毛果楊固有無序蛋白質(zhì)基因克隆及脅迫響應(yīng)分析

董實(shí)偉 楊宇寧 王乃銳 張含國(guó) 李淑娟

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

毛果楊(Populustrichocarpa)別名測(cè)序楊為楊屬青楊派植物，其中Nisqually-1基因型(雌株)是第一個(gè)有完整基因組注釋的木本植物，2006年其測(cè)序結(jié)果已公布[1]。Nisqually-1的組織培養(yǎng)技術(shù)已被廣泛使用，并已建立完整高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系[2]，因此毛果楊已成為研究樹木生物學(xué)、比較基因組學(xué)和環(huán)境互作組學(xué)系統(tǒng)的模式物種[3]。

固有無序蛋白質(zhì)(Intrinsically disordered proteins)簡(jiǎn)寫為IDPs，是一類在天然狀態(tài)下整體或局部不折疊，缺乏穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)，但能夠正常行使生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)[4]，它普遍存在于蛋白質(zhì)組中，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、脅迫應(yīng)答等一系列生物學(xué)過程[5]。固有無序蛋白質(zhì)和有序蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成上有明顯不同，主要體現(xiàn)在氨基酸的組成及理化性質(zhì)等方面的差異[6～7]。例如，有些殘基有利于形成穩(wěn)定的疏水中心進(jìn)而折疊形成有序結(jié)構(gòu)，這些氨基酸被稱為“促有序”氨基酸；與之相反，某些殘基阻礙蛋白質(zhì)分子形成穩(wěn)定的疏水核心和后續(xù)的折疊，無序結(jié)構(gòu)中極性和帶電的氨基酸被稱之為“促無序”殘基[8～9]。另外，IDPs中氨基酸序列的復(fù)雜度較低，重復(fù)度較高，因此，IDPs的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)一種松散的狀態(tài)，高度動(dòng)態(tài)可變[10～11]。在發(fā)現(xiàn)初期許多固有無序蛋白質(zhì)被認(rèn)為并沒有什么功能，直到20世紀(jì)初證實(shí)了近100種蛋白質(zhì)是固有無序蛋白質(zhì)，無序蛋白質(zhì)才成為研究領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)[12]。Du等通過鹽脅迫對(duì)擬南芥中的ST6-66和ST255基因分離及耐鹽性分析，發(fā)現(xiàn)At1G13930基因敲除突變體對(duì)鹽脅迫超敏感[13]，Rocco等利用低溫4℃和高溫42℃對(duì)擬南芥進(jìn)行處理，從而鑒定出38個(gè)蛋白差異位點(diǎn)，其中At1G13930蛋白在低溫和高溫處理時(shí)，與其他蛋白點(diǎn)相比較變化最大，研究表明At1G13930蛋白在溫度脅迫中可能起著至關(guān)重要的作用[14]。其他研究也證實(shí)植物中許多逆境響應(yīng)蛋白均是固有無序蛋白質(zhì)[15～17]。

為深入了解毛果楊固有無序蛋白質(zhì)的功能，本研究以毛果楊野生型植株為材料，克隆并獲得PtrIDP1(Potri.010G161200.1)的cDNA全長(zhǎng)序列，采用生物信息學(xué)方法對(duì)其序列特征及編碼蛋白結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，同時(shí)對(duì)該基因在毛果楊不同組織中的表達(dá)特異性及不同類型非生物脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行分析，旨在為后續(xù)探究該基因的功能及其在毛果楊生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及主要試劑

試驗(yàn)材料：供試植物-Nisqually-1基因型的毛果楊野生型組培苗，在林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))溫室培養(yǎng)，室內(nèi)溫度25±2℃。光照強(qiáng)度為80 μmol·m-2·s-1)，長(zhǎng)日照培養(yǎng)。

主要試劑：cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于百泰克公司；PCR酶KOD FX購于東洋紡(上海)生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒等購于天根公司；限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購于賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 毛果楊總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致、苗齡30 d的毛果楊組培苗全株，經(jīng)無菌水洗凈后，液氮研磨成粉末，采用CTAB法提取植株總RNA，用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，用1%瓊脂糖凝聚膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。以上述得到的RNA為模板，根據(jù)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明進(jìn)行試驗(yàn)，合成cDNA第一鏈，于-20℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及目的基因克隆

