小黑楊PsnHB13基因在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化與功能分析

肖 迪 劉 軼 李開(kāi)隆 鄭 密 曲冠證

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

同源異型域——亮氨酸拉鏈(HD-Zip)蛋白是植物界所特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，具有結(jié)合特異DNA的活性及調(diào)控其轉(zhuǎn)錄的能力。研究證實(shí)HD-Zip蛋白經(jīng)由亮氨酸拉鏈形成二聚體，這個(gè)二聚體是DNA結(jié)合的先決條件，而且該蛋白參與到植物特異性生物過(guò)程如光合作用、形態(tài)建成等中，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中扮演重要角色[1]。

目前，在一些植物中已經(jīng)開(kāi)展了全基因組范圍內(nèi)的HD-Zip基因家族的鑒定，如擬南芥中鑒定出48個(gè)HD-Zip基因[2]，水稻33個(gè)[3]，玉米55個(gè)[4]，毛果楊63個(gè)[5]，小麥46個(gè)[6]，棉花61個(gè)[7]。可根據(jù)HD-Zip基因家族編碼基因的內(nèi)含外顯模式、含有除HD-Zip外的其他保守結(jié)構(gòu)域、基因所參與的代謝途徑等將HD-Zip分為Ⅰ～Ⅳ四個(gè)亞家族[8]。不同亞家族的基因含有的結(jié)構(gòu)域及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)均有差異，導(dǎo)致HD-Zip家族基因參與植物不同的發(fā)育過(guò)程。其中HB13是HD-ZipⅠ亞家族的成員之一，結(jié)合生物信息學(xué)分析與已有的實(shí)驗(yàn)研究[9]，提出了該亞家族蛋白的結(jié)構(gòu)模型：HD-Zip結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合DNA與二聚體化，AHA結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)激活轉(zhuǎn)錄，CTR和NTR區(qū)域通過(guò)控制磷酸化與泛素化對(duì)轉(zhuǎn)錄激活功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。同時(shí)該亞家族已被鑒定在光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物脅迫、葉片發(fā)育等方面發(fā)揮重要的作用[10～11]。AtHB13高水平表達(dá)可阻止表皮細(xì)胞橫向擴(kuò)張，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥子葉及葉片的發(fā)育改變，即轉(zhuǎn)基因植株中子葉和葉片變得更窄，葉子和葉柄間的連接處不明顯等[1]。此外有研究表示，ATHB13在調(diào)節(jié)糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中也發(fā)揮著作用[4]。HB13基因在不同植物之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制具有保守性[12]，這也為我們?cè)跓煵葜锌焖傺芯吭摶虻墓δ芴峁┝擞辛Φ睦碚撘罁?jù)。

楊樹(shù)被作為木本轉(zhuǎn)基因植物中的模式植物，是目前林木樹(shù)種遺傳轉(zhuǎn)化研究中的典型代表種。小黑楊(Populussimonii×Populusnigra)是中國(guó)林業(yè)科學(xué)院于1959年經(jīng)小葉楊和黑楊雜交而來(lái)[13]。目前，有關(guān)楊樹(shù)HB13基因的功能驗(yàn)證研究鮮有報(bào)道。以小黑楊為材料，參考轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)克隆PsnHB13基因，通過(guò)構(gòu)建植物表達(dá)載體并利用農(nóng)桿菌侵染煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草。發(fā)現(xiàn)楊樹(shù)PsnHB13基因能夠?qū)е聼煵萑~片、根系和花器官等形態(tài)發(fā)生變化。為進(jìn)一步開(kāi)展楊樹(shù)HB13基因的生理功能研究奠定基礎(chǔ)，為楊樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)理的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑

楊樹(shù)葉片采自東北林業(yè)大學(xué)校園多年生的小黑楊雄株；普通煙草(NicotianatabacumL.)由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌菌株GV3101購(gòu)自上海唯地公司。質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒，購(gòu)自博日公司；植物表達(dá)載體pROKⅡ質(zhì)粒，由山東師范大學(xué)張慧教授惠贈(zèng)；pEasy-T1載體、EasyPure Plant購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR相關(guān)試劑、DNA Marker、限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ，DNA Ligation Kit Ver.2.1，TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，PrimeScripTMRT reagent Kit，DNA Fragment Purification Kit，SYBR Premix ExTaqTMⅡ均購(gòu)自TaKaRa公司(大連)；所用引物合成、測(cè)序服務(wù)由博仕生物技術(shù)有限公司完成(哈爾濱)；其他實(shí)驗(yàn)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 目的基因的克隆

