病毒中保持轉(zhuǎn)錄復(fù)合物和基因組的正確結(jié)構(gòu)[2-3,15]。

1.2.2 病毒三蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(TC)結(jié)構(gòu) 在BTV病毒顆粒內(nèi)層核衣殼內(nèi)部由VP1、VP4和VP6蛋白構(gòu)成病毒三蛋白轉(zhuǎn)錄復(fù)合物(Viral tri-protein transcriptase complex，TC)結(jié)構(gòu)[3]。 VP1 蛋白(150 kDa)由 L1 基因編碼，類似于λ3結(jié)構(gòu)模型， VP1蛋白是BTV病毒依賴的RNA聚合酶(Viral RNA-dependent RNA polymerases，RdRp)具有中心聚合酶、N端和C端結(jié)構(gòu)域[16-17]，具有 RNA 依賴的 RNA 聚合酶活性，以病毒ssRNA為模板合成病毒dsRNA[18]。VP4(78 kDa)蛋白具有mRNA加帽酶活性，在RNA三磷酸酶，鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶和兩種甲基化酶的協(xié)同作用下，催化在核心顆粒內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄物的5'末端形成cap1(m7GPPPNm)結(jié)構(gòu)[19-20]。重組VP4的晶體結(jié)構(gòu)顯示該蛋白呈細(xì)長的沙漏形態(tài)，具有不同的結(jié)構(gòu)域，每個功能結(jié)構(gòu)域依次排列以促進(jìn)酶催化活性[21]。VP6 (36 kDa)是RNA包裝中必不可少的ATP依賴性RNA解旋酶，可促進(jìn)VP1的轉(zhuǎn)錄活性，其高分辨率結(jié)構(gòu)尚不清楚；然而，核磁共振分析揭示了具有兩個大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，其顯示出非常容易與各種大小RNA的分子作用[1,3]。同時，VP6蛋白具有 ATP 結(jié)合活性，依賴 RNA ATP 酶活性和解旋功能，能使 BTV 的雙鏈RNA解螺旋并輔助 mRNA的合成等[1,3]。

2 核心蛋白的組裝途徑

病毒包涵體(Virus inclusion body，VIBs)或病毒蛋白聚集體是BTV和呼腸孤病毒科家族成員的標(biāo)志，是基因組復(fù)制和亞病毒裝配的功能位點(diǎn)[3]。新合成的病毒蛋白與病毒RNA分子相互作用優(yōu)先于病毒衣殼組裝和dsRNA合成[3]。在BTV感染細(xì)胞中， NS1蛋白優(yōu)先促進(jìn)BTV ssRNA的翻譯，促進(jìn)病毒蛋白質(zhì)合成；而NS2形成纖維網(wǎng)絡(luò)狀的VIBs，募集基因組組裝、復(fù)制和核心組裝所需的病毒ssRNA和蛋白質(zhì)組分[1,22-23]。新產(chǎn)生的亞核蛋白(VP1、VP4、VP6和VP3)和10個節(jié)段的RNA轉(zhuǎn)錄物由NS2直接募集到VIBs中，并在VIBs中與VP3組裝成亞核心顆粒，然后再獲得VP7蛋白生成穩(wěn)定的病毒核心粒子。盡管還沒有確定VP3與VP7組裝的確切機(jī)制，但目前的研究表明，NS2與這些組分中的每一種蛋白直接或間接發(fā)生相互作用，特別是與BTV ssRNA的相互作用，具有高度特異性[1,3]。因此，一系列基于RG的研究證明，在BTV復(fù)制的早期階段，NS2促進(jìn)了三種酶蛋白和VP3形成起初的復(fù)制酶復(fù)合物，VP7不直接參與復(fù)制酶復(fù)合物，僅用于穩(wěn)定復(fù)制酶復(fù)合物[24-25]。重組結(jié)構(gòu)蛋白的共表達(dá)能使缺乏RNA基因組的CLPs組裝成為可能，表明這些蛋白具有內(nèi)在的自組裝途徑，該系統(tǒng)使得VP3和VP7組裝過程的更精細(xì)階段得以解析[26-27]。例如，一個缺失VP3二聚化結(jié)構(gòu)域的缺失突變體可以破壞亞核的形成，但卻可以生成VP3的十聚體和二聚體，這說明VP3二聚體形成了一個二聚體中間體的裝配途徑，并且通過二聚化結(jié)構(gòu)域使十聚體與十聚體相互作用而參與整個VP3亞核的裝配[28]。

Sung等[29]應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄/翻譯，無細(xì)胞裝配(CFA)系統(tǒng)進(jìn)一步支持了重組蛋白裝配機(jī)制，首先在體外翻譯BTV聚合酶復(fù)合蛋白，然后與10個ssRNA轉(zhuǎn)錄物一起孵育，然后再依次與VP3和VP7一起孵育，所生成的產(chǎn)物具有完整的10個節(jié)段的ssRNA的BTV核心顆粒；并且添加NTPs和二價陽離子優(yōu)于VP7蛋白產(chǎn)生的BTV核心顆粒，包裝的ssRNA可以充當(dāng)BTV dsRNA合成的模板，而且這種組裝的顆粒在易感細(xì)胞中具有感染性[3]。Sung等[29]研究還表明，VP6對于ssRNA包裝是必需的， VP7為亞核提供穩(wěn)定性，保護(hù)包裝的ssRNA免受RNA酶活性的影響[3,29]。顯然，在沒有非結(jié)構(gòu)蛋白的情況下， BTV結(jié)構(gòu)蛋白和RNA區(qū)段可以組裝形成感染性顆粒[3]。 隨著組裝過程，新合成的核心顆粒從VIBs中釋放，并利用細(xì)胞內(nèi)囊泡分選和胞外途徑來繼續(xù)完成病毒組裝及出芽過程并傳播具有感染性的成熟病毒顆粒[3,30-31]。

