小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生體系的建立

袁云香

(1.西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院，西北工業(yè)大學(xué)特殊環(huán)境生物物理學(xué)研究所，空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，西安 710072； 2.渭南師范學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，渭南 714099)

小果衛(wèi)矛(Euonymusmicrocarpus(Oliv.) Spraggue)為衛(wèi)矛科(Celastraceae)衛(wèi)矛屬(Euonymus)常綠灌木，為我國(guó)獨(dú)有樹(shù)種，僅分布于少數(shù)幾個(gè)地方如陜西、山西、湖北、四川等地，近年在北京地區(qū)引種成功。小果衛(wèi)矛其葉片革質(zhì)，橢圓形、闊倒卵形或卵形，對(duì)生；其花黃綠色，花期為5～6月，聚傘花序、花瓣近圓形、花盤(pán)方圓；蒴果近長(zhǎng)圓狀，4淺裂，裂片向外平展，果期10～11月；種子棕紅色，長(zhǎng)圓狀，長(zhǎng)約5毫米，外被橘黃色假種皮，極具觀賞價(jià)值。此外，小果衛(wèi)矛還具有藥用價(jià)值，其根、莖具有祛風(fēng)濕，強(qiáng)筋骨之功效，可用于風(fēng)濕痹痛，筋骨痿軟[1～3]。

由于自然地理位置及氣候條件的原因，我國(guó)北方地區(qū)常綠樹(shù)種主要是針葉類的松柏科植物、女貞及大葉黃楊等少數(shù)的闊葉植物，缺少常綠、耐寒闊葉喬木和灌木樹(shù)種。王永格等研究發(fā)現(xiàn)小果衛(wèi)矛抗寒性高于大葉黃楊、膠東衛(wèi)矛和女貞[4]，因此小果衛(wèi)矛是極具開(kāi)發(fā)潛力的、適宜北方地區(qū)引種栽培的常綠觀賞植物。關(guān)于小果衛(wèi)矛的研究大部分集中在分布、生態(tài)習(xí)性、生物活性等方面，何云研究了小果衛(wèi)矛的內(nèi)生真菌[5]；張雙進(jìn)等對(duì)小果衛(wèi)矛扦插生根進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其扦插生根較難[6]；王永格等研究了小果衛(wèi)矛的抗寒性，發(fā)現(xiàn)小果衛(wèi)矛抗寒力大于女貞和大葉黃楊[4]；秦浩等調(diào)查發(fā)現(xiàn)小果衛(wèi)矛目前為山西天然分布衛(wèi)矛屬植物中的唯一常綠植物[7]。而對(duì)小果衛(wèi)矛的繁殖技術(shù)的研究主要以種子繁殖和常規(guī)扦插、嫁接為主，但由于小果衛(wèi)矛種子繁殖效率低，常規(guī)的扦插繁殖較難生根，致使其規(guī)模繁殖受限，因此限制了小果衛(wèi)矛的開(kāi)發(fā)與利用。組織培養(yǎng)具有不受生長(zhǎng)季節(jié)限制、繁殖快等優(yōu)點(diǎn)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量無(wú)性系。目前，關(guān)于衛(wèi)矛屬其他植物的組織培養(yǎng)已有報(bào)道，袁云香等[8]建立了陜西衛(wèi)矛高效再生體系；樊祥義等[9]對(duì)金葉桃葉衛(wèi)矛進(jìn)行了初步組織培養(yǎng)；趙麗蒙等[10]對(duì)衛(wèi)矛進(jìn)行了不定芽誘導(dǎo)。而關(guān)于小果衛(wèi)矛組織培養(yǎng)尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以小果衛(wèi)矛嫩莖為外植體，研究不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、再分化及生根的影響，建立小果衛(wèi)矛再生體系，以期為小果衛(wèi)矛的快速繁殖提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料小果衛(wèi)矛(E.microcarpus(Oliv.) Spraggue)采自陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)校內(nèi)，剪取當(dāng)年生顏色淡綠、無(wú)病蟲(chóng)害嫩莖為外植體，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 方法