參照TaKaRa公司RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取小黑楊葉片的總RNA。利用Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度，取0.5 μg RNA為材料，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)小黑楊PsnHB13基因特異性引物擴(kuò)增目的片段，所用引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為模板2 μL，引物PsnHB13-XbaⅠ-F 1 μL、PsnHB13-KpnⅠ-R 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、ExTaq0.25 μL、dNTP 2 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL，反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。反應(yīng)結(jié)束后取25 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，選取條帶大小正確的進(jìn)行膠回收。

2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

用限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ對(duì)膠回收的目的條帶和pROKⅡ質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)。純化酶切產(chǎn)物并用DNA Ligation Kit進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有卡那霉素的LB平板培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)16 h。挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，并將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送測(cè)序。選擇測(cè)序成功的菌液保存并提取質(zhì)粒，利用液氮凍融法將pROKⅡ-PsnHB13質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增引物pROKⅡ-F和PsnHB13-KpnⅠ-R序列見(jiàn)表1。

2.3 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測(cè)

參照本實(shí)驗(yàn)室的煙草轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行植物的遺傳轉(zhuǎn)化[14～17]。步驟包括：菌液的制備、侵染、共培養(yǎng)、脫菌和分化及生根培養(yǎng)等5部分組成。制備OD600=0.2～0.3的菌液，用菌液侵染切割成1 cm×1 cm大小的煙草葉片，共培養(yǎng)2 d后，在含有40 mg·L-1卡那霉素、400 mg·L-1頭孢霉素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)約21 d后將抗性芽進(jìn)行抽莖生長(zhǎng)，最后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。利用CTAB法提取抗性苗葉片DNA，利用引物pROKⅡ-F，PsnHB13-KpnⅠ-R進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所用的引物

注：下劃線:限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)

Note:Underline:Locus of restriction enzyme

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PsnHB13基因表達(dá)量

利用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取生長(zhǎng)30 d的不同轉(zhuǎn)基因株系及野生型煙草幼苗葉片總RNA。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，利用定量引物PsnHB13-RT-F和PsnHB13-RT-R(表1)，參考SYBR Premix ExTaqTMⅡ反應(yīng)體系，以Ntactin基因?yàn)閮?nèi)參基因，進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。利用2-ΔΔCt法分析定量數(shù)據(jù)，計(jì)算不同株系中PsnHB13基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 過(guò)表達(dá)PsnHB13煙草植株的表型觀察

挑選表達(dá)量較高3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及野生型株系移栽到10×12營(yíng)養(yǎng)缽中。培養(yǎng)溫度26℃，長(zhǎng)日照培養(yǎng)，光照時(shí)間18 h。培養(yǎng)30 d后，分別選取5株各轉(zhuǎn)基因株系及野生型煙草的第七片葉片(從上到下數(shù))，拍照后使用Image J軟件計(jì)算葉面積。利用游標(biāo)卡尺測(cè)量葉片的最長(zhǎng)長(zhǎng)度與寬度，計(jì)算長(zhǎng)寬比。使用普通光學(xué)顯微鏡對(duì)葉片下表皮細(xì)胞顯微觀察，拍照后測(cè)量單位面積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量，使用Image J軟件計(jì)算細(xì)胞平均面積。轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草在移栽60 d左右均開(kāi)始開(kāi)花，7 d后進(jìn)入盛花期，觀察轉(zhuǎn)基因煙草株系與野生型煙草株系同期開(kāi)放的花朵。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組得到的PsnHB13基因序列，在TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org)進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與AtHB13基因相似度較高，其在TAIR網(wǎng)站的命名為AT1G69780。而AtHB13基因是擬南芥植株幼苗根系生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控因子，可能抑制根系生長(zhǎng)。所以為探究PsnHB13是否同樣具有該功能則連續(xù)篩選4代轉(zhuǎn)基因煙草種子，獲得純合轉(zhuǎn)基因煙草。點(diǎn)種到MS基本培養(yǎng)基中(MS+20 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂，pH5.8)。每7 d測(cè)量1次轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草根長(zhǎng)，連續(xù)測(cè)量5次并記錄。