從Phytozome數(shù)據(jù)庫中獲取毛果楊PtrIDP1基因的全長(zhǎng)序列，采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物(見表1)，引物由哈爾濱市擎科嘉美生物科技有限公司合成。以cDNA為模板，利用KOD-FX PCR酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：ddH2O 10 μL，2x PCR buffer for KOD FX 25 μL，2 mmol·L-1dNTPs 10 μL，上下游引物各1.5 μL，模板cDNA 1 μL，KOD FX 1 μL。擴(kuò)增條件：94℃，2 min；98℃，10 s，58℃，30 s，68℃，30 s，35個(gè)循環(huán)；68℃，10 min；16℃保溫。1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)目的片段進(jìn)行回收，將回收產(chǎn)物與pROK-Ⅱ載體連接，并轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，將條帶位置正確的菌株送至生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

表1 引物序列

1.2.3 PtrIDP1基因的生物信息學(xué)分析

使用在線工具CLUSTALW將獲得的核苷酸和氨基酸序列與NCBI中已登錄的12種植物序列進(jìn)行比對(duì)和同源性分析，結(jié)合MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并對(duì)蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、跨膜區(qū)預(yù)測(cè)、親水性疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)分析(見表2)。

表2 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站及軟件

Table 2 Softwares and websites for bioinformatics analysis

功能Function軟件及網(wǎng)址Softwareandwebsite蛋白質(zhì)理化性質(zhì)Physicochemicalpropertiesofproteinhttp://web.expasy.org/protparam/跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Transmembraneregionanalysishttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM親水性疏水性預(yù)測(cè)Pro/hydrophobicanalysishttps://web.expasy.org/protscale/蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Secondarystructureofproteinhttps://npsa-prabi.ibcp.fr/蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Tertiarystructureofproteinhttps://www.swissmodel.expasy.org/同源多序列比對(duì)Homologousmultiplesequencealignmenthttps://www.genome.jp/tools-bin/clustalw系統(tǒng)進(jìn)化樹PhylogenetictreeMEGA5.0

1.2.4 PtrIDP1蛋白亞細(xì)胞定位

為了研究PtrIDP1蛋白的亞細(xì)胞定位，克隆無終止密碼子的全長(zhǎng)PtrIDP1 CDs序列，將其連接到pGWB5載體上，構(gòu)建35s::PtrIDP1-GFP融合表達(dá)載體，35s::GFP用作對(duì)照，利用基因槍轉(zhuǎn)化法，分別將35s::GFP與35s::PtrIDP1-GFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)36～48 h后利用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)拍照。

1.2.5 PtrIDP1基因的組織特異性表達(dá)檢測(cè)

根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異定量引物，以PtrActin為內(nèi)參設(shè)計(jì)引物actin-F及actin-R(見表1)，進(jìn)行QRT-PCR分析。體系如下：2×TransStart? TOP/Tip Green qPCR Supermix 10 μL、PtrIDP1-QF/QR混合引物(10.0 μmol·L-1)0.4 μL、cDNA 1.5 μL，Passive Reference Dye(50×)0.4 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 35 s，40次循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。每個(gè)樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，利用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.6PtrIDP1基因在不同類型非生物脅迫下的表達(dá)特性分析

選取30 d苗齡長(zhǎng)勢(shì)一致的毛果楊植株分別進(jìn)行鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl溶液)和干旱脅迫(40%的PEG溶液)處理，并分別于處理0、6、12、24、48、72 h后進(jìn)行取材。以野生型毛果楊的根、莖和葉為材料提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，以PtrIDP1-QF/QR為引物，PtrActin為內(nèi)參，試驗(yàn)重復(fù)3次，對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行qRT-PCR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PtrIDP1基因克隆

提取的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28s RNA、18s RNA條帶明顯，5s RNA條帶呈微弱彌散狀(見圖1A)，結(jié)果表明提取的總RNA質(zhì)量完好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

以毛果楊的cDNA為模板，采用特異性引物對(duì)PtrIDP1基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝聚膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示與預(yù)期目的片段423 bp大小基本一致(見圖1B)，條帶清晰且無明顯拖尾。將菌液送至生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，結(jié)果表明：該基因克隆成功，命名為PtrIDP1，可以進(jìn)行后續(xù)操作。

圖1 毛果楊總RNA(A)和擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖(B)Fig.1 The electrophoresis of Total RNA in P.trichocarpa(A) and PCR production of PtrIDP1(B)

2.2 PtrIDP1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過ExPAsy分析顯示，毛果楊PtrIDP1基因蛋白分子式為C630H1009N179O217S3，完整的CDs區(qū)序列長(zhǎng)度為423 bp，共編碼140個(gè)氨基酸(見圖2)。預(yù)測(cè)其蛋白分子量為14.659 19 kD，理論等電點(diǎn)(pI)為5.58，脂溶指數(shù)為58.71，總平均親水系數(shù)為-0.716，不穩(wěn)定系數(shù)為29.60，說明該蛋白為穩(wěn)定的酸性親水蛋白(見圖3)，對(duì)PtrIDP1跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果表明PtrIDP1基因所編碼的蛋白質(zhì)具有跨膜結(jié)構(gòu)域，為跨膜蛋白(見圖4)。