1.2.1 外植體滅菌

將小果衛(wèi)矛嫩莖放置于燒杯內(nèi)，用軟毛刷蘸洗潔精輕輕將莖表面臟物洗凈，于流水下沖洗1～2 h后，轉(zhuǎn)自超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行外植體消毒處理。采用75%酒精和0.1%升汞溶液配比，75%酒精處理時(shí)間分別設(shè)為10、20和30 s，0.1%升汞溶液設(shè)置為10、15和20 min。設(shè)置9種消毒組合進(jìn)行浸泡處理。消毒完后用無(wú)菌水沖洗5～7次，將莖段表面的水分用無(wú)菌濾紙吸干，在培養(yǎng)皿中將嫩莖剪成2.0～3.0 cm長(zhǎng)的小段作為外植體，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。接種2周后統(tǒng)計(jì)污染率，每個(gè)三角瓶接種外植體4塊，15瓶共60個(gè)外植體，每組處理重復(fù)3次。

1.2.2 小果衛(wèi)矛愈傷組織的誘導(dǎo)

小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)按照正交設(shè)計(jì)L9(34)，采用3個(gè)因素分別是3種基本培養(yǎng)基(MS、WPM和B5)、6-BA(1、2、3 mg·L-1)和2,4-D(1、2、3 mg·L-1)，每個(gè)因素3水平，共9個(gè)處理組合。于接種40 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，并記錄愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.3 小果衛(wèi)矛愈傷組織的再分化

切取質(zhì)地較致密、顏色淡黃的胚性愈傷組織，接種到含有不同濃度6-BA和NAA的MS分化培養(yǎng)基上，每個(gè)分化處理接種15瓶，每瓶接種4塊愈傷組織。每個(gè)試驗(yàn)處理重復(fù)3次。密切觀察并記錄愈傷組織的再分化狀態(tài)，于35 d后統(tǒng)計(jì)再分化率。

1.2.4 小果衛(wèi)矛生根培養(yǎng)

當(dāng)小苗生長(zhǎng)至2～4 cm時(shí)，分離單株轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。1/2MS培養(yǎng)基中含有不同濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0和2.5 mg·L-1)的NAA。于35 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)及生根率，密切觀察生根情況并做好記錄。每個(gè)處理接種10瓶，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

上述培養(yǎng)基中均添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂8 g·L-1、pH為5.8～6.0。組培材料置于光照強(qiáng)度25～35 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間14 h·d-1，培養(yǎng)溫度(25±2)℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理及分析

污染率(%)=污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%

(1)

存活率(%)=存活的外植體數(shù)/接種的外植總體數(shù)×100%

(2)

愈傷組織誘導(dǎo)率(%)=出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%

(3)

再分化率(%)=再生出苗的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù)×100%

(4)

生根率(%)=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%

(5)

運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性分析和Duncan多重對(duì)比。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同滅菌處理對(duì)小果衛(wèi)矛外植體染菌率的影響

外植體滅菌效果是直接影響組織培養(yǎng)成敗的重要因素，不同的消毒方法、消毒劑和消毒時(shí)間對(duì)外植體的污染率和存活率的影響差異較大。單獨(dú)使用一種消毒劑，污染率較高。因此，試驗(yàn)采用75%酒精和0.1% HgCl2聯(lián)合處理小果衛(wèi)矛莖段，不同滅菌時(shí)間組合對(duì)外植體的影響不同(見(jiàn)表1)。污染率隨著滅菌處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，但存活率卻呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。75%酒精處理30 s和0.1% HgCl2處理20 min(編號(hào)10號(hào))，污染率最低，為0.933%，存活率僅為81.33%，但莖段表面有一定程度的褐化，尤其是切口端脫水明顯。75%酒精處理30 s和0.1% HgCl2處理15 min，存活率最高，為92.33%，莖段受損程度較輕。HgCl2處理時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)外植體的損失越大。綜合分析試驗(yàn)結(jié)果，75%酒精處理30 s和0.1% HgCl2處理15 min，存活率最高，污染率相對(duì)較低，因此，對(duì)于小果衛(wèi)矛莖段來(lái)說(shuō)，最佳的滅菌處理組合為75%酒精30 s，0.1% HgCl215 min(編號(hào)9號(hào))。