3 結(jié)果與分析

3.1 小黑楊PsnHB13基因的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

PsnHB13基因的cDNA長(zhǎng)度為870 bp，共編碼289個(gè)氨基酸(圖1)。該基因編碼蛋白的分子量為32.99 kDa，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為5.94。利用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取小黑楊葉片的總RNA(見(jiàn)圖2A)。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板克隆PsnHB13基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在900 bp左右處有亮帶，條帶位置大小正確(見(jiàn)圖2B)。PCR產(chǎn)物連接pEasy-T1載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)后挑取6個(gè)單克隆PCR檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示均為陽(yáng)性單克隆，且條帶大小正確。選取3個(gè)陽(yáng)性單克隆測(cè)序，測(cè)序引物為pROKⅡ-F/R。限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ同時(shí)酶切pEasy-T1-HB13質(zhì)粒和pROKⅡ質(zhì)粒，膠回收純化基因片段酶切產(chǎn)物(見(jiàn)圖2C)，使用DNA Fragment Purification Kit試劑盒純化pROKⅡ質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。用DNA Ligation Kit連接純化后的基因片段與載體，重組載體暫命名為pROKⅡ-PsnHB13。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑取8個(gè)單克隆經(jīng)pROKⅡ-F/PsnHB13-KpnⅠ-R引物PCR驗(yàn)證，電泳結(jié)果均為陽(yáng)性單克隆，且條帶大小正確(見(jiàn)圖2D)。提取1#菌液質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測(cè)(XbaⅠ和KpnⅠ)，電泳后在約900 bp處有亮帶，證明成功將PsnHB13基因構(gòu)建到pROKⅡ載體。并將質(zhì)粒送公司測(cè)序檢測(cè)。測(cè)序結(jié)果表明，PsnHB13基因已經(jīng)重組到pROKⅡ載體上，且沒(méi)有堿基序列突變，pROKⅡ-PsnHB13載體構(gòu)建成功。

圖2 植物表達(dá)載體pROKⅡ-PsnHB13的構(gòu)建 A.小黑楊葉片總RNA(1～2.小黑楊葉片總RNA)；B.PsnHB13基因的克隆電泳圖(1～3.PsnHB13基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，4.ddH2O作為陰性對(duì)照)；C.植物表達(dá)載體pEasy-T1-PsnHB13的雙酶切電泳圖(1～3.重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物)；D.農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測(cè)電泳圖(1～8.不同農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子單克隆，9.ddH2O作為陰性對(duì)照)；M：DL5000 DNA markerFig.2 The construction of pROKⅡ-PsnHB13 vector A.The total RNA of leaves of Populus simonii×P.nigra; B.The cloning of PsnHB13 gene(1-3.PCR product of PsnHB13 gene; 4.ddH2O as a negative control); C.The double digestion result of plant expression vector pEasy-T1-PsnHB13(1-3.Double digestion of recombinant plasmids); D.PCR detection of Agrobacterium-mediated transformation(1-8.PCR products of transformants in agrobacterium; 9.ddH2O as a negative control); M.DL5000 DNA marker

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及PsnHB13基因在煙草中的相對(duì)表達(dá)量 A.轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)(M.DL5000 DNA marker，1.陽(yáng)性對(duì)照，2～14. 13個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系，15.野生型植株，16. ddH2O作為陰性對(duì)照)；B.轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測(cè)(L1～L13.轉(zhuǎn)基因煙草植株)；C.移栽至土中的轉(zhuǎn)基因植株(CK.野生型植株，L6、L1、L7.不同株系轉(zhuǎn)基因煙草)Fig.3 Acquirement of transgenic tobacco and relative expression level of AtPAP1 gene in tobacco A.Detection of different transgenic tobaccos by PCR(M. DL5000 DNA marker; 1. Positive control; 2-14. Different lines, 15. Wild type; 16. ddH2O as a negative control); B.The qRT-PCR detection of transgenic plants(L1-L13.Transgenic tobacco plants of PsnHB13); C.The mature plant in soil(CK.Wild-type plant; L6,L1,L7.The transgenic plant with target gene)

3.2 pROKⅡ-PsnHB13載體在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化與分子檢測(cè)

采用葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法，將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染煙草葉片，經(jīng)過(guò)4～5周的篩選培養(yǎng)，葉片周?chē)挠鷤M織分化出抗性芽。將抗性芽分離后，放在含有卡那抗生素的分化培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，得到大量叢生芽，待叢生芽抽莖后移栽至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。提取煙草生根苗幼葉DNA，PCR檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，共得到13個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(見(jiàn)圖3A)。

