靜脈滴注心房利鈉肽對阿勒泰羊血液生理生化指標(biāo)的影響

陳 勇，韓 冰,2，馬維英，楊 斌

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，新疆維吾爾自治區(qū)動物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011)

利鈉肽 (natriuretic peptides) 家族成員主要包括心房利鈉肽(Atrial natriuretic peptide，ANP)、B-型利鈉肽或腦鈉肽(B-type natriuretic peptide或brain natriuretic peptide，BNP)和C型利鈉肽(C-type natriuretic peptide，CNP)。ANP由心房肌細(xì)胞分泌，通過利鈉利尿、舒張血管、增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性和拮抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的方式調(diào)節(jié)血壓，此外還具有抑制心肌肥大的作用[1]。

ANP與利鈉肽受體A(natriuretic peptide receptor A，NPR-A)結(jié)合通過激活cGMP依賴性蛋白激酶 (cGMP-dependant protein kinase，PKG) 促進(jìn)人脂肪細(xì)胞脂解[2]。一直以來，人們認(rèn)為脂肪的脂解由兒茶酚胺激活cAMP依賴性蛋白激酶 (cAMP-dependant protein kinase，PKA) 途徑介導(dǎo)。由此可見，ANP促脂解的信號通路與兒茶酚胺完全不同。這提示，該途徑可能成為控制人及動物脂肪沉積的一條新途徑。在促脂解作用中，ANP的作用遠(yuǎn)強(qiáng)于其他來源于家族成員[3]，并一度被認(rèn)為是靈長類動物所特有的現(xiàn)象[4]。但有研究發(fā)現(xiàn)，ANP也促進(jìn)嚙齒類動物的脂解[5-6]。綿羊也產(chǎn)生利鈉肽[7-8]。灌注低劑量的BNP，導(dǎo)致綿羊血液中cGMP水平顯著升高[9]。ANP是否影響綿羊脂肪代謝還未見報(bào)道。本研究對綿羊滴注化學(xué)合成的ANP，以觀察ANP對綿羊糖、脂和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)血液生理生化指標(biāo)的影響，為進(jìn)一步闡明ANP在綿羊生理中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ANP的合成

根據(jù)綿羊ANP的氨基酸序列[1]，由生工生物工程(上海)股份有限公司采用化學(xué)法合成并進(jìn)行Cys7和Cys23間二硫鍵修飾。合成的多肽經(jīng)HPLC純化后純度為95.23%。ESI質(zhì)譜檢測表明合成的ANP氨基酸順序與綿羊的ANP相同，分子量為3020.40 Da。ANP經(jīng)冷凍干燥后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)動物與飼養(yǎng)管理

選取11月齡、體重為(57.5±3.3)kg的阿勒泰大尾羊10只。參照舍飼條件下中國肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[10]設(shè)計(jì)飼糧配方，飼糧配方及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)動物單欄飼養(yǎng)，分別于09:00和21:00飼喂精料補(bǔ)充料和粉碎玉米秸稈各0.45 kg。飼喂時先粗后精，自由飲水。

表1 日糧配方及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

注：預(yù)混料為每千克日糧提供：維生素 A1350 IU，維生素 D262.5 IU，維生素 E4500 IU，鐵16 mg，銅8 mg，鋅5 mg，錳10 mg，碘8.5 mg，鈷0.10 mg，硒0.02 mg。

Note: The premix provided the following per kg of the diet: vitamin A1350 IU，vitamin D262.5 IU，vitamin E 4 500 IU，Iron 16 mg，Copper 8 mg，Zinc 5 mg，Manganese 10 mg，Iodine 8.5 mg，Cobalt 0.10 mg，Selenium 0.02 mg.