表1 不同滅菌組合對(duì)外植體污染率的影響

Table 1 Effect of different sterilization combinations on contamination rates of explants

編號(hào)No.75%酒精75% of alcohol(s)0.1% HgCl2(min)污染率Pollution rate(%)存活率Survival rate(%)1101094.33±2.33g0.33±0.33a2101574.67±1.76f20.00±0.58b3102071.33±0.88f21.67±1.20b4201063.00±2.08e32.33±1.45c5201552.33±0.88d46.33±1.20d6202035.00±1.73c59.33±2.33e7301014.00±2.31b83.67±0.88f830152.00±0.58a92.33±1.20g930200.933±0.18a81.33±1.45f

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05) 下同

Note:The different lowercase letters in the same column indicated the significant difference at 0.05 The same as below

2.2 不同因素對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)的影響

小果衛(wèi)矛莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d左右，莖段基部接近培養(yǎng)基的切口處表現(xiàn)為肥大，顏色變淡，21 d左右切口處有膨大的愈傷組織現(xiàn)象，顏色淡白色，40 d后愈傷組織體積增大，顏色變?yōu)榈S色、小顆粒狀(見(jiàn)圖1:A～B)。不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織的發(fā)生和生長(zhǎng)狀態(tài)影響不同。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同因素對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Table 2 Effects of different actors on callus induction ofE.microcarpus(Oliv.) Spraggue

編號(hào)No.A培養(yǎng)基MediumB6-BA(mg·L-1)C2,4-D(mg·L-1)誘導(dǎo)率Induction rate(%)1MS11.041.90±0.68a2MS22.055.30±2.06b3MS33.079.00±0.58d4WPM12.039.00±1.73a5WPM23.051.50±1.04be6WPM31.075.50±2.12cd7B513.037.60±1.37a8B521.052.30±0.95bd9B532.073.20±1.74c

表3 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的方差分析

方差分析發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表3)，小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)率在3個(gè)因素間差異明顯，6-BA和不同培養(yǎng)基對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)率的影響達(dá)到極顯著水平(P<0.01)；2,4-D對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)率的影響差異不顯著(P>0.05)。

多重比較發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)表4)，基本培養(yǎng)基不同類型對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)影響最大的是水平1(MS培養(yǎng)基)，與水平2(WPM培養(yǎng)基)和3(B5培養(yǎng)基)呈極顯著差異(P<0.01)，其均值高于其他兩個(gè)水平；6-BA的3個(gè)水平間在小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)率上的影響均具有顯著差異(P<0.05)，6-BA水平3(3.0 mg·L-1)、水平2(2.0 mg·L-1)與水平1(1.0 mg·L-1)差異極顯著(P<0.01)，說(shuō)明6-BA不同濃度對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)影響很大。2,4-D各水平間影響差異不顯著，但具有協(xié)同作用，因此其濃度選擇最低的水平為適宜。綜上，通過(guò)分析平均值可得出，小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基組合為A1B3C1，即MS+3.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-12,4-D。

表4 不同因素對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)影響的多重比較

Table 4 Multiple comparisons of effects of different actors on callus induction ofE.microcarpus(Oliv.) Spraggue

FactorsLevelsMean0.05 level0.01 level培養(yǎng)基Medium158.73aA255.33bB354.37bB6-BA375.9aA253.05bAB139.5cB

注：同列不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(0.05水平)；不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(0.01水平)

Note: The different lowercase letters in the same column indicated the significant difference at 0.05;The different uppercase letters in the same column indicated the significant difference at 0.01

表5 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織再分化率的影響

Table 5 Effects of different plant growth regulators on the regeneration rate ofE.microcarpus(Oliv.) Spraggue