3 基因組RNA的組裝與包裝

BTV 10個RNA節(jié)段(3.95 kb～0.8 kb)可分為大、中、小三大類，每個節(jié)段的序列不同，在不同RNA截短可變區(qū)都具有互補(bǔ)的短5`和3`端UTRs及兩端高度保守的六核苷酸，正是通過這些UTRs，BTV和其他相關(guān)病毒開始分類募集各自基因組ssRNA 節(jié)段[32-34]。病毒基因組裝配開始于VP1聚合酶和VP4加帽酶的相互作用，同時VP6六聚體與10個ssRNA復(fù)合物相互作用，它們一起形成聚合酶復(fù)合物，并在五重軸上與VP3十聚體相互作用，隨著12個十聚體形成的亞核心粒子內(nèi)層衣殼的形成及160個VP7三聚體依次沉積而形成BTV二十面體核心顆粒，在核心顆粒的表面再沉積120個VP5蛋白三聚體和60個VP2蛋白的三聚體形成完整的病毒粒子(圖3)[3]。研究表明，復(fù)雜RNA網(wǎng)絡(luò)節(jié)段間相互作用是病毒ssRNA分選、募集、包裝正確基因組區(qū)段的驅(qū)動力，并且從最小ssRNA節(jié)段S10開始按特定節(jié)段的順序募集，引發(fā)RNA-RNA與其他節(jié)段的相互作用以形成起始復(fù)合體；隨后，招募中等至較大的ssRNA，直到將完整的基因組包裝到衣殼中(圖3)[3]。在整個組裝的過程中，每一節(jié)段的組裝信號具有高度的特異性，不僅在UTRs中，在基因編碼區(qū)域中也有高度特異性的序列分布。而且，UTRs，特別是S10 UTRs，負(fù)責(zé)觸發(fā)裝配所需的正確的二級結(jié)構(gòu)；寡核糖核苷酸、ORNs與BTV RNA的3'UTR互補(bǔ)的寡核糖核苷酸等，如果這些RNA網(wǎng)絡(luò)被擾亂，可阻止BTV體外衣殼化并能抑制體內(nèi)病毒的復(fù)制[1,3]。

圖3 BTV粒子各組分時序組裝示意圖[3]

4 內(nèi)外衣殼之間的相互作用

BTV新組裝的核心顆粒必須離開VIBs以獲得兩個外衣殼蛋白(VP2和VP5)并形成成熟的病毒顆粒，因此，核心顆粒及時從VIBs中釋放是病毒粒子成熟過程中必須調(diào)控的一個重要步驟[3]。NS2蛋白通過細(xì)胞磷酸化激酶而磷酸化，通過蛋白構(gòu)象改變，成為核心顆粒從VIBs釋放而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的關(guān)鍵調(diào)控因子[7]。研究表明，BTV VP2和VP5蛋白均可見于VIBs外周區(qū)域而有利于釋放核心顆粒獲得外層衣殼。通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)或體外轉(zhuǎn)錄 - 翻譯系統(tǒng)研究證實，在病毒組裝反應(yīng)中VP2和VP5蛋白與核心顆粒表面蛋白VP7相互作用；并且VP2與VP5可分別與核心顆粒表面獨(dú)立地結(jié)合而直接連接到核心顆粒上[11,35-36]。一旦BTV核心顆粒獲得外層的VP2和VP5蛋白，核心顆粒就不再具有轉(zhuǎn)錄活性，因為在VP7蛋白三角形頂部作為VP2和VP5蛋白沉積的平臺而使VP7頂點(diǎn)處的孔被封閉[4-5]。每個VP2三聚體通過中心蛋白體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)域的基部(具有兩個組氨酸羧基末端)與四個VP7三聚體接觸， VP2發(fā)夾結(jié)構(gòu)域的環(huán)也可以與VP7三聚體的膠凍卷頂部結(jié)構(gòu)域相互作用[3,5]。VP5與VP7之間的相互作用更為廣泛，涉及到VP5的三個結(jié)構(gòu)域[3]。重組表達(dá)研究的結(jié)果進(jìn)一步證實了， VP2與VP5三聚體的N末端螺旋和VP2發(fā)夾環(huán)錨定結(jié)構(gòu)域與VP5三聚體之間的相互作用較弱，這與BTV侵入細(xì)胞期間VP2在內(nèi)吞體低pH環(huán)境下的脫離相一致，也就是VP2解離以VP5的匕首蛋白和伸展結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化而實現(xiàn)[3]。

5 展 望

BTV作為一種重要的dsRNA媒介病毒和病毒研究的模型系統(tǒng)已被廣泛研究，對BTV組裝路徑及其復(fù)制周期深入研究(圖3)[3]，為開發(fā)新的診斷試劑，蛋白質(zhì)和衣殼疫苗以及符合DIVA標(biāo)準(zhǔn)的新型減毒病毒BTV疫苗提供了基礎(chǔ)。雖然BTV基因組前體RNA在衣殼內(nèi)的確切位置及其詳細(xì)的裝配機(jī)制仍不清楚，包裝的RNA的精確位置和TC復(fù)合物在二十面體衣殼中的作用機(jī)制？病毒基因組各節(jié)段的精確篩選募集與精確組裝機(jī)制等? 但是在不久的將來，單粒子低溫電子顯微鏡、低溫層析成像技術(shù)及單分子熒光光譜等將可能解決這些問題，為研究病毒與宿主適應(yīng)性之間的共同機(jī)制，探索新的抗病毒策略，研究新型的具有廣泛活性的抗病毒制劑。