1.3 ANP靜脈滴注

將ANP用無菌生理鹽水溶解，配制為400 μg/mL的貯存液。試驗(yàn)前稱取綿羊空腹體重，按照25 ng/kg BW/min靜脈滴注45min[11]計(jì)算每只綿羊每天所需ANP的量。吸取相應(yīng)體積的ANP貯存液以無菌生理鹽水稀釋成100 mL工作液備用。貯存液和工作液均當(dāng)日使用當(dāng)日配制。試驗(yàn)采用自身對照試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)第1～4天為對照期，第5～8天為試驗(yàn)期。在對照期，每天晨飼前從右頸靜脈滴注無菌生理鹽水100 mL，控制流速使其在45±5min滴注完畢，滴注開始時即開始晨飼。在試驗(yàn)期，改滴注ANP生理鹽水溶液，其他與對照期相同。

1.4 樣品采集與處理

試驗(yàn)的第2～4天和6～8天分別于滴注前(即0 min)、滴注開始后第15、30、45、60、90和120 min時分別用氟化鈉-草酸鉀真空采血管和肝素鈉真空采血管從左頸靜脈各采集血樣5.0 mL左右。血樣以3 000 r/m離心10 min分離血漿，將血漿儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測定指標(biāo)

氟化鈉-草酸鉀抗凝血漿用于測定血糖(GLU)。肝素鈉抗凝血漿用于測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、游離脂肪酸(FFA)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和尿素氮(BUN)等生理生化指標(biāo)。FFA測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，采用7230G分光光度計(jì)測定。其他試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，采用BS-120全自動生化儀分析測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

靜脈滴注合成ANP對阿勒泰羊血液生理生化指標(biāo)影響的數(shù)據(jù)分析采用GLM模型進(jìn)行單響應(yīng)變量多因素方差分析，數(shù)據(jù)模型為Xijk=μ+αi+βj+γk+αi×βj+εijk。式中：Xijk為觀察值，μ為總體均值，αi(i=1,2)為滴注ANP效應(yīng)，βj(j=1......7)為采樣時間效應(yīng)，γk(k=1......10)為試驗(yàn)動物效應(yīng)，αi×βj為滴注與采樣時間的交互效應(yīng)，εijk為誤差。

靜脈滴注合成ANP后阿勒泰羊血液生理生化指標(biāo)隨時間變化的數(shù)據(jù)是將相同處理、同一時間點(diǎn)3 d的數(shù)據(jù)計(jì)算算術(shù)平均值后采用IBM SPSS 18.0軟件包進(jìn)行配對T檢驗(yàn)，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜脈滴注ANP對阿勒泰羊血液生理生化指標(biāo)的影響

將各時間點(diǎn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行三因素(滴注ANP、采樣時間、試驗(yàn)動物)單響應(yīng)變量方差分析，以明確滴注ANP對阿勒泰羊脂肪、蛋白質(zhì)和糖代謝生理生化指標(biāo)的影響。從表2可以看出，靜脈滴注ANP后，血液中TG水平提高35.71%(P<0.001)，F(xiàn)FA、TC、HDL-C和LDL-水平分別降低25.66%(P<0.001)、12.56%(P<0.001)、17.16%(P<0.001)和16.48%(P<0.001)。

表2 靜脈滴注合成ANP對阿勒泰羊血液生理生化指標(biāo)的影響

注：Trt.處理效應(yīng)；T.采樣時間效應(yīng)；Trt×T.處理與采樣時間的互作相應(yīng)；A.試驗(yàn)動物效應(yīng)。

Notes:Trt. treatment effect;T. sampling time effect;Trt×T. the interaction between treatment and sampling time;A. animal effect.

與滴注生理鹽水相比，靜脈滴注ANP后血糖水平和乳酸脫氫酶的活性分別降低7.83%(P=0.001)和10.37%(P<0.001)。如表2所示，與滴注生理鹽水相比，滴注ANP后，血液中GPT和GOT活性降低10.46%(P=0.001)和14.02%(P<0.001)，但對BUN無顯著影響(P>0.05)。

2.2 靜脈滴注ANP阿勒泰羊血液生理生化指標(biāo)隨時間的變化分析

2.2.1 靜脈滴注ANP對血脂的影響 從圖1可以看出，靜脈滴注ANP后顯著提高0(P<0.01)、15(P<0.05)、45(P<0.05)、60(P<0.05)和120 min(P<0.01)時血液中的甘油三酯水平(P<0.05)，第30 min時甘油三酯有升高的趨勢(P=0.060)。如圖2所示，靜脈滴注ANP后，血液中FFA水平均有不同程度的下降，其中第30(P<0.001)、90(P<0.05)和120 min(P<0.05)時靜脈滴注ANP后顯著降低血液中FFA水平。