圖2 PtrIDP1基因序列及氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and amino acid sequences of PtrIDP1

圖3 PtrIDP1蛋白的親/疏水性分析預(yù)測(cè)Fig.3 Pro/hydrophobic analysis of PtrIDP1 protein

圖4 PtrIDP1蛋白的跨膜區(qū)域分析預(yù)測(cè)Fig.4 Transmembrane region Analysis of PtrIDP1 protein

圖5 PtrIDP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of secondary structure of PtrIDP1 protein

2.2.2 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

采用在線軟件SOPMA對(duì)毛果楊PtrIDP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包含α-螺旋65個(gè)，占46.43%，β-折疊2個(gè)，占1.43%，無規(guī)則卷曲73個(gè)，占52.14%(見圖5)。

VL-XT預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在PtrIDP1的蛋白質(zhì)中存在3個(gè)無序區(qū)，無序氨基酸殘基共78個(gè)，分別是1-26、38-52、88-124位氨基酸組成，這些氨基酸的score>0.5。PtrIDP1蛋白的全序列中有3個(gè)區(qū)中氨基酸的組成趨向于形成有序結(jié)構(gòu)(1,2,3)，這3個(gè)區(qū)域可能是無序蛋白中的有序結(jié)合位點(diǎn)。PtrIDP1蛋白質(zhì)具有無序特征(見圖6)。

圖6 PtrIDP1蛋白質(zhì)無序預(yù)測(cè)Fig.6 Disorder prediction of PtrIDP1 protein

圖7 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) A,D.蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)正面圖；B,E.蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)側(cè)面圖；C,F.三級(jí)結(jié)構(gòu)背面圖Fig.7 Prediction of tertiary structure of PtrIDP1 protein A,D.Represent the front view of the protein tertiary structure; B,E.Represent the side view of the protein tertiary structure; C,F.Represent the rear view of the protein tertiary structure

圖8 不同植物PtrIDP1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.8 Phylogenetic analysis of PtrIDP1 from different plants

圖9 PtrIDP1蛋白的亞細(xì)胞定位 A～B,E～F.35s::GFP對(duì)照；C～D,G～H.35s::PtrDP1-GFP融合蛋白Fig.9 Subcellular location of PtrIDP1 protein A-B,E-F.35s::GFP ontrol；C-D,G-H.35s::PtrDP1-GFP fusion protein

2.2.3 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用SWISS-MODEL工具，運(yùn)用同源建模法對(duì)PtrIDP1基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模，由于無序蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，所以預(yù)測(cè)結(jié)果顯示兩種不同的構(gòu)象(見圖7)。

2.2.4 基因的同源性分析及進(jìn)化樹分析

利用MEGA5軟件構(gòu)建該蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(見圖8)，結(jié)果顯示，在候選的12種不同植物中，毛果楊與胡楊親緣關(guān)系較近。

2.3 PtrIDP1蛋白亞細(xì)胞定位

利用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照結(jié)果顯示：對(duì)照35s::GFP在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均檢測(cè)到GFP熒光信號(hào)，而35s::PtrIDP1-GFP融合蛋白僅在細(xì)胞核中檢測(cè)到GFP信號(hào)，且與細(xì)胞核特異性染料DAPI染色位置一致(見圖9)。上述結(jié)果表明PtrIPD1定位于細(xì)胞核。

2.4 基因的表達(dá)特性

以毛果楊根、莖、葉分別為模板，通過qRT-PCR檢測(cè)分析PtrIDP1在毛果楊不同部位的相對(duì)表達(dá)量(見圖10)。結(jié)果顯示，PtrIDP1在葉片和莖中高度表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量是根部表達(dá)量的27倍。

圖10 PtrIDP1基因組織特異性表達(dá)分析Fig.10 Tissue specific expression analysis of PtrIDP1

圖11 NaCl脅迫處理下PtrIDP1在毛果楊根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量Fig.11 Relative expression of PtrIDP1 in root,stem and leaf of P.trichocarpa under NaCl stress(**P<0.01)

圖12 PEG脅迫處理下PtrIDP1在毛果楊根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量Fig.12 Relative expression of PtrIDP1 in root,stem and leaf of P.trichocarpa under PEG stress(**P<0.01)