為了研究小黑楊PsnHB13基因在煙草植株中的表達(dá)情況，提取組培煙草生根苗幼葉總RNA，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)(見(jiàn)圖3B)。結(jié)果顯示，小黑楊PsnHB13基因轉(zhuǎn)化到煙草植株中均有表達(dá)，以表達(dá)量最低的煙草轉(zhuǎn)基因株系L13中PsnHB13基因表達(dá)量為參考，相對(duì)表達(dá)量最高的株系是L6、L1、L7，這3個(gè)株系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的觀察分析(見(jiàn)圖3C)。

3.3 過(guò)表達(dá)PsnHB13煙草植株的葉片長(zhǎng)寬比分析

將表達(dá)量較高的3個(gè)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株移栽到土壤，14 d后觀察葉片形態(tài)變化。在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期對(duì)煙草成熟葉片進(jìn)行測(cè)量、統(tǒng)計(jì)并利用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析。發(fā)現(xiàn)與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草隨著PsnHB13表達(dá)量升高葉片長(zhǎng)寬比明顯增加，葉片變小。單位面積(149 μm×149 μm)內(nèi)細(xì)胞數(shù)顯著降低，細(xì)胞面積增大。與野生型煙草葉片相比，3個(gè)高表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片均顯著變小(見(jiàn)圖4A)。測(cè)量葉片最長(zhǎng)長(zhǎng)度與寬度，計(jì)算長(zhǎng)寬比(見(jiàn)圖4B)，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)PsnHB13基因的煙草葉片葉型出現(xiàn)變化，與野生型相比，長(zhǎng)寬比增加近1.8倍，葉片細(xì)長(zhǎng)。對(duì)3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系及野生型株系的葉片面積與成熟葉片下表皮細(xì)胞顯微觀察并測(cè)量，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析，發(fā)現(xiàn)與野生型煙草植株相比，轉(zhuǎn)基因煙草成熟葉片細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少，雖然轉(zhuǎn)基因植株下表皮葉片細(xì)胞面積略有增加但未達(dá)到顯著差異(見(jiàn)圖4:C～D)。推測(cè)是由于PsnHB13過(guò)表達(dá)影響葉片細(xì)胞增殖數(shù)量，細(xì)胞數(shù)量降低，造成葉片變小。PsnHB13基因表達(dá)量最高的株系L7，葉片變小程度最大，出現(xiàn)小葉表型。

圖4 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片形態(tài)學(xué)觀察與分析 A.煙草葉片面積比較；B.葉片長(zhǎng)寬比的比較；C.煙草葉片的細(xì)胞數(shù)比較；D.煙草葉片的細(xì)胞面積比較；CK.野生型植株；L6,L1,L7.轉(zhuǎn)基因煙草株系Fig.4 Microscope observation and analysis of wild type and transgenic tobacco A.Comparison of the leaf area; B.Comparison of the length-width ratio; C.Comparison of the total cell number; D.Comparison of the cell area; CK.Wild type; L6,L1,L7.Individual transgenic plant

圖5 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草幼苗根系長(zhǎng)度的形態(tài)學(xué)觀察與分析 A.煙草早期幼苗根系長(zhǎng)度的連續(xù)觀察；B.第六周的煙草早期幼苗根系長(zhǎng)度觀察；CK.野生型植株；L1,L7.轉(zhuǎn)基因煙草株系Fig.5 Microscope observation and analysis of wild type and transgenic tobacco A.Continuous observation of the the length of seedling roots; B.Observation of the length of seedling roots at the sixth week; CK.Wild type; L1,L7.Individual transgenic plant

3.4 過(guò)表達(dá)PsnHB13煙草植株的幼苗根系長(zhǎng)度分析

通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草幼苗時(shí)期根系長(zhǎng)度連續(xù)測(cè)量、統(tǒng)計(jì)并利用SPSS19.0軟件進(jìn)行差異分析。發(fā)現(xiàn)與野生型煙草植株相比，轉(zhuǎn)基因煙草根系生長(zhǎng)緩慢。轉(zhuǎn)基因煙草根系長(zhǎng)度在第一周測(cè)量時(shí)與野生型已經(jīng)開(kāi)始發(fā)生差異，持續(xù)到第6周，差異逐漸增大(見(jiàn)圖5A)。轉(zhuǎn)基因煙草株系幼苗根系明顯短于野生型，生長(zhǎng)到第6周時(shí)根系長(zhǎng)度僅為野生型的1/3左右(見(jiàn)圖5B)。可以發(fā)現(xiàn)PsnHB13基因的過(guò)量表達(dá)能夠抑制煙草幼苗根系的生長(zhǎng)發(fā)育。