從圖3可知，除0min外，滴注ANP具有降低血液TC水平的作用，其中第45(P<0.05)、90(P<0.05)和120 min(P<0.01)時達(dá)到顯著水平。如圖4所示，靜脈滴注ANP后血液中HDL-C水平分別在第30(P<0.05)、45(P<0.01)、60(P<0.05)和90 min(P<0.05)時顯著低于滴注生理鹽水期。

圖1 滴注ANP對血液中TG水平的影響

圖2 滴注ANP對血液中FFA水平的影響

*表示與對照期相比(P<0.05)；**表示與對照期相比(P<0.01)；***表示與對照期相比(P<0.001)。下同。

* means that compared with the control period,(P<0.05); ** means that compared with the control period,(P<0.01);*** means that compared with the control period,(P<0.001).The same below.

從圖5可以看出，與生理鹽水相比，滴注ANP后，第30、45、60、90和120 min時血液中LDL-C水平均顯著低于對照期(P<0.05)。

2.2.2 靜脈滴注ANP對血糖水平的影響 滴注ANP對血糖水平的影響見圖6。如圖6所示，與滴注生理鹽水期相比，滴注ANP的0時血糖水平顯著升高(P<0.01)，之后在60(P<0.05)和90 min(P<0.05)時血糖水平顯著下降。從圖7可以看出，滴注ANP后，第0時血液中LDH活性顯著提高(P<0.01)，之后在30(P<0.05)、45(P<0.05)、90(P<0.05)和120 min(P<0.001)時血液中的LDH活性顯著降低，在第15和60 min時，血液中LDH活性有降低的趨勢(P=0.075)。

圖3 滴注ANP對血液中TC水平的影響

圖4 滴注ANP對血液中HDL-C水平的影響

圖5 滴注ANP對血液中LDL-C水平的影響

Fig.5 Intravenous infusion of ANP on blood LDL-C level

2.2.3 靜脈滴注ANP對蛋白質(zhì)代謝的影響 滴注ANP對血液中GPT活性的影響見圖8。由圖8可知，滴注ANP后在第0和90 min時，血液中GPT分別有升高和降低的趨勢(P=0.082和P=0.091)，在第120 min時，血液中GPT顯著降低(P<0.05)。由圖9可看出，與生理鹽水相比，滴注ANP的0時血液中GOT活性顯著升高，但是在之后各采樣點(diǎn)GOT活性均顯著降低(P<0.05)。

圖6 滴注ANP對血糖水平的影響

圖7 滴注ANP對血液中LDH活性的影響

圖8 滴注ANP對血液中GPT活性的影響

滴注ANP對BUN水平的影響見圖10。由圖10可以看出，在ANP滴注0時，血液中BUN顯著升高(P<0.05)，之后的其他采樣點(diǎn)均無顯著差異。

3 討 論

3.1 ANP對脂肪代謝的影響

除ANP外，利鈉肽還包括BNP、CNP和樹眼鏡蛇利鈉肽(Dendroaspis Natriuretic Peptide，DNP)[1]。利鈉肽通過排鈉利尿以調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡，降低后負(fù)荷，并能舒張血管。在人類中，以心利鈉肽ANP和BNP含量最高[12]。Sengenès等[13]首次發(fā)現(xiàn)利鈉肽家族中的ANP和BNP具有與異丙腎上腺素相似的促進(jìn)人腹脂細(xì)胞脂解的作用，而CNP的促脂解作用最弱。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，利鈉肽家族中DNP的促脂解作用最強(qiáng)，其促脂解強(qiáng)度順序?yàn)镈NP>ANP>BNP>>CNP[3]。由于DNP在人體中的含量較低，因此其在脂解中的作用并沒有ANP重要。

圖9 滴注ANP對血液中GOT活性的影響

圖10 滴注ANP對BUN水平的影響

ANP與細(xì)胞膜上的受體NPR-A結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)第二信使cGMP的產(chǎn)生，繼而活化cGMP依賴性蛋白激酶 (PKG)，PKG使脂滴蛋白(perilipin)和激素敏感脂酶(HSL)磷酸化[3]。綿羊也產(chǎn)生利鈉肽并存在其受體[7-8]，但它們在脂肪細(xì)胞上的分布到目前還未見報(bào)道，滴注ANP是否影響綿羊血液脂肪、蛋白質(zhì)和糖代謝相關(guān)指標(biāo)尚不清楚。