為分析毛果楊PtrIDP1對(duì)非生物脅迫的表達(dá)模式，我們分別對(duì)200 mmol·L-1NaCl和40% PEG-6000兩種逆境脅迫條件下毛果楊根、莖、葉組織中該基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析。在NaCl脅迫處理后，毛果楊根中PtrIDP1基因表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在6 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，是對(duì)照的2.4倍；莖中PtrIDP1基因在所有時(shí)間點(diǎn)均為下調(diào)表達(dá)，在48 h表達(dá)量最低，是對(duì)照的0.1倍；葉中該基因表達(dá)量在0～24 h內(nèi)基本持平，然后出現(xiàn)迅速降低、再升高的趨勢(shì)，72 h時(shí)達(dá)到最高(見圖11)。由此可見根部對(duì)高鹽脅迫反應(yīng)更敏感；在PEG干旱脅迫下，毛果楊根和莖部PtrIDP1基因在所有時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，其中根部在6 h時(shí)表達(dá)量最低，僅為對(duì)照的0.2倍，而莖部在12 h表達(dá)量最低，僅為對(duì)照的0.06倍；而在葉中該基因在脅迫12 h以內(nèi)的表達(dá)量與對(duì)照基本持平，在24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，是對(duì)照的1.4倍，然后呈逐漸降低的趨勢(shì)(見圖12)，可見在干旱脅迫時(shí)葉片的脅迫響應(yīng)更敏感。

3 討論

干旱、高鹽、低溫、高溫等極端條件，是植物生長(zhǎng)過程中所面臨的主要逆境因素[18～19]。在逆境條件下，許多植物中所特有的IDPs對(duì)抵抗逆境脅迫發(fā)揮了重要作用[8～11]。本研究從毛果楊中克隆得到了PtrIDP1基因，選取了胡楊等13種植物的基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示：毛果楊PtrIDP1與胡楊氨基酸相似性最高。

PtrIDP1是植物中特有的固有無序蛋白質(zhì)，在擬南芥中被稱為At1G13930，At1G13930具有一定的組織特異性，在根尖、花藥、柱頭組織不表達(dá)，在生長(zhǎng)點(diǎn)表達(dá)量較高，在葉中定位在保衛(wèi)細(xì)胞中，逆境脅迫下At1G13930參與氣孔的發(fā)育及調(diào)節(jié)[11]。本研究中PtrIDP1基因的亞細(xì)胞定位觀察顯示，該基因定位在洋蔥表皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。通過RT-PCR對(duì)PtrIDP1基因在毛果楊不同組織部位的表達(dá)特異性進(jìn)行了全面分析，結(jié)果表明，PtrIDP1在毛果楊根、莖、葉中都有表達(dá)，其中，在葉和莖中表達(dá)量相對(duì)較高，在根中表達(dá)量相對(duì)較低。該基因在葉片中高度表達(dá)，揭示PtrIDP1基因可能與葉片的光合作用或者氣孔的發(fā)育及調(diào)節(jié)相關(guān)，在莖段中高度表達(dá)，預(yù)示PtrIDP1可能與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。

PtrIDP1基因不僅具有組織特異性，而且能夠被逆境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。例如，擬南芥在逆境脅迫下，發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的蛋白與低溫、高溫及高鹽等非生物脅迫相關(guān)[10～11]。Rocco等利用低溫4℃和高溫42℃對(duì)擬南芥進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的蛋白在低溫和高溫處理時(shí)，與其他蛋白點(diǎn)比較變化最大，暗示該基因在溫度脅迫中可能起著至關(guān)重要的作用[14]。在本研究中，毛果楊在NaCl(高鹽)和PEG(干旱)脅迫下，PtrIDP1基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)有所不同。在NaCl脅迫下，毛果楊根中的表達(dá)量明顯上調(diào)，脅迫6 h時(shí)是對(duì)照的2.4倍，而在莖中是明顯下調(diào)表達(dá)，在葉中24 h之前的表達(dá)量變化不顯著，這說明毛果楊根部對(duì)鹽脅迫更敏感，莖中通過該基因的下調(diào)表達(dá)來應(yīng)對(duì)鹽脅迫，葉組織在脅迫48 h之后才做出鹽脅迫應(yīng)答；在PEG脅迫下，毛果楊根和莖部在所有時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，根部在6 h時(shí)表達(dá)量最低，是對(duì)照的0.2倍，而莖部在12 h表達(dá)量最低，是對(duì)照的0.06倍；而在葉中的表達(dá)量與對(duì)照基本持平，在24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，是對(duì)照的1.4倍，可見葉片對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)更快。初步分析認(rèn)為，毛果楊PtrIDP1基因的表達(dá)可能參與鹽脅迫和干旱脅迫的應(yīng)答。PtrIDP1基因在響應(yīng)高鹽和干旱脅迫過程中的調(diào)控途徑及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步分析和驗(yàn)證。