編號(hào)No.6-BA(mg·L-1)NAA(mg·L-1)再分化率Regeneration rate(%)10.00.0021.00.012.50±0.29c31.50.041.10±0.59d42.00.041.67±0.26d52.50.045.27±1.78e60.00.23.80±1.53b71.00.212.73±0.43c81.50.241.83±0.09d92.00.278.83±0.43i102.50.252.57±0.30g110.00.54.13±0.88b121.00.512.93±0.18c131.50.541.37±0.20d142.00.564.93±0.52h152.50.549.73±0.37f

2.3 不同6-BA和NAA配比對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織再分化的影響

將生長(zhǎng)良好、顆粒狀愈傷組織切成小塊，接種到不同的分化培養(yǎng)基上。小果衛(wèi)矛愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基7 d左右，愈傷組織顏色由淡黃色逐漸轉(zhuǎn)為淡黃綠，體積也增大(見(jiàn)圖1:C～D)；在培養(yǎng)14 d左右時(shí)，愈傷組織顆粒狀突起更明顯，顏色變?yōu)樯罹G色，體積增大明顯；部分愈傷組織出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的小綠芽點(diǎn)(見(jiàn)圖1:E)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，綠芽點(diǎn)數(shù)量也逐漸增多，芽點(diǎn)進(jìn)一步分化為芽叢，35 d左右愈傷組織分化出再生植株(見(jiàn)圖1:F～G)。

不同種類及不同濃度組合的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是影響植物再分化的重要因素。試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同濃度6-BA和NAA組合對(duì)小果衛(wèi)矛愈傷組織的再分化影響不同。由表5可知，當(dāng)分化培養(yǎng)基中未添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)時(shí)，未見(jiàn)有愈傷組織分化。在只附加NAA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，愈傷組織出現(xiàn)分化，但分化率較低，僅為3.80%，只添加1.0 mg·L-16-BA時(shí)，愈傷組織分化率為12.50%；隨著NAA和6-BA濃度的升高，愈傷組織分化率也分別隨之升高。

在同時(shí)添加6-BA與NAA的組合中，在相同濃度NAA水平下，再分化率隨6-BA濃度的遞增而呈拋物線狀變化，6-BA濃度在1.0～2.0 mg·L-1范圍內(nèi)，分化率逐漸升高；以濃度2.0 mg·L-16-BA時(shí)分化率最高，為78.83%，當(dāng)6-BA濃度提高到2.5 mg·L-1時(shí)，分化率則略有下降，由此可見(jiàn)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素配比使用更有利于再分化。綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，適宜小果衛(wèi)矛莖段愈傷組織再分化的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1，分化率最高，達(dá)到78.83%，不定芽生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)較好。

2.4 不同濃度NAA對(duì)小果衛(wèi)矛生根的影響

將小果衛(wèi)矛分化出的小苗與愈傷組織分離出來(lái)，接種到含有不同濃度NAA的生根培養(yǎng)基中，在第15天時(shí)部分小苗基部開(kāi)始膨大，20 d左右開(kāi)始出現(xiàn)白色不定根，培養(yǎng)35 d時(shí)小苗根長(zhǎng)至3 cm左右，根系較粗，小苗生勢(shì)良好(見(jiàn)圖1:H)。

表6 不同濃度NAA對(duì)小果衛(wèi)矛生根的影響

Table 5 Effects of different NAA on differentiation of rooting stems ofE.microcarpus(Oliv.) Spraggue

編號(hào)No.NAA(mg·L-1)生根率Rooting rate(%)10020.236.33±0.20b30.438.00±0.57b40.647.00±1.15d50.866.00±1.00e6183.23±0.62g71.275.27±0.37f81.575.63±0.32f9264.17±0.44e102.542.00±1.15c

圖1 小果衛(wèi)矛莖段愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生 A.外植體接種；B.培養(yǎng)40 d后的形成愈傷組織；C.分化培養(yǎng)7 d的淡黃綠愈傷組織；D.分化培養(yǎng)14 d的綠色愈傷組織；E.分化培養(yǎng)21 d的小綠芽；F～G.分化培養(yǎng)35 d的再生植株；H.生根培養(yǎng)35 d的不定根Fig.1 Callus induction and shoot regeneration from stems of E.microcarpus(Oliv.) Spraggue A.Explants inoculated; B.Callus inducted culture for 40 d; C.Light yellowish green callus differentiation culture after 7 d; D.Green callus of differentiation culture after 14 d; E.Green sprouts after 21 d differentiation culture; F-G.Regenerated plantlets after 35 d differentiation culture; H.Rooting of plantlets for 35 d