甘油三酯主要在脂肪組織和肝臟中合成。血液中甘油三酯主要來源于食物脂肪的消化吸收和肝臟的合成。機(jī)體乳糜微粒和極低密度脂蛋白將甘油三酯運(yùn)送至肌肉、心臟和脂肪組織加以利用。在本研究中，靜脈滴注ANP后血液甘油三酯水平顯著升高，可能是ANP降低了組織對甘油三酯利用的結(jié)果。甘油三酯在HSL的作用下分解為甘油和FFA，并釋放進(jìn)入血。腎上腺素、去甲腎上腺素和胰高血糖素均可激活HSL。血液中FFA來源于脂肪組織，一般用血漿中脂肪酸的含量來衡量脂肪動員的程度。當(dāng)人靜脈滴注ANP 60 min期間，在滴注15 min后血液中的游離脂肪酸和甘油開始顯著增加，到30 min時甘油水平達(dá)到最大值，45 min時游離脂肪酸水平達(dá)到最大值，在停止滴注20 min后，血液甘油和游離脂肪酸水平恢復(fù)到基線值[14]。在本研究中，靜脈滴注ANP后，F(xiàn)FA顯著下降，是否是加速了細(xì)胞對FFA分解利用的結(jié)果尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖個體中，血液中BNP水平與FFA水平呈負(fù)相關(guān)，Mizuno等[15]認(rèn)為這是由于血液這中高水平的FFA會激活過氧化物酶體增殖物激活受體，進(jìn)而抑制BNP的產(chǎn)生。

3.2 ANP對糖代謝的影響

在本研究中，滴注ANP后血糖水平顯著下降。與僅注射胰島素相比，同時注射胰島素和ANP可使健康成年男性血糖水平從2.0 mmol/L下降到1.3 mmol/L[16]。ANP通過兩種途徑降低血糖水平。一是，抑制胰島素降解。研究發(fā)現(xiàn)，ANP在Ⅱ型糖尿病的發(fā)生中扮演重要角色。當(dāng)血液中ANP降低后，通過激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)增加機(jī)體患糖尿病的風(fēng)險；增加ANP并不增加胰島素的分泌，而是抑制胰島素在肝臟、腎臟和其他器官中的降解[17]。二是，增加細(xì)胞對葡萄糖的攝入。Ruiz-Ojeda等[18]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞在C-ANP4-23的作用下上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體4(glucose transporter 4，GLUT4)、蛋白激酶、磷酸腺苷活化的蛋白激酶基因的表達(dá)，使細(xì)胞攝入葡萄糖的速度增加2倍，細(xì)胞內(nèi)cAMP顯著增加。在本研究中，滴注ANP后，LDH活性顯著下降。這與ANP改變碳水化合物代謝有關(guān)。滴注ANP使骨骼肌中的乳酸增加25%，丙酮酸增加530%，乳酸/丙酮酸比從103降低到24。這種變化可能是由于游離脂肪酸抑制了丙酮酸脫氫酶活性的結(jié)果[19]。骨骼肌中過高的丙酮酸可促進(jìn)糖的分解代謝，過高的乳酸可能抑制乳酸脫氫酶活性。

3.3 ANP對蛋白質(zhì)代謝的影響

ANP對蛋白質(zhì)代謝有何影響尚未見報(bào)道。在本研究中，滴注ANP后，綿羊血液中GOT和GPT活性顯著下降，但BUN無顯著變化，這可能是ANP通過降低轉(zhuǎn)氨酶活性、抑制蛋白質(zhì)分解的結(jié)果。當(dāng)綿羊滴注ANP后，血液中ANP、去甲腎上腺素、皮質(zhì)醇和cGMP顯著提高，促腎上腺皮質(zhì)激素和精氨酸加壓素有少量增加，而醛固酮水平下降[20-21]。眾所周知，兒茶酚胺類激素通過β-腎上腺素能受體和環(huán)磷酸腺苷依賴途徑的介導(dǎo)，抑制骨骼肌中依Ca2+的蛋白質(zhì)降解；同時，去甲腎上腺素可增加蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的沉積增加[22]。

4 結(jié) 論

對綿羊靜脈滴注25 ng/kg BW/min 45 min，可提高血液中甘油三酯濃度，降低游離脂肪酸、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和血糖濃度以及乳酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，但不改變血液中尿素氮濃度。