3.5 過(guò)表達(dá)PsnHB13煙草植株花的觀察

當(dāng)轉(zhuǎn)基因煙草處于生殖生長(zhǎng)期時(shí)，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PsnHB13基因煙草的花出現(xiàn)表型差異。即與野生型相比，高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株花朵整體上均呈現(xiàn)顯著變小的差異變化，而且雌蕊較雄蕊生長(zhǎng)快(見(jiàn)圖6:A～C)，PsnHB13基因高表達(dá)煙草無(wú)法自花授粉，出現(xiàn)敗育現(xiàn)象。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，HB13基因具有一些保守結(jié)構(gòu)域，如HD-Zip結(jié)構(gòu)域、CTR區(qū)、NTR區(qū)等。其中HD-Zip結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)結(jié)合DNA二聚體化，CTR和NTR區(qū)域通過(guò)控制磷酸化與泛素化對(duì)轉(zhuǎn)錄激活功能進(jìn)行調(diào)節(jié)[10]。其中，關(guān)于CTR上AHA結(jié)構(gòu)域的研究比較深入，AHA結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)激活轉(zhuǎn)錄，該結(jié)構(gòu)域會(huì)形成一個(gè)帶負(fù)電荷的兩性分子，通過(guò)改變蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)使其接觸基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物[18]。另外在大麥和豌豆中的研究顯示，HB13蛋白的CTR端的保守結(jié)構(gòu)可以增加基因與植物同源域DNA的結(jié)合親和力、影響植物的發(fā)育以及育性[19～21]。以往對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的研究多集中在其核心結(jié)構(gòu)域，但越來(lái)越多的研究顯示，其他功能未知的結(jié)構(gòu)可能對(duì)蛋白行使功能具有更直接的調(diào)節(jié)作用，需要更深入的研究探討。

煙草以其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、相似性高、生長(zhǎng)周期短等特點(diǎn)作為模式植物之一，可以彌補(bǔ)楊樹(shù)生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)這一主要因素，從而可以在短時(shí)間內(nèi)較為真實(shí)地驗(yàn)證基因的生理生化功能。本實(shí)驗(yàn)在煙草中異源表達(dá)小黑楊PsnHB13基因初步探究基因功能。與野生型相比，過(guò)量表達(dá)PsnHB13的轉(zhuǎn)基因煙草的葉片長(zhǎng)寬比明顯增加，葉片變小，早期幼苗根系明顯變短，植株花朵整體上變小。這可以為推測(cè)該基因在楊樹(shù)中的功能提供一定的參考，該基因可能對(duì)楊樹(shù)的葉型，葉片大小以及根系長(zhǎng)度等方面產(chǎn)生影響。

植物葉片是光合作用的主要器官之一，葉片性狀特征變化將直接影響到植物的基本行為及生態(tài)功能的發(fā)揮[22]。近年來(lái)，關(guān)于葉片性狀的研究已逐漸成為植物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)[23]。研究表明，植物單位質(zhì)量的葉面積越大，生產(chǎn)力就會(huì)越高[24]。而根系是植物的主要吸收器官，植物依靠根系從土壤中吸收水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[25～26]。能否通過(guò)在楊樹(shù)中敲除或過(guò)表達(dá)一些基因，使樹(shù)木在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中葉片變大，根系生長(zhǎng)加快，提高生產(chǎn)力促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)從而縮短楊樹(shù)育種周期是個(gè)亟待解決的問(wèn)題。HB13作為一個(gè)生長(zhǎng)負(fù)調(diào)控因子，在楊樹(shù)中敲除該基因，以期獲得具有優(yōu)良性狀的優(yōu)勢(shì)樹(shù)種。然而，PsnHB13基因是否是小黑楊生長(zhǎng)發(fā)育的決定性基因以及通過(guò)怎樣的方式調(diào)控楊樹(shù)營(yíng)養(yǎng)器官與生殖器官的發(fā)育以及形態(tài)變化仍需進(jìn)一步深入的探究，挖掘其潛在的學(xué)術(shù)與應(yīng)用價(jià)值。