由表6可知，在未添加NAA的培養(yǎng)基中，未見(jiàn)小苗生根現(xiàn)象，僅表現(xiàn)為小苗莖段延長(zhǎng)及葉片增大。當(dāng)NAA的濃度范圍為0.2～1.0 mg·L-1時(shí)，生根率呈上升趨勢(shì)，NAA 1.0 mg·L-1時(shí)，生根率最高，為83.23%；而NAA濃度在1.2～2.5 mg·L-1范圍內(nèi)時(shí)，生根率有逐漸下降趨勢(shì)，且根系較細(xì)弱，主側(cè)根不明，植株矮小，長(zhǎng)勢(shì)差。因此，最佳小果衛(wèi)矛愈傷組織再生植株生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 1.2 mg·L-1，生根率為83.23%，生長(zhǎng)狀態(tài)好，主根明顯，植株生長(zhǎng)快且健壯，移栽成活率高。

3 討論

外植體消毒是小果衛(wèi)矛再生體系建立的重要環(huán)節(jié)，選擇不同消毒劑的種類、采取不同的消毒時(shí)間顯得尤為重要。張麗杰等[11]在研究桃葉衛(wèi)矛的組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，7%酒精浸泡30 s后再用0.1%升汞浸泡10 min消毒效果好。周魏等[12]在雙歧衛(wèi)矛的組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)莖段最佳消毒方法為70%酒精15 s，0.1%升汞8 min。本試驗(yàn)采用75%酒精消毒30 s后再用0.1%升汞消毒12 min，二者聯(lián)合使用效果最好，污染率為2%。

在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中，不同基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的不同濃度與不同種類的配比，愈傷組織誘導(dǎo)率也不同?；九囵B(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)，植物的遺傳背景不同及生物學(xué)特性各異，對(duì)各類營(yíng)養(yǎng)成分的需求也有差異。本試驗(yàn)選用了3種(MS、WPM和B5)基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA和2,4-D，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小果衛(wèi)矛適宜愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基為MS，可能是由于MS培養(yǎng)基中鉀鹽、銨鹽、硝酸鹽等無(wú)機(jī)鹽濃度較WPM和B5高，更適宜小果衛(wèi)矛莖段誘導(dǎo)愈傷組織，這與趙麗蒙等研究衛(wèi)矛組織培養(yǎng)的結(jié)果較一致[10]。小果衛(wèi)矛愈傷組織誘導(dǎo)率主要受到6-BA濃度的影響，在一定范圍內(nèi)，誘導(dǎo)率隨6-BA濃度的升高而升高，且誘導(dǎo)出的愈傷組織在之后的再分化過(guò)程中更容易再分化出芽點(diǎn)，這與余慧等[13]研究歐洲衛(wèi)矛組織培養(yǎng)的研究結(jié)果相似。

植物所需植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度，在不同培養(yǎng)階段是不同的，二者以適宜濃度配比使用有利于再生植株的生長(zhǎng)發(fā)育，濃度過(guò)高或過(guò)低，都會(huì)影響再生植株發(fā)生及長(zhǎng)勢(shì)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，小果衛(wèi)矛愈傷組織再分化過(guò)程中聯(lián)合使用細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素比單獨(dú)用一種更有利于愈傷組織分化。較高濃度的6-BA與適宜濃度NAA有助于小果衛(wèi)矛愈傷組織再分化，而NAA濃度過(guò)高對(duì)再分化不利。本試驗(yàn)建立了小果衛(wèi)矛愈傷組織植株再生體系，這為解決小果衛(wèi)矛野生資源匱乏打下基礎(chǔ)，對(duì)種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與利用等后續(xù)的研究具有重